专利名称：一种基因改组的方法及所获得的重组基因和编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因指导进化的方法，具体的说是一种基因改组方法及其应用，是一种特别适用于同源性较低的基因间改组的方法。
背景技术：
指导进化就是在实验室中人为创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制(如突变、重组)，并定向选择出所需性质的蛋白分子而不需要了解蛋白质的空间结构和功能。目前这一机制已经被广泛的应用于蛋白质药物，农业，化学工业，生物工程等领域(Patten，P.A.，Howard，R.J.&Stemmer，W.P.C.Applications of DNA shuffling to pharmaceuticals and vaccines.Curr Opin Biotechnol.1997，8724-733)特别是被应用于提高酶的活性(Crameri，A.，Raillard，S-A.，Bermudez，E.&Stemmer，W.P.C.DNAshuffling of a family of genes from diverse species acceleratesdirected evolution.Nature.1998，391，288-291.)稳定性(Oh，K.H.，Nam，S.H.&Kim，H.S.Improvement of Oxidative and Thermostabilityof N-Carbamyl-D-Amino Acid Amidohydrolase by Directed Evolution.Protein Eng.2002，15，689-695.)，和表达水平(Bulter，T.et.al.Functional expression of a fungal laccase in Saccharomycescerevisiae by directed evolution.Appl.Environ.Microbiol.2003，69，987-995.)。随着各种新型突变技术和新型的检测系统的出现，对于指导进化的研究将向纵深发展。从某种程度上讲，定向进化的基本策略与自然进化十分相似，两个关键的步骤就是通过随机诱变和体外重组产生分子多样性并通过定向筛选或选择得到优化的突变体。目前已经有很多种基因体外改组方法被提出并成功的应用，其中第一个也是最经典的是DNAshuffling技术(Stemmer，W.P.C.Rapid evolution of a protein in vitroby DNA shuffling.Nature 1994，370，389-391.)，该技术是由美国Stemmer于1994年提出的，它是对一组基因群体(进化上相关的DNA序列或曾筛选出的性能改进序列)进行改组，创造出新基因的方法。这种方法产生的多样性文库，可以有效积累有益突变，排除有害突变和中性突变，同时也可实现目的蛋白多种特性的共进化。但是当同源性低于70％的序列用该方法进行基因改组时，产物往往严重倾向于形成父母链的重新聚合链。尽管此后一些依赖于序列同源性的重组方法(Ostermeier，M.，Shim，J.H.&Benkovic，S.J.A combinatorial approach to hybridenzymes independent of DNAhomology.Nat.Biotechnol.1999，17，1205-1209.；Zhao，H.，Giver，L.，Shao，Z.&Arnold，F.H.Molecular evolution by staggeredextension process(StEP)in vitro recombination.Nat.Biotechnol.1998，16，258-261.；Jon，E.et al.Synthetic shuffling expandsfunctional protein diversity by allowing amino acids to recombineindependently.Nat.Biotechnol.2002，20，1251-1255.)被提出，但是都不能从根本上解决这一问题。
发明内容
本发明的目的是提出一种新的基因改组方法，即分隔-混合法(separating-mixing，简称SeMi)，有效的减少了改组过程对序列同源性的依赖；并提供运用该方法产生了改组基因和活性提高的改组蛋白。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为本发明利用了来自一个基因的单链DNA经过酶切的片段通过其3’端与另一个基因的同源性及5’端与自身基因的同一性的特征，先将反应分成两组，每一组先经过预重组，再将两组反应物混合，经过一系列PCR反应步骤，经过一轮反应实现基因间的改组；具体为，1)选取两种线性双链基因A和B，基因的末端分别带有能产生切口为不同粘性凸出末端的内切酶识别序列(如BglII和PstI等)，分别用ExoIII消化产生方向相反的两组单链DNA---A’和B’；2)经消化后，分别取其中部分，用DNaseI消化成小片段A”和B”，并进行纯化；3)将A’和B”及A”和B’分别混合，形成两个反应体系I和II，然后进行单向PCR；随后，在I体系中加入对应A’的5’端的反向引物，在II体系中加入对应B’的5’端的反向引物，分别反向扩增；4)将上述两个体系混合，经套叠PCR扩增出全长片段；选择目的大小的重组基因，进行筛选和表达。
本发明首先分别以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和大肠杆菌(Escherichia coli)总DNA为模板，扩增分别带有EcoRI和NotI的metk(见图1)和sam2(见图2)基因，将两个分别克隆到pSE380相应的酶切位点。以重组质粒位模板，扩增分别带有BglII和PstI酶切位点并具有一段载体序列的sam2和metk基因，即上述两种线性双链基因A和B，其分别具有序列表SEQ ID No1中的核苷酸序列和序列表SEQ ID No2中的核苷酸序列；以上述两基因为初始基因，经以下步骤实现基因间的改组1)对以上两基因进行BglII和PstI双酶切，并对酶切后的片段进行纯化；2)用ExoIII消化(单向酶切)上述片段，以获得单链DNA(ssDNA)并加以纯化；3)分别取两基因的50％总量的单链DNA基因用DNaseI进行酶切，得到小片段用80％乙醇沉淀，回收；4)反应分为两组，在每一组中将来自一个基因的单链DNA片段与来自另一基因的全长单链DNA混合，并以全长单链DNA为模板，通过片段3’端的序列同源性，在taq DNA聚合酶作用下单向扩增至模板5’端；5)加入单向引物，通过不对称PCR扩增杂合片段的互补单链，在此过程中通过短暂的复性/延伸实现交错延伸；6)将两组反应物混合，方向相反的互补片段间将会以交错延伸的方式形成全长双链，并在PCR过程中实现扩增；7)将重组基因连入表达载体并转入酿酒酵母，通过筛选，得到抗乙硫氨酸的工程菌株，通过腺苷蛋氨酸含量的测定，分离得到含量提高的菌株及其所包含的重组基因。所获得的重组基因及其编码蛋白，具有序列表SEQID No3中的核苷酸序列及序列表SEQ ID No4中的氨基酸序列。
本发明具有以下优点1.本发明通过独特的分组反应过程提供了一个新的基因改组方法，该方法特别适用于同源性较低的基因间的改组；2.使用本发明进行基因改组，仅通过一轮反应即可获得改组基因；3.使用本发明获得的改组基因是一种新的重组基因，核酸序列来源于两个原始基因，并具有多点重组特征，该基因可以在大肠杆菌中高效表达；4.使用本发明所获得的重组蛋白(能催化腺苷蛋氨酸)分别来源于两种初始酶；并且具有两个氨基酸突变133Ala→Thr，354Glu→Asp，具有腺苷蛋氨酸合成酶活性，并且活力优于起始酶，具有更高的活性；5.引用本发明，可进一步提供直接用于生产重组酶的工程菌株。
图1为扩增metk的琼脂糖凝胶电泳图；Lane MDNA marker DL2000；Lane1大肠杆菌基因组DNA；Lane2metk。
图2为扩增sam2的琼脂糖凝胶电泳图；Lane MDNA marker DL2000；Lane1酿酒酵母基因组DNA；Lane2sam2。
图3为本发明反应过程的示意图；新的基因改组方法分隔-混合法；反应过程为1.两种不同来源的DNA(白色的条形柱代表metk，黑色的条形柱代表sam2)分别用BglII和PstI双酶切；2.上述片段分别用ExoIII单向酶切获得单链DNA；3.部分单链DNA用DNaseI进行消化；4.通过无引物PCR单向扩增；5.通过有引物PCR获得互补的单链DNA；6.混合两组反应产物并扩增全长DNA；7.将重组基因克隆入载体并进行筛选和选择。
图4为改组过程的琼脂糖凝胶电泳图；Lane MDNA marker DL2000；Lane1metk；Lane2sam2；Lane3单链的metk；Lane4单链的sam2；Lane5经DNaseI消化的单链metk；Lane6经DNaseI消化的单链sam2；Lane7改组DNA；Lane8特异性延伸目的大小的改组DNA。
图5为改组基因Ks09在酿酒酵母中表达的蛋白电泳图；M为中分子量蛋白质Marker；Lane1-4分别代表包含有不同质粒的酿酒酵母的诱导表达蛋白Lane1包含有pYES2；Lane2包含有pYES2+metk；Lane3包含有pYES2+sam2；Lane4包含有pYES2+Ks09(改组基因)。
图6为检测重组酶诱导表达菌株腺苷蛋氨酸合成的HPLC图(HPLC检测腺苷蛋氨酸的胞内积累量)；a，b，c，d分别代表包含有不同质粒的酿酒酵母经诱导表达和抽提后的产物，其中a包含有pYES2，b包含有pYES2+metk，c包含有pYES2+sam2，d包含有pYES2+Ks09(改组基因)；e为腺苷蛋氨酸标准样。
图7为改组基因Ks09的测序图谱。
具体实施例方式
实施例1一种来源于大肠杆菌JM109菌株的编码腺苷蛋氨酸合成酶(2.5.1.6)的基因metk，具有序列表SEQ ID No1中的碱基序列。
SEQ ID No1ATGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCGTCTCTGAAGGGCATCCTGACAAAATTGCTGACCAAATTTCTGATGCCGTTTTAGACGCGATCCTCGAACAGGATCCGAAAGCACGCGTTGCTTGCGAAACCTACGTAAAAACCGGCATGGTTTTAGTTGGCGGCGAAATCACCACCAGCGCCTGGGTAGACATCGAAGAGATCACCCGTAACACCGTTCGCGAAATTGGCTATGTGCATTCCGACATGGGCTTTGACGCTAACTCCTGTGCGGTTCTGAGCGCTATCGGCAAACAGTCTCCTGACATCAACCAGGGCGTTGACCGTGCCGATCCGCTGGAACAGGGCGCGGGTGACCAGGGTCTGATGTTTGGCTACGCAACTAATGAAACCGACGTGCTGATGCCAGCACCTATCACCTATGCACACCGTCTGGTACAGCGTCAGGCTGAAGTGCGTAAAAACGGCACTCTGCCGTGGCTGCGCCCGGACGCGAAAAGCCAGGTGACTTTTCAGTATGACGACGGCAAAATCGTTGGTATCGATGCTGTCGTGCTTTCCACTCAGCACTCTGAAGAGATCGACCAGAAATCGCTGCAAGAAGCGGTAATGGAAGAGATCATCAAGCCAATTCTGCCCGCTGAATGGCTGACTTCTGCCACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTCGTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATACCTACGGCGGCATGGCGCGTCACGGTGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCAGCCTACGCAGCACGTTATGTCGCGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCTGGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCGTGGCTGAACCGACCTCCATCATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAACAACTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTTCGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTCAGATGCTGGATCTGCTGCACCCGATCTACAAAGAAACCGCAGCATACGGTCACTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAAACCGACAAAGCGCAGCTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAGTAA(1)SEQ ID No1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度1155碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA
(c)假设否(d)反义否(e)最初来源大肠杆菌(E.coli.)JM109菌株的编码腺苷蛋氨酸合成酶(2.5.1.6)的metk基因(2)来源于大肠杆菌(E.Coli.)JM109菌株的编码腺苷蛋氨酸合成酶(2.5.1.6)的metk基因的制备正向引物5’-ACCGAATTCATGGCAAAACACCTTTTTACGTCC-3’；反向引物5’-TACGCGGCCGCTTACTTCAGACCGGCAGCATCG-3’；下划线序列分别为EcoRI和NotI酶切位点。
扩增条件以大肠杆菌JM109菌株总DNA为模板，以pfu DNA聚合酶进行扩增。
反应体系2.5U的pfu DNA聚合酶、1×pfu buffer、200μmol L-1dNTP、1mmol L-1各引物、100ng的DNA模板，总反应体积100μl；反应条件94℃变性2min；30个循环的94℃30s，64.2℃30s，72℃3min；72℃延伸10min。PCR产物回收按上海华舜试剂盒使用说明书。目的产物见琼脂糖凝胶电泳(图1)。将目的基因经EcooRI和NotI酶切后克隆入pSE380载体的相应酶切位点，构建pSE380-metk重组质粒。
实施例2一种来源于酿酒酵母INVScI菌株的编码腺苷蛋氨酸合成酶(2.5.1.6)的基因sam2，具有序列表SEQ ID No2中碱基序列。
SEQ ID No2ATGTCCAAGAGCAAAACTTTCTTATTTACCTCTGAATCCGTCGGTGAAGGTCACCCAGACAAGATTTGTGACCAAGTTTCTGATGCTATTTTGGACGCTTGTTTAGAACAAGATCCATTCTCCAAGGTTGCCTGTGAAACAGCTGCCAAAACTGGTATGATTATGGTTTTCGGTGAAATTACCACCAAAGCTAGACTTGACTACCAACAAATAGTAAGAGATACCATCAAGAAGATTGGTTATGACGATTCTGCCAAGGGTTTCGACTACAAGACATGTAATGTTTTAGTAGCTATCGAACAACAATCTCCAGATATCGCTCAAGGTCTGCACTATGAAAAGAGCTTAGAAGACTTAGGTGCTGGTGACCAAGGTATAATGTTTGGTTACGCTACAGACGAAACTCCAGAAGGGTTACCATTGACCATTCTTTTGGCTCACAAATTGAACATGGCTATGGCAGATGCTAGAAGAGATGGTTCTCTCCCATGGTTGAGACCAGACACAAAGACTCAAGTCACTGTCGAATACGAAGACGACAATGGTAGATGGGTTCCAAAGAGGATAGATACCGTTGTTATTTCTGCTCAACATGCTGATGAAATTTCCACCGCTGACTTGAGAACTCAACTTCAAAAAGATATTGTTGAAAAGGTCATACCAAAGGATATGTTAGACGAAAATACCAAATATTTCATCCAACCATCCGGTAGATTCGTCATCGGTGGTCCTCAAGGTGACGCTGGTTTGACCGGTAGAAAGATTATTGTCGACGCTTACGGTGGTGCCTCATCCGTCGGTGGTGGTGCCTTCTCCGGTAAGGACTATTCCAAGGTCGATCGTTCCGCTGCTTACGCTGCTAGATGGGTTGCCAAGTCTCTAGTTGCCGCTGGTTTGTGTAAGAGAGTCCAAGTCCAATTTTCATATGCTATTGGTATTGCTGAACCATTGTCTTTACATGTGGACACCTATGGTACAGCTACAAAATCAGATGACGAAATCATTGAAATTATTAAGAAGAACTTCGACTTGAGACCAGGTGTGTTAGTAAAGGAATTAG
ATTTGGCTAGACCAATTTACTTACCAACCGCTTCTTATGGTCACTTCACTAATCAAGAGTACTCATGGGAAAAACCAAAGAAATTGGAATTTTAA(1)SEQ ID No2的信息(参见序列表)(A)序列特征*长度1155碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源酿酒酵母INVScI菌株的编码腺苷蛋氨酸合成酶(2.5.1.6)的基因sam2。
(2)来源于酿酒酵母INVScI菌株的编码腺苷蛋氨酸合成酶(2.5.1.6)的基因sam2的制备正向引物；5’-TCAGAATTCATGTCCAAGAGCAAAACT-3’；反向引物5’-CAAGCGGCCGCTTAAAATTCCAATTTCTTTGG-3’；下划线序列分别为EcoRI和NotI酶切位点。
扩增条件以酿酒酵母INVScI菌株总DNA为模板，以Pfu DNA聚合酶进行扩增。
反应体系2.5U的pfu DNA聚合酶、1×pfu buffer、200μmol L-1dNTP、1mmol L-1各引物、100ng的DNA模板，总反应体积100μl；反应条件94℃变性2min；30个循环的94℃30s，59℃30s，72℃3min；72℃延伸10min。PCR产物回收按上海华舜试剂盒使用说明书。目的产物见琼脂糖凝胶电泳(图2)。将目的基因经EcoRI和NotI酶切后克隆入pSE380载体的相应酶切位点，构建pSE380-sam2重组质粒。
实施例3采用新的基因改组方法对metk和sam2进行改组，获得编码热稳定性高的重组酶的杂合基因，具有序列表SEQ ID No3的碱基序列。
SEQ ID No3ATGTCCAAGAGCAAAACTTTCTTATTTACCTCTGAATCCGTCGGTGAAGGTCACCCAGACAAGATTTGTGACCAAGTTTCTGATGCTATTTTGGACGCTTGTTTAGAACAAGATCCATTCTCCAAGGTTGCCTGTGAAACAGCTGCCAAAACTGGTATGATTATGGTTTTCGGTGAAATTACCACCAAAGCTAGACTTGACTACCAACAAATAGTAAGAGATACCATCAAGAAGATTGGTTATGACGATTCTGCCAAGGGTTTCGACTACAAGACATGTAATGTTTTAGTAGCTATCGAACAACAATCTCCAGATATCGCTCAAGGTCTGCACTATGAAAAGAGCTTAGAAGACTTAGGTGCTGGTGACCAAGGTATAATGTTTGGTTACGCTACAAACGAAACTCCAGAAGGGTTACCATTGACCATTCTTTTGGCTCACAAATTGAACATGGCTATGGCAGATGCTAGAAGAGATGGTTCTCTCCCATGGTTGAGACCAGACACAAAGACTCAAGTCACTGTCGAATA
CGAAGACGACAATGGTAGATGGGTTCCAAAGAGGATAGATACCGTTGTTATTTCTGCTCAACATGCTGATGAAATTTCCACCGCTGACTTGAGAACTCAACTTCAAAAAGATATTGTTGAAAAGGTCATACCAAAGGATATGTTAGACGAAAATACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTCGTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATACCTACGGCGGCATGGCGCGTCACGGTGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCAGCCTACGCAGCACGTTATGTCGCGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCTGGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCGTGGCTGAACCGACCTCCATCATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAACAACTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTTCGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTCAGATGCTGGATCTGCTGCACCCGATCTACAAAGAATCCGCAGCATACGGTCACTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAACCAAAGAAATTGGAATTTTAA(1)SEQ ID No3的信息(参见序列表)(A)序列特征*长度1155碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(C)假设否(d)反义否(2)采用新的综合的基因改组机制对metk和sam2进行改组。
将上述两个腺苷蛋氨酸合成酶基因metk和sam2经纯化的PCR产物及pSE380载体分别用EcoRI和NotI进行消化(参照TaKaRa公司产品说明书)，然后以华舜试剂盒(上海华舜生物技术有限公司，下同)进行片段的纯化，并以T4DNA连接酶(TaKaRa)分别将PCR片段和载体片段连接，构建成重组质粒pSE380-metk和pSE380-sam2。两质粒分别被应用于扩增带有共同载体末端同源片段的目的基因metk’和sam2’，其末端分别引入BglII和PstI限制性酶切位点(下划线序列)。用于PCR扩增metk’的引物如下f15’-CAGAGATCTAATCACTGCATAATTCGTG-3’；r15’-CTGCTGCAGTCGTTTTATTTGATGCCTG-3’；用于PCR扩增sam2’的引物如下f25’-CAGCTGCAGAATCACTGCATAATTCGTG-3’；r25’-CTGAGATCTTCGTTTTATTTGATGCCTG-3’；上述两个PCR都是在以下条件下进行94℃变性2min，随后30个循环的94℃30s，53℃30s，72℃3min，然后72℃延伸10min。反应体系如下2.5U的pfu DNA聚合酶(TaKaRa)，2ng模板，1×pfu buffer，0.2mol L-1的dNTP混合物，1.0m mol L-1的MgCl2，反应总体积100μl。产物用PCR纯化试剂盒纯化，纯化的片段用BglII和PstI(TaKaRa)进行酶切，反应条件参照产品说明书。酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，目的大小的DNA条带用胶回收试剂盒进行回收。所得DNA片段经ExoIII(TaKaRa)单向酶切获得全长单链DNA。分别取0.2μg的两种单链DNA进行DNaseI消化，具体条件参照文献(Zhao，H.&Arnold，F.H.Optimization of DNAshuffling for high fidelity.Nucleic Acids Res.1997，25，1307-1308.)。在随后的步骤中，反应被分为两组进行，在每一组中，20ng的一种单链DNA和等量的来自另一个DNA的单链DNA片段分别混合在PCR管中，反应体系还包括1×taq buffer，0.2mmol L-1的dNTP混合物，1.5mmol L-1的MgCl2和1.25U taq DNA聚合酶(TaKaRa)，总反应体系是50μl。反应条件是94℃变性2min；10个循环的94℃30s，53℃2min；72℃延伸10min，然后分别加入16pmol的相应的反向引物r1 and r2，并进入下一个PCR反应，条件为94℃变性2min；60个循环的94℃30s，46℃10s。将两组反应产物混合，添加2U的taq DNA聚合酶和5.3mmol的如下引物f35-CATCCGGCTCGTATAATGTGTG-3；r35-CGCCAGGCAAATTCTGTTTTATC-3；反应条件如下94℃变性2min；40个循环的94℃30s，46℃10s；10个循环的94℃30s，66℃10s。产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳后，目的大小(约1.3kb)的片段经胶回收试剂盒纯化后作为模板用于特异性的扩增目的基因，反应体系为1×taq buffer，0.2mmol L-1的dNTP混合物，50ng模板DNA，1.5mmol L-1的MgCl2和1.25U taq DNA聚合酶总体积为50μl。反应条件为94℃变性2min；30个循环的94℃30s，52℃30s，72℃3min；72℃延伸10min。产物经PCR纯化试剂盒纯化后，用EcoRI和NotI(TaKaRa)消化。产物经胶回收试剂盒纯化后在T4DNA连接酶作用下连入经同样双酶切的pSE380载体(反应条件参照产品说明书)。重组质粒转入E.coli JM109并涂布于含有100μg ml-1Amp和10mmol L-1ethionine的LB平板上，37℃培养12h。从存活菌株中提取重组质粒，并分别用EcoRI和NotI进行消化，产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳后，目的大小的片段经胶回收试剂盒纯化后亚克隆入经同样双酶切的pYES2表达载体，并转化酿酒酵母INVScI。作为对照，将经过EcoRI和NotI双酶切的metk和sam2克隆入经同样双酶切的pYES2表达载体，构建pYES2+metk和pYES2+sam2，上述两质粒与pYES2分别被转化入酿酒酵母INVScI。具体反应条件参照产品说明书。挑取基因工程菌单菌落接种到15ml修改的SC-U培养基(6.7g酵母氮源；5g蛋氨酸；0.1g的腺嘌呤，精氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，赖氨酸，络氨酸，苏氨酸；0.05g的天冬氨酸，组氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，色氨酸和缬氨酸；终体积1L)，包括2％棉籽糖。30℃培养至OD600＝0.4，然后4℃下1500×g离心5min，然后将细胞重悬于2ml诱导培养基(修改的SC-U培养基，包含2％的半乳糖)，再接种到50ml的诱导培养基内，30℃条件下150r min-1摇床内培养6h。然后4℃下1500×g离心5min，倒掉上清，将沉淀重悬于500μl的纯净水。4℃下1500×g离心5min，倒掉上清，细胞用于检测SAM积累。每1g菌体中加入5ml 1.5mol L-1的高氯酸以120r min-1摇动1h.进行抽提，生成的SAM水平用BioCAD 700E型HPLC(Perseptive Biosystem，Inc.U.S.A.)进行检测。本试验选用弱阳离子交换柱Poros20CM(4.6mm×100mm)，流动相为0.5mol L-1的HCOONH4，pH调整为4.0，流速为5ml min-1，在260nm波长下检测产物，室温22℃。以含有pYES2，pYES2+metk和pYES2+sam2的酿酒酵母菌株诱导表达产物作为对照，并以10μmol L-1SAM标准品标定SAM的生成。
取1ml发酵液离心，菌体沉淀用1ml蒸馏水洗涤，离心后重悬于1倍的上样缓冲液中，沸水浴煮10min，12000×g离心2min。取10μl进行SDS-PAGE电泳，0.1％考马斯亮蓝染色，然后检测蛋白的表达。
结果1.运用本发明所述的基因改组方法，经过一轮反应即获得目的大小的重组DNA；2.在工程菌的细胞全蛋白电泳中有一条明显的表达带，诱导蛋白如图5所示。分子量约为4.2K dalton；3.通过HPLC检测，得到一株腺苷蛋氨酸胞内积累量提高的酿酒酵母菌株，并对其所含质粒pYES2+Ks09进行序列分析，确定其含有改组基因，并且具有多位点重组。
重组基因SEQUENCE LISTING<110>中国科学院沈阳应用生态研究所<120>一种基因改组的方法及所获得的重组基因和编码蛋白<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1155<212>DNA<213>大肠杆菌(E.coli.)JM109菌株<220>
<221>CDS<222>(1)..(1155)<223>
<400>1atg gca aaa cac ctt ttt acg tcc gag tcc gtc tct gaa ggg cat cct48Met Ala Lys His Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Ser Glu Gly His Pro1 5 10 15gac aaa att gct gac caa att tct gat gcc gtt tta gac gcg atc ctc96Asp Lys Ile Ala Asp Gln Ile Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala Ile Leu20 25 30gaa cag gat ccg aaa gca cgc gtt gct tgc gaa acc tac gta aaa acc144Glu Gln Asp Pro Lys Ala Arg Val Ala Cys Glu Thr Tyr Val Lys Thr35 40 45ggc atg gtt tta gtt ggc ggc gaa atc acc acc agc gcc tgg gta gac192Gly Met Val Leu Val Gly Gly Glu Ile Thr Thr Ser Ala Trp Val Asp50 55 60atc gaa gag atc acc cgt aac acc gtt cgc gaa att ggc tat gtg cat240Ile Glu Glu Ile Thr Arg Asn Thr Val Arg Glu Ile Gly Tyr Val His65 70 75 80tcc gac atg ggc ttt gac gct aac tcc tgt gcg gtt ctg agc gct atc288Ser Asp Met Gly Phe Asp Ala Asn Ser Cys Ala Val Leu Ser Ala Ile85 90 95ggc aaa cag tct cct gac atc aac cag ggc gtt gac cgt gcc gat ccg336Gly Lys Gln Ser Pro Asp Ile Asn Gln Gly Val Asp Arg Ala Asp Pro100 105 110ctg gaa cag ggc gcg ggt gac cag ggt ctg atg ttt ggc tac gca act384Leu Glu Gln Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr115 120 125aat gaa acc gac gtg ctg atg cca gca cct atc acc tat gca cac cgt432Asn Glu Thr Asp Val Leu Met Pro Ala Pro Ile Thr Tyr Ala His Arg130 135 140ctg gta cag cgt cag gct gaa gtg cgt aaa aac ggc act ctg ccg tgg480Leu Val Gln Arg Gln Ala Glu Val Arg Lys Asn Gly Thr Leu Pro Trp145 150 155 160ctg cgc ccg gac gcg aaa agc cag gtg act ttt cag tat gac gac ggc528Leu Arg Pro Asp Ala Lys Ser Gln Val Thr Phe Gln Tyr Asp Asp Gly165 170 175aaa atc gtt ggt atc gat gct gtc gtg ctt tcc act cag cac tct gaa576
重组基因Lys Ile Val Gly Ile Asp Ala Val Val Leu Ser Thr Gln His Ser Glu180 185 190gag atc gac cag aaa tcg ctg caa gaa gcg gta atg gaa gag atc atc624Glu Ile Asp Gln Lys Ser Leu Gln Glu Ala Val Met Glu Glu Ile Ile195 200 205aag cca att ctg ccc gct gaa tgg ctg act tct gcc acc aaa ttc ttc672Lys Pro Ile Leu Pro Ala Glu Trp Leu Thr Ser Ala Thr Lys Phe Phe210 215 220atc aac ccg acc ggt cgt ttc gtt atc ggt ggc cca atg ggt gac tgc720Ile Asn Pro Thr Gly Arg Phe Val Ile Gly Gly Pro Met Gly Asp Cys225 230 235 240ggt ctg act ggt cgt aaa att atc gtt gat acc tac ggc ggc atg gcg768Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly Gly Met Ala245 250 255cgt cac ggt ggc ggt gca ttc tct ggt aaa gat cca tca aaa gtg gac816Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp260 265 270cgt tcc gca gcc tac gca gca cgt tat gtc gcg aaa aac atc gtt gct864Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Tyr Val Ala Lys Asn Ile Val Ala275 280 285gct ggc ctg gcc gat cgt tgt gaa att cag gtt tcc tac gca atc ggc912Ala Gly Leu Ala Asp Arg Cys Glu Ile Gln Val Ser Tyr Ala Ile Gly290 295 300gtg gct gaa ccg acc tcc atc atg gta gaa act ttc ggt act gag aaa960Val Ala Glu Pro Thr Ser Ile Met Val Glu Thr Phe Gly Thr Glu Lys305 310 315 320gtg cct tct gaa caa ctg acc ctg ctg gta cgt gag ttc ttc gac ctg1008Val Pro Ser Glu Gln Leu Thr Leu Leu Val Arg Glu Phe Phe Asp Leu325 330 335cgc cca tac ggt ctg att cag atg ctg gat ctg ctg cac ccg atc tac1056Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Gln Met Leu Asp Leu Leu His Pro Ile Tyr340 345 350aaa gaa acc gca gca tac ggt cac ttt ggt cgt gaa cat ttc ccg tgg1104Lys Glu Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu His Phe Pro Trp355 360 365gaa aaa acc gac aaa gcg cag ctg ctg cgc gat gct gcc ggt ctg aag1152Glu Lys Thr Asp Lys Ala Gln Leu Leu Arg Asp Ala Ala Gly Leu Lys370 375 380taa1155<210>2<211>384<212>PRT<213>大肠杆菌(E.coli.)JM109菌株<400>2Met Ala Lys His Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Ser Glu Gly His Pro1 5 10 15Asp Lys Ile Ala Asp Gln Ile Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala Ile Leu20 25 30Glu Gln Asp Pro Lys Ala Arg Val Ala Cys Glu Thr Tyr Val Lys Thr35 40 45Gly Met Val Leu Val Gly Gly Glu Ile Thr Thr Ser Ala Trp Val Asp50 55 60Ile Glu Glu Ile Thr Arg Asn Thr Val Arg Glu Ile Gly Tyr Val His65 70 75 80Ser Asp Met Gly Phe Asp Ala Asn Ser Cys Ala Val Leu Ser Ala Ile85 90 95Gly Lys Gln Ser Pro Asp Ile Asn Gln Gly Val Asp Arg Ala Asp Pro100 105 110Leu Glu Gln Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr115 120 125Asn Glu Thr Asp Val Leu Met Pro Ala Pro Ile Thr Tyr Ala His Arg130 135 140Leu Val Gln Arg Gln Ala Glu Val Arg Lys Asn Gly Thr Leu Pro Trp145 150 155 160Leu Arg Pro Asp Ala Lys Ser Gln Val Thr Phe Gln Tyr Asp Asp Gly165 170 175Lys Ile Val Gly Ile Asp Ala Val Val Leu Ser Thr Gln His Ser Glu180 185 190Glu Ile Asp Gln Lys Ser Leu Gln Glu Ala Val Met Glu Glu Ile Ile195 200 205
重组基因Lys Pro Ile Leu Pro Ala Glu Trp Leu Thr Ser Ala Thr Lys Phe Phe210 215 220Ile Asn Pro Thr Gly Arg Phe Val Ile Gly Gly Pro Met Gly Asp Cys225 230 235 240Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly Gly Met Ala245 250 255Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp260 265 270Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Tyr Val Ala Lys Asn Ile Val Ala275 280 285Ala Gly Leu Ala Asp Arg Cys Glu Ile Gln Val Ser Tyr Ala Ile Gly290 295 300Val Ala Glu Pro Thr Ser Ile Met Val Glu Thr Phe Gly Thr Glu Lys305 310 315 320Val Pro Ser Glu Gln Leu Thr Leu Leu Val Arg Glu Phe Phe Asp Leu325 330 335Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Gln Met Leu Asp Leu Leu His Pro Ile Tyr340 345 350Lys Glu Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu His Phe Pro Trp355 360 365Glu Lys Thr Asp Lys Ala Gln Leu Leu Arg Asp Ala Ala Gly Leu Lys370 375 380<210>3<211>1155<212>DNA<213>酿酒酵母INVScI菌株<220>
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重组基因180 185 190gtt att tct gct caa cat gct gat gaa att tcc acc gct gac ttg aga624Val Ile Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Ser Thr Ala Asp Leu Arg195 200 205act caa ctt caa aaa gat att gtt gaa aag gtc ata cca aag gat atg672Thr Gln Leu Gln Lys Asp Ile Val Glu Lys Val Ile Pro Lys Asp Met210 215 220tta gac gaa aat acc aaa tat ttc atc caa cca tcc ggt aga ttc gtc720Leu Asp Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly Arg Phe Val225 230 235 240atc ggt ggt cct caa ggt gac gct ggt ttg acc ggt aga aag att att768Ile Gly Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile245 250 255gtc gac gct tac ggt ggt gcc tca tcc gtc ggt ggt ggt gcc ttc tcc816Val Asp Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Ala Phe Ser260 265 270ggt aag gac tat tcc aag gtc gat cgt tcc gct gct tac gct gct aga864Gly Lys Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg275 280 285tgg gtt gcc aag tct cta gtt gcc gct ggt ttg tgt aag aga gtc caa912Trp Val Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys Arg Val Gln290 295 300gtc caa ttt tca tat gct att ggt att gct gaa cca ttg tct tta cat960Val Gln Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Glu Pro Leu Ser Leu His305 310 315 320gtg gac acc tat ggt aca gct aca aaa tca gat gac gaa atc att gaa1008Val Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Asp Glu Ile Ile Glu325 330 335att att aag aag aac ttc gac ttg aga cca ggt gtg tta gta aag gaa1056Ile Ile Lys Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys Glu340 345 350tta gat ttg gct aga cca att tac tta cca acc gct tct tat ggt cac1104Leu Asp Leu Ala Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His355 360 365ttc act aat caa gag tac tca tgg gaa aaa cca aag aaa ttg gaa ttt1152Phe Thr Asn Gln Glu Tyr Ser Trp Glu Lys Pro Lys Lys Leu Glu Phe370 375 380taa1155<210>4<211>384<212>PRT<213>酿酒酵母INVScI菌株<400>4Met Ser Lys Ser Lys Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu1 5 10 15Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp20 25 30Ala Cys Leu Glu Gln Asp Pro Phe Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala35 40 45Ala Lys Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala50 55 60Arg Leu Asp Tyr Gln Gln Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys Lys Ile Gly65 70 75 80Tyr Asp Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys Asn Val Leu85 90 95Val Ala Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Leu His Tyr100 105 110Glu Lys Ser Leu Glu Asp Leu Gly Ala Gly Asp Gln Gly Ile Met Phe115 120 125Gly Tyr Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu Thr Ile Leu130 135 140Leu Ala His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Gly145 150 155 160Ser Leu Pro Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val Thr Val Glu165 170 175Tyr Glu Asp Asp Asn Gly Arg Trp Val Pro Lys Arg Ile Asp Thr Val180 185 190Val Ile Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Ser Thr Ala Asp Leu Arg195 200 205Thr Gln Leu Gln Lys Asp Ile Val Glu Lys Val Ile Pro Lys Asp Met
重组基因210 215 220Leu Asp Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly Arg Phe Val225 230 235 240Ile Gly Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile245 250 255Val Asp Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Ala Phe Ser260 265 270Gly Lys Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg275 280 285Trp Val Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys Arg Val Gln290 295 300Val Gln Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Glu Pro Leu Ser Leu His305 310 315 320Val Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Asp Glu Ile Ile Glu325 330 335Ile Ile Lys Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys Glu340 345 350Leu Asp Leu Ala Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His355 360 365Phe Thr Asn Gln Glu Tyr Ser Trp Glu Lys Pro Lys Lys Leu Glu Phe370 375 380<210>5<211>1155<212>DNA<213>人工序列<220>
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重组基因gtt att tct gct caa cat gct gat gaa att tcc acc gct gac ttg aga624Val Ile Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Ser Thr Ala Asp Leu Arg195 200 205act caa ctt caa aaa gat att gtt gaa aag gtc ata cca aag gat atg672Thr Gln Leu Gln Lys Asp Ile Val Glu Lys Val Ile Pro Lys Asp Met210 215 220tta gac gaa aat acc aaa ttc ttc atc aac ccg acc ggt cgt ttc gtt720Leu Asp Glu Asn Thr Lys Phe Phe Ile Asn Pro Thr Gly Arg Phe Val225 230 235 240atc ggt ggc cca atg ggt gac tgc ggt ctg act ggt cgt aaa att atc768Ile Gly Gly Pro Met Gly Asp Cys Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile245 250 255gtt gat acc tac ggc ggc atg gcg cgt cac ggt ggc ggt gca ttc tct816Val Asp Thr Tyr Gly Gly Met Ala Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser260 265 270ggt aaa gat cca tca aaa gtg gac cgt tcc gca gcc tac gca gca cgt864Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg275 280 285tat gtc gcg aaa aac atc gtt gct gct ggc ctg gcc gat cgt tgt gaa912Tyr Val Ala Lys Asn Ile Val Ala Ala Gly Leu Ala Asp Arg Cys Glu290 295 300att cag gtt tcc tac gca atc ggc gtg gct gaa ccg acc tcc atc atg960Ile Gln Val Ser Tyr Ala Ile Gly Val Ala Glu Pro Thr Ser Ile Met305 310 315 320gta gaa act ttc ggt act gag aaa gtg cct tct gaa caa ctg acc ctg1008Val Glu Thr Phe Gly Thr Glu Lys Val Pro Ser Glu Gln Leu Thr Leu325 330 335ctg gta cgt gag ttc ttc gac ctg cgc cca tac ggt ctg att cag atg1056Leu Val Arg Glu Phe Phe Asp Leu Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Gln Met340 345 350ctg gat ctg ctg cac ccg atc tac aaa gaa tcc gca gca tac ggt cac1104Leu Asp Leu Leu His Pro Ile Tyr Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Gly His355 360 365ttt ggt cgt gaa cat ttc ccg tgg gaa aaa cca aag aaa ttg gaa ttt1152Phe Gly Arg Glu His Phe Pro Trp Glu Lys Pro Lys Lys Leu Glu Phe370 375 380taa1155<210>6<211>384<212>PRT<213>人工序列<400>6Met Ser Lys Ser Lys Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu1 5 10 15Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp20 25 30Ala Cys Leu Glu Gln Asp Pro Phe Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala35 40 45Ala Lys Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala50 55 60Arg Leu Asp Tyr Gln Gln Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys Lys Ile Gly65 70 75 80Tyr Asp Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys Asn Val Leu85 90 95Val Ala Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Leu His Tyr100 105 110Glu Lys Ser Leu Glu Asp Leu Gly Ala Gly Asp Gln Gly Ile Met Phe115 120 125Gly Tyr Ala Thr Asn Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu Thr Ile Leu130 135 140Leu Ala His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Gly145 150 155 160Ser Leu Pro Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val Thr Val Glu165 170 175Tyr Glu Asp Asp Asn Gly Arg Trp Val Pro Lys Arg Ile Asp Thr Val180 185 190Val Ile Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Ser Thr Ala Asp Leu Arg195 200 205Thr Gln Leu Gln Lys Asp Ile Val Glu Lys Val Ile Pro Lys Asp Met210 215 220
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权利要求
1.一种基因改组的方法，其特征在于1)选取两种线性双链基因A和B，基因的末端分别带有能产生切口为不同粘性凸出末端的内切酶识别序列，分别用ExoIII消化产生方向相反的两组单链DNA---A’和B’；2)经消化后，分别取其中部分，用DNaseI消化成小片段A”和B”，并进行纯化；3)将A’和B”及A”和B’分别混合，形成两个反应体系I和II，然后进行单向PCR；随后，在I体系中加入对应A’的5’端的反向引物，在II体系中加入对应B’的5’端的反向引物，分别反向扩增；4)将上述两个体系混合，经套叠PCR扩增出全长片段；选择目的大小的重组基因，进行筛选和表达。
2.按照权利要求1所述基因改组的方法，其特征在于所述两种线性双链基因A和B分别具有序列表SEQ ID No1中的核苷酸序列和序列表SEQ ID No2中的核苷酸序列，以两基因为初始基因，经以下步骤实现基因间的改组1)对以上两基因进行BglII和PstI双酶切，并对酶切后的片段进行纯化；2)用ExoIII消化上述片段，以获得单链DNA并加以纯化；3)分别取两基因的50％总量的单链DNA基因用DNaseI进行酶切，得到小片段用80％乙醇沉淀，回收；4)反应分为两组，在每一组中将来自一个基因的单链DNA片段与来自另一基因的全长单链DNA混合，并以全长单链DNA为模板，通过片段3’端的序列同源性，在taq DNA聚合酶作用下单向扩增至模板5’端；5)加入单向引物，通过不对称PCR扩增杂合片段的互补单链，在此过程中通过短暂的复性/延伸实现交错延伸；6)将两组反应物混合，方向相反的互补片段间将会以交错延伸的方式形成全长双链，并在PCR过程中实现扩增；7)将重组基因连入表达载体并转入酿酒酵母，通过筛选，得到抗乙硫氨酸的工程菌株，通过腺苷蛋氨酸含量的测定，分离得到含量提高的菌株及其所包含的重组基因。
3.一种权利要求1所述方法获得的重组基因及其编码蛋白，其特征在于具有序列表SEQ ID No3中的核苷酸序列及序列表SEQ ID No4中的氨基酸序列
全文摘要
本发明涉及基因指导进化的方法，具体地说是一种基因改组方法及其应用，利用了来自一个基因的单链DNA经过酶切的片段通过其3’端与另一个基因的同源性及5’端与自身基因的同一性的特征，先将反应分成两组，每一组先经过预重组，再将两组反应物混合，经过一系列PCR反应步骤，经过一轮反应实现基因间的改组。通过测序结果分析，该方法在明显优于以往基因改组方法，并特别适用于对同源性较低的基因进行改组；分别以来自于大肠杆菌和酿酒酵母的腺苷蛋氨酸合成酶基因metk和sam2为起始基因(其序列同源性仅为56％)验证了该方法的有效性，并获得了活性提高的重组酶。
文档编号C12N15/52GK1834248SQ20051004603
公开日2006年9月20日 申请日期2005年3月16日 优先权日2005年3月16日
发明者吴文芳, 安迎锋, 吕安国 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所