基因组dna片段的筛选方法

专利名称：基因组dna片段的筛选方法
技术领域：
本发明涉及有效地筛选植物中可引发有益于农业的变异的基因组DNA片段的方法。
背景技术：
为了培养农业上有益的新品种，目前为止一直采用使植物彼此间杂交筛选子代的育种方法、诱发植物突然变异的突然变异育种法等。近年来，随着生物技术的进步，通过导入有用的基因培育了可表达其功能的基因重组植物。
导入个别基因的新品种培育通常，为了通过基因重组培育新品种，首先需要分离基因，分析其功能。近年来对植物基因的分子生物学的认识已显著发展，已确定了多种基因DNA序列，也分离了多个部分链以及全链cDNA克隆，同时确定了它们的序列。但是，目前为止被克隆化的、推测的基因的许多功能，仅仅是根据基因密码区域的碱基序列或者由其推测的蛋白质的氨基酸序列是否与目前发现的酶基因等序列相似的信息，来验证基因的功能，其中必须确认转化体中的基因表达与表型一致。因此，各种基因的功能解析需要大量的时间和劳力，其解析也几乎没有进展。现在有下述的尝试，即，分离全部长链cDNA克隆，将其与适当的启动子和终止子连接，通过转化来验证基因的功能。还公开有将其发展的技术，即，向植物中导入完全长cDNA文库，彻底解析基因功能的技术(WO03/018808)。但是，由于其中不是该基因原本带有的启动子，还可能会失去对内含子、其它基因的表达的控制功能，因此很难期待表现出基因原本的功能。另外，由于在基因中，其剪接方法不是一样的(Jordan et al.Trendsin Plant Sciences 7392-398，2002)，因此存在cDNA克隆丧失原有功能的情况。实际上，这样在转化植物中所确认的变异是缺乏培育新品种的实用性的。
近年来，利用生物信息学的方法，来推定将各基因翻译成蛋白质的编码区、启动区、内含子区。通过使用DNA片段的微阵列分析，研究了基因的表达方式。通过基因敲除技术，制备了大量功能缺失的变异体，并用于基因功能的解析中。另外，通过活化标记(activation tagging)，制得了基因表达亢进的转化体，并用于基因功能的解析。为了明确有基因编码的蛋白质之间的相互关系，使用了双杂交(two-hybrid)系。
但是，利用生物信息学的基因功能的推测，存在许多将从已知的蛋白质的功能、结构以及编码其的基因的序列之间所获得的知识利用到对功能不明确基因的功能探索中的情况，然而最近的研究表明，在cDNA中有大量不翻译成蛋白质的基因，即，虽然在转录成mRNA样的RNA但不生成蛋白质的基因。另外，在转录后，作为低分子RNA而发挥功能的基因也很多。这样，利用目前的生物信息学技术，仍有很多难以解析功能的基因组DNA中的基因。因此，即使利用这种最先进的方法，基因功能的推测还是不容易。
如上述，基因功能的解析在目前仍不容易。因此，即使可以特定基因功能，这种对个别基因进行转化的方法，也很难培育出在所谓杂种优势中其表达被提高的性状或使量的性状提高的新品种。
对于有些生物，为了获取该生物具有的、带来已知表型的基因，广泛进行了以下的尝试，即，构建该生物的基因组文库，将其作为质粒导入到酵母或细菌等微生物中制造转化细胞，再根据关于该已知表型所知道的信息，例如该基因的转录产物等信息，筛选转化细胞，利用其克隆目的基因(鸟枪法克隆)(Dairi et al.Mol Gen Genet 262957-964，2000.)。
另外，已经存在下述例子，即，利用鸟枪法克隆，不是将基因组文库导入到微生物而是导入到植物中，来转化植物基因组文库(Klee et al.Mol GenGenet 210282-287，1987)。该实验中，通过导入来自微生物的卡那霉素抗性基因所制得的拟南芥(Arabidopsis thaliana)转化体来构建基因文库，用具有大量含基因克隆的土壤杆菌(Agrobacterium)的混合菌株感染牵牛花叶片(petunia leaf disks)，筛选耐卡那霉素的牵牛花细胞，即，含有来自拟南芥转化体的耐卡那霉素基因的牵牛花细胞。结果提示，即使拟南芥中来自微生物的耐卡那霉素基因转化到牵牛花中之后，还是可以获取的。
还公开了以下的离子在拟南芥中，通过由乙酰羟酸合酶(Acetohydroxyacid synthase，AHAS)基因的突变而形成的对Chlorosulfuron显示抗性的突变体，来构建基因组文库，分离3个含有变异性AHAS基因的基因组克隆，将这些克隆导入到烟草中，得到了Chlorosulfuron抗性的转化体(Olszewski et al.Nucleic acid Res.1610765-10782，1988.)。
这些研究公开了利用基因组文库转化植物细胞，进行基因克隆的技术。但是，这些研究并不是在向基因组文库供给植物的未知基因的获取方面的成功研究，也不是在利用未知基因而进行转化植物改良方面的成功研究。即使采用这些技术，对于培育具有农业上有用的性状，即在杂种优势中其表达被提高的性状或使量的性状提高的新品种也是很难的。
杂种优势杂种优势是在杂交2个亲本品种时，杂种第一代(F1)显示比两亲更强的生活力的现象。杂种优势中可确认各种性状有所提高，例如植物体整体的活力(vigor)高、植物体以及器官大、产量高、生长速度快、防病害·虫害能力强、对抗干燥·高温·低温等各种环境胁迫(stress)的能力强、特定成分的增·减、特定酶活性的增·减等等，这些性状大都对农业上极其有益。作为运用杂种优势的育种法，将不同的亲本结合培植新品种的一代杂种育种法从古时就在栽培植物的改良方面被利用，对以玉米为代表的大量作物优良品种的培育作出了巨大的贡献。但是一代杂种育种法需要育种群体的培育·改良、自受精系的培育、一般组合能力的鉴定、特定组合能力的鉴定、F1品种的筛选等多个步骤，在各个步骤中还需要大量的时间和劳力。另外，虽然杂种优势在遗传远缘的亲本之间的结合中得到了巨大的效果，但是，与其相反，当亲缘关系远时，常常即使交配也不繁殖，可以进行交配的品种受到了限制。
引起杂种优势的分子机制还不明确。即使在最近的育种学的教科书中也仅仅是如下记载“在生理学、生物化学以及分子水平上的(杂种优势)的原因，即使今天也同1852年召开的杂种优势会议当时一样，还是几乎不清楚”(Genetics and Exploitation of Heterosis in Crops，p.173，ed.Coors andPandey，1999，American Society of Agronomy，Inc and Crop Science Society ofAnerica，Inc.，Madison，WI，U.S.A)。
最近，有对玉米相关的杂种优势有着深刻意义的报道。即，Fu and Dooner，Proc.Natl Acad Sci USA 999573-9578，2002与Song and Messing，Proc NatlAcad Sci USA 1009055-9060，2003。两篇报道中均着眼于玉米的特定基因位点，研究品种之间的碱基序列的差异，其结果提示在玉米中品种之间的差异要远远大于稻等自受精作物。
这些认识意义深刻，其显示在容易表达出杂种优势的杂交玉米中，品种间的基因组DNA序列的差异要远远大于自受精作物，但是这并不能解释说明引起杂种优势的分子机制。
这样对于引起杂种优势的分子机制仍不清楚。但在宏观水平种，通过以下所示的各种基因的相互作用，可以引起杂种优势，这一点是明确的。
a)显性基因连锁效应(dominance effect)确认有杂种优势的性状，受到各种连锁群中所具有的多个基因位点的支配，大多情况下认为各基因位点中，对生存或生产力有利的等位基因是显性的，而不利的等位基因是隐性的。由于连锁的基因位点多，因此对于大多的基因位点，几乎不可能得到所有有利等位基因纯合的系。但是由于在F1中合并了两亲所具有的所用有利的等位基因，因此产生杂种优势。
b)超显性效应(over-dominance effect)在多数的基因位点中，2个等位基因以杂合方式存在的情况，与任一等位基因以纯合方式存在的情况相比，将对生存或生产力有利，综合这样的效果也会产生杂种优势。
另外，特别是当超显性效应存在于作用力大的基因位点中时，观察到有由该单一位点的超显性效应而引起的杂种优势。也将该现像称为单一基因的杂种优势(single-gene heterosis)，或者单一基因位点的杂种优势(single-locusheterosis)。这并不是向原有植物赋予特定的表型，而是通过与其它植物的基因相互作用而产生有用变异的基因或者基因位点。作为显示这种性质的基因或者基因位点的例子，已知有玉米的醇脱氢酶基因基因(Schwartz，TheorApplGenet 43117-120，1973)、玉米的purple plant位点(Hollick and Chanldler，Genetics 150891-897，1988)的例子等。
c)非等位基因的相互作用(interaction of non-allelic genes)在F1杂种中，对生存或生产力有利的性状有时是由不同基因之间的相互作用而产生的。显示这种性质的大多数基因的效果的总和，产生了杂种优势。另外，非等位基因之间的相互作用也称为上位性(epistasis)。
d)细胞质基因的效果(interaction between nuclear genes and cytoplasmic genes)通过核基因与细胞质基因的相互作用，在F1杂种中有时会发现对生存或生产力有利的性状。
据信通过这样的各种、多个基因的相互作用，产生了杂种优势。Stuber(Plant Breeding Reviews 12227-251，1994)介绍了表明其与实际相关的大量文献，强调了杂种优势受到多个遗传因子的控制。另外，Li and Yuan(PlantBreeding Reviews 1715-158，2000)也认为通过上述各种效果的总和引起了杂种优势。
这样由于杂种优势受到多个遗传因子的控制，利用以往的技术在杂种优势中很难培养出使已确认表达提高的性状加强的新品种。
大小或量的性状通过杂种优势而确认表达提高的性状很多，即大小或量性状(量的)很多，但是对支配其的大小或量性状基因位点(QTL，Quantitative Trait Loci)的基因解析并不简单。但是随着近年来分子生物学方法的发展，可以使用DNA标记进行QTL的基因解析。实际上，也有将含有支配有些大小或量性状的QTL的染色体部分鉴定出来的例子。另外，也广泛进行了通过分子生物学的方法，利用基因图谱来克隆农业上有用基因的研究。
在一部分生物中，鉴定了染色体上多数的分子标记，以标记的连锁分析为基础制成基因图谱。另外，通过连接长的(長大な)基因组DNA也明确了物理的位置关系。
在制成基因图谱的生物中，通过显示特定表型的性状与标记的连锁分析以及接下来的染色体步移(chromosome walking)，来明确支配该性状的基因的物理位置，进行了分离基因的尝试。实际上通过该方法(map-based cloning)已经分离了一些基因。
但是，通过通常的QTL解析只能鉴定含有QTL的部位，理论上含有大量基因的DNA片段只能作为含有QTL的DNA片段来明确。因此不容易鉴定可以克隆的大片段，或者通过转化可以导入植物的大片段。另外，制成详细的基因图谱、根据地图情报确定要求的基因，在克隆基因的作业中需要较长时间和大量劳力。实际上，几乎没有根据QTL解析来克隆使大小或量性状扩增的DNA片段的例子。
基因组DNA文库的制作和由基因组片段的转化技术构建来自植物的基因组片段的文库的技术是公知的。使用可转化的载体也是公知的。例如公知可以克隆40～80kb大小的DNA片段、可以向植物导入基因的载体(Liu et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 966535-6540，1999)。也进行了将来自植物的各个特定克隆的基因组片段导入高等植物的试验。但是还没有进行过下述的尝试，即构建基因组DNA文库、将功能未知的大量基因组片段导入到个别植物。
另外，也已知了与利用cDNA的情况相比，利用基因组克隆有时基因可以高效地表达。实际上存在关于以下内容的报道，即将含有某种基因(玉米的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)的基因组片段导入植物(稻)之后，确认有高水平表达的外来基因(Ku et al.Nature Biotechnol.1776-80，1999)。另外还报道了，将3个40-80kb的来自拟南芥的基因组克隆分别导入拟南芥的试验例(Liu et al.Proc Natl Acad Sci USA 966535-6540，1999，Shibata and liu Trends in Plant Sci5354-357，2000)。将其中的2个克隆，导入到在该克隆中所含有的基因位点中发生突变而失去了向重力性(gravitropic defects)的拟南芥系中，确认其与缺失的向重力性所互补。
以上的见解提示了，生物的基因的表达量尤其是多细胞生物的基因的表达量，受到时间、空间上的分布以及外来刺激等环境条件的复杂控制，即，提示了何时，在何种组织、细胞中，在何时间、何程度的表达决定了该基因的重要性。即，为了阐明这些高度的控制基因的功能，必须研究清楚在这些基因的基因组片段中所含启动子、内含子、增强子、结构基因、剪切区、其它的高度基因表达控制的功能。但是这些工作需要大量的劳力和时间，因此明确大量的遗传因子的相互作用是困难的。
专利文献1PCT国际公开WO03/018808A非专利文献1Jordan et al.Trends in Plant Sciences 17392-398，2002非专利文献2Dairi et al.Mol Gen Genet 262957-964，2000非专利文献3Klee et al.Mol Gen Genet 210282-287，1987非专利文献4Olszewski et al.NucleicAcid Res.1610765-10782，1988非专利文献5Genetics and Exploitaion of Heterosis in Crops，p.173，ed.Coors and Pandey，1999，American Society of Agronomy，Inc.and CropScience Society ofAmerica，Inc.，Madison，WI，U.S.A非专利文献6Fu and Dooner，Proc.Natl Acad Sci USA 999573-9578，2002非专利文献7Song and Messing，Proc Natl Acad Sci USA 1009055-9060，2003非专利文献8Schwartz，TheorAppl Genet 43117-120，1973非专利文献9Hollick and Chandler，Genetics 150891-897，1998非专利文献10Stuber，Plant Breeding Reviews 12227-251，1994
非专利文献11Li and Yuan，Plant Breeding reviews 1715-158，2000非专利文献12Liu et al.Proc Natl Acad Sci USA 966535-6540，1999非专利文献13Ku et al.Nature Biotechnol.1776-80，1999非专利文献14Shibata and Liu Trends in Plant Sci 5354-357，2000发明内容发明要解决的课题本发明提供了有效地筛选大量可以带来农业上有益的变异的基因组DNA片段，作为克隆化的DNA片段而进行筛选、制备的方法。
本发明对于由多个遗传因子引起的表达提高的性状，提供了有效地筛选、制备使该表达提高的基因组DNA片段的方法。
本发明提供了有效地筛选大量基因组DNA片段，作为克隆化DNA片段而进行筛选、制备的方法，其中大量基因组DNA片段在杂种优势中可以提高已确认表达的性状以及大小或量性状。
本发明不需要育种基团的育成·改良、自受精系的育成、一般组合能力的检定、特定组合能力的检定、F1品种的筛选等需要大量时间的多个步骤，在植物中提供有效地筛选、制备基因组DNA片段的方法，该基因组DNA片段能够带来有益于农业的变异，其中这些需要大量时间的多个步骤是一代杂种育种法不能避免的。
本发明提供了有效地在植物中筛选、制备DNA片段的方法，其中该基因组DNA片段能够带来有益于农业的变异，该方法可以在即使几乎没有性状表达的机制或使性质表达的各种基因的相关信息的情况下，仅仅根据导入了基因组DNA片段的被导入植物的表型来筛选优良个体。
本发明提供了有效地筛选、制备基因组DNA片段的方法，该方法不仅在同种植物品种之间而且可以在异种植物品种之间，均使得与在杂种优势中的性状提高相同的表达(以下称为杂种优势样表达)成为可能。
本发明提供了不需要大量时间和人力，即可在短时间内有效地筛选、制备可带来杂种优势样表达的大量基因组DNA片段的方法。
本发明通过使用本发明方法而制备的、在植物中可带来有益于农业的变异的基因组DNA片段或者可引起杂种优势样表达的基因组DNA片段来对植物进行转化，从而提供了具有农业有益变异的植物的制造方法，以及通过该方法所获得的植物。
本发明通过使用本发明的方法所制备的、在植物中可带来有益于农业的变异的基因组DNA片段或者可带来杂种优势样表达的基因组DNA片段的全部或一部分作为标记，从而提供了具有农业有益变异的植物的培育方法，以及使用该方法所获得的植物。
用语说明本说明书中，“有益于农业的变异”是指植物在通常的情况下或者对植物施加任何胁迫的条件下，在植物特别是栽培植物及/或观赏植物中，对植物体的至少一部分带来大小或量上的增加或减少，或者给其生长速度带来的加快或减慢的变异。施加胁迫的条件包括栽培地的盐浓度、高温、低温、干燥、病害等。
这样的变异，在通常的栽培条件中，如果子实·茎叶等增大，则成为多产性状，在病害胁迫等条件下如果没有枯死，而且与对照相比子实·茎叶等增大，则意味着具有对病害胁迫等的抵抗性。内容成分、植物体中所含的酶也当然地包括在“植物体的一部分”中。现正在广泛地进行将植物体的全部或者部分大小减小的矮性植物的育种，由于广泛栽培常常出现有益于农业的情况。
“在任一的栽培条件下，该植物体的至少一部分带来大小或量的增大或减少的变异，或者带来其生长速度加快或减慢的变异”包括有益于农业的大量变异，例如植物整体的活力(vigor)增高、植物体或器官增大、产量增多、生长速度加快、抗病害·虫害能力强、抗干燥·高温·低温等各种环境胁迫能力强、特定成分的增·减、特定酶活性的增·减、矮性化等等。
另外，由于在组织栽培技术中所用的无病种苗的生产也是重要的农业技术，因此组织培养中细胞增殖能力的提高等也是有益于农业的变异。
本说明书中，“筛选”是指在某被筛选系中，实施某筛选工序之后，使筛选后的系中要素为零的工序，即，包括确定在被筛选的系中不含有符合筛选基准的要素的工序。鉴于通过确认不含有符合筛选基准的要素，则可避免在筛选系中投入大量劳力·资源就可具有产业适用性。
解决课题的方法本发明是通过以下的(1)～(4)以及任选的(5)的工序，而在植物中筛选可带来有益于农业变异的基因组DNA片段的方法。
(1)首先，按照通常使用的方法从植物中分离基因组DNA片段、进行部分限制性降解、大小分级之后，通过常法构建DNA文库。
对于提供基因组DNA文库的植物没有特别的限定，优选的例子例如通过与导入基因组DNA片段的植物交配而可出现杂种优势的植物。例如在导入体植物(導入先植物)为日本型(japonica)稻时，优选为野生稻的Oryzarufipogon、印度型(lndica)稻。当接受导入的植物为玉米的特定品种时，玉米的其它品种、野生类玉米草(teosinte)等是优选的供体植物的例子。一般越是亲缘关系远的植物越是能够观察到大的杂种优势。以往在亲缘关系远的情况中，由于不能杂交，不能利用由亲缘关系远的植物之间的杂交所产生的杂种优势，与此相对，通过本发明的方法，由于可容易地利用不能杂交的供体植物中的基因组DNA片段，因此也可将亲缘关系远的植物作为供体植物利用。
作为构建基因组文库中所使用的克隆载体，可利用各种载体。优选使用可直接在导入体植物的转化中使用的载体。例如可使用用于进行稻、烟草、拟南芥等的转化的pSB200或pCLD04541(Tao and Zhang Nucleic Acid Res264901-4909，1998)，也可使用用于进行玉米的转化的pSB25UNpHm。
单一基因位点杂种优势的情况时，克隆的DNA片段可最低含有1个基因，但是为了能够内含基因组中存在的各种基因及其表达控制所需要的区域，优选为1kb以上，更优选为10kb以上的大小，再优选为20kb以上，进一步优选为30～40kb以上。无论如何，对于DNA片段的大小，只要是可以导入克隆载体的即可，没有特别的限制。为得到这种DNA片段大小而使用的部分限制性降解的方法是公知的方法。构成基因组DNA文库的克隆总数，即，文库的大小优选为可以充分含有植物基因组大量基因的大小。作为部分限制性降解中所使用的酶，可使用各种酶。为了进行更小偏差的降解，优选使用识别4盐基的限制酶，如MboI、TaqI等。确定适当降解条件的方法是公知的，例如在Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Third Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001中有详细记录。
理论上，为了将任意的基因组片段以某种概率包含在DNA文库中，其克隆的总数通过下式来计算。
N＝ln(1-p)/ln(1-f)(式中，P为任意的基因组片段包含在该基因组DNA文库中的概率，f为克隆中所含有的基因片段的平均长度/原植物的基因大小，N为基因组克隆的总数。)例如，对于来自稻的基因组DNA文库，如任意的基因组片段包含在该基因组DNA文库中的概率为70％，基因组DNA文库的平均片段长度为40kb，则N＝ln(1-0.7)ln[1-(40×103/430×106)]＝1.3×104需要1万3千个克隆。
另外，本计算只是为了显示需要处理大量克隆的例子，并不是显示通常只需要处理该数量的基因组克隆。当在基因组DNA文库中，含有多个可给植物带来有益于农业变异的基因组DNA片段时，即使研究更少的克隆，其中含有至少一个希望得到的片段的概率也相当高。
各个克隆中所含有的基因组片段的大小较大时，研究更少数的基因组片段，即可获得希望得到的基因组片段。另一方面，基因组片段的大小较小时，之后的克隆操作变得简单，另外，通过转化导入到植物的效率也增大。要综合研究处理植物的基因大小、实验的规模等因素来决定。
当处理基因组大小较大的植物时，利用通过除去甲基化的DNA片段使得内含有表达基因的DNA片段的频率提高的方法也是有用的。在基因组大小较大的植物中，含有大量作为基因无功能的无用DNA，这样的DNA大多是甲基化了的。生物化学除去甲基化DNA的方法是公知的方法，在克隆时，通过使用具有除去甲基化DNA性质的大肠杆菌，可以除去甲基化DNA(WO00/50587)。
构建基因组DNA文库之后，将一部分构建文库的克隆转入到大肠杆菌中进行培养。对出现的菌落数(质粒或者黏粒载体的情况)或者斑(plaque)数(噬菌体的情况时)进行计数，以此为根据来估算文库中所含有的克隆数。再通过出现的菌落或者噬菌体的一部分制备DNA，测定克隆化的DNA片段的大小，估计平均片段的长度。
(2)再将来自构成文库的各个克隆中所含有的DNA分别导入到植物中使用可直接用于植物转化中的载体，如pSB200、pCLD04541以及pSB25UNpHm等载体时，可以将各种克隆其本身在实验上用于转化。否则，将各个克隆中所含有的全部或部分DNA片段转移至转化用载体之后，可进行转化实验。
在转化中使用的导入体植物，可以是与基因组DNA的来源植物异种的植物，也可以是同种的不同品种，也可以是同种的相同品种。作为优选植物的例子，为实质上无限宽范围的植物，可例举如稻、大麦、小麦、玉米等谷物，以及用于制造咖啡、可可、茶、烟草等嗜好品的植物、蔬菜类、果物类、花等观赏植物。
作为转化的方法可以为已有的方法。例如已知有作为生物导入法的土壤杆菌介导的方法，作为物理导入方法的显微注射法、电蚀孔法、基因枪法、碳化硅法、空气注射法，作为化学导入方法的聚乙烯二醇法等。通过转化而将基因组DNA引入到导入体植物的基因组中。
通过本发明，知晓了从一个植物基因组文库中所得的、可出现杂种优势表达的基因组DNA片段并不仅仅是一个。为了筛选出更多的基因组片段，希望将更多的基因组片段导入到个别植物中。另外，本发明的筛选方法中虽然可以包括任意的预筛选工序，但是为了排除所筛选的候补片段的偏差，向植物中导入的基因组DNA片段优选为在导入之前尽量不进行预筛选工序。
另外，在本发明中，对于导入基因组DNA片段，并不需要知道该DNA片段特别是在原植物中与什么样的表型是相关的这样的信息。这是因为通过筛选转化植物的表型，最初便特定了有用的基因组片段。
另外，对于导入至植物的各基因组克隆，要事先扩增及/或保藏至少其中的一部分。保藏可通过通常的方法来进行，作为纯化的DNA或者含有基因组克隆的大肠杆菌等细菌、酵母等来进行保藏。
(3)将导入了基因组片段的转化植物再生、栽培成完全的植物体。
对于再生了的转化植物及其后代植物，进行关于植物体整体的活力(vigor)、植物体以及个别器官的大小·重量、产量、生长速度、对病害·虫害的抵抗力、对干燥·高温·低温等各种环境胁迫的抵抗力、特定成分的增·减、特定酶活性的增·减等等有益于农业的各种性状的评价。另外，活力(vigor)说明了植物整体的活力以及旺盛的生长力。
本发明中，评价的性状不限于基因组DNA片段供体植物或所导入的基因组DNA片段的特征，只要是有益于农业上的性状即可而完全没有限定，优选为大小或重量(量的)性状、通过杂种优势被确认提高的性状，也优选为在将导入体植物作为育种对象时的有益于农业上的性状。
根据评价实验的结果、评价的性状，与没有导入该基因组片段的植物相比较，筛选表型变异的植物。例如，与没有导入该基因组DNA的植物相比较，可以筛选出显示植物体整体活力(vigor)高、植物体以及个别器官大、重量高、产量高、生长速度高、对病害·虫害的抵抗性强、对干燥·高温·低温等各种环境胁迫的抵抗性强、特定成分的增·减、特定酶活性的增·减等的植物。对于各性状所应该筛选的变异方向，不限于单方面。由于例如矮性这样的性状是各种作物中作为育种目标的重要农业性状，与没有导入该基因组片段的植物相比较，可以筛选在植物体以及个别器官的大小上变小了的植物。对于其它的性状也是一样的。
这样的性状大多数是所谓的大小或重量性状，除了基因的因素之外，也受到环境因素的较大影响。即使对于没有导入基因片段的植物，由于环境因素等，测定值也显示具有某些离散分布。通过本发明，在随机导入了基因组DNA片段的植物系中，对于存在引起表型变异的基因组DNA片段的情况时，期待出现测定值的分布宽度增大。通过筛选在该分布端部显示测定值的植物，可得到包括含有引起表型变异基因组DNA片段的植物的小集团。
对于这样得到的植物或者植物小基团中的各种植物，进行后代植物的评价以及与各种性状相关的反复调查，可以评价已确认变异的性状的特性、遗传方式、与其它性状之间的关系，另外可通过分子生物学·遗传学·生物化学·植物生理学的知识来进行详细的评价。进行各种评价之后，可作为新型品种利用到农业上。另外，如果从这些植物中，得到显示更加优良性状的植物，可以将在这些植物中导入的基因组DNA片段作为高价值的基因组DNA片段而筛选出来。
导入的基因组DNA片段的解析与获取可通过通常的克隆方法而容易地进行。
(4)将筛选的、导入至植物中的基因组DNA片段如上述作为基因组克隆另行保藏，使用利用克隆载体在大肠杆菌中的扩增的方法、PCR法或LAMP法等生物学扩增法，可以制造出需要的量。之后，利用其则可详细地进行碱基序列的确定、所含有的基因、内含子之外的遗传要素的分析等。由于可使用已知的转化方法将该基因组片段导入到任意的植物中，因此可将基因组DNA片段利用在与来源植物为异种的植物的品种改良、同种植物不同品种的品种改良、同种植物同一品种植物的育种中。
(5)如果需要，将全部或部分这样筛选的基因组DNA片段再次导入到同种或者异种植物中，进行同样的评价，由此可提供于2次筛选工序。此时，可使用与工序(2)中所使用的同一克隆载体进行转化，也可使用其它的克隆载体。使用其它的克隆载体时，将在工序(4)中筛选出的基因组DNA片段向其载体进行亚克隆。由于克隆载体中的用于克隆的限制部位因克隆载体的不同而不同，因此根据使用的限制酶，只将在工序(4)中筛选的基因组DNA片段的一部分进行亚克隆。另外，根据克隆载体或者克隆方法的不同，可以克隆的DNA片段的大小也不同，根据这个理由也存在只将该DNA片段的一部分进行亚克隆的情况。只使用部分该DNA片段来实施2次筛选工序的效果之一为，当明确只使用部分该DNA片段进行转化时显示了与使用全部该DNA片段时相同的效果时，就可以判断工序(4)中所筛选出的基因组DNA片段中的无用部分。对于通过2次转化而得的转化植物以及其后代植物，评价其农业上有益的各种性状，例如植物体整体的活性(vigor)、植物体以及个别器官的大小·重量、产量、生长速度、对病害·虫害的抵抗性、对干燥·高温低温等各种环境胁迫的抵抗性、特定成分的增·减、特定酶活性的增·减等。
评价试验的结果显示，对于评价的性状，与没有导入该基因组片段的植物相比较，无论1次筛选工序中的栽培条件、植物种等的条件如何，产生出现表型变异的植物的基因组DNA片段，均可在出现优选表型变异的植物中产生，可作为特别优选的基因组DNA片段来筛选。2次以后的选拔工序中也同1次选拔工序相同，可筛选出显示了例如与没有导入该基因组片段的植物相比较，植物体整体株高(vigor)高、植物体以及个别器官的体积重量均大、产量高、生成速度高、对病害·虫害的抵抗力高、对干燥·高温·低温等各种环境胁迫的抵抗性高，特定成分的增·减，特定酶活性的增·减等的植物。
对于选拔的植物，进行后代植物的评价以及与各种性状相关的反复研究，可评价已确认变异的性状的特性、遗传方式、与其它性状等的关联。各种评价之后，可作为新品种在农业中利用。
2次筛选的结果，是筛选了已经确认有再次向植物中导入即可引起有益于农业的变异的基因组DNA片段、在其它植物中也可引起有益于农业的变异的基因组DNA片段。因此筛选出比只1次筛选的情况价值更高的基因组DNA片段。
该筛选工序可反复进行多次，结果可以筛选出价值更高的基因组DNA片段。
通过对在筛选基因组DNA片段中所含有的基因的转录物、来自于其的cDNA，或者对由基因组DNA片段的碱基序列推测的基因的特性进行详细且综合的解析，可以得到对推测在该基因组DNA片段中含有的基因功能、解析引起杂种优势机制有用的知识。
以上，以基因组DNA片段的筛选方法为中心说明了本发明，本发明也提供了在如此筛选的植物中引起有益于农业变异的基因组DNA片段、还提供了通过该基因组DNA片段的转化而产生的具有有益于农业变异的植物。对于将特定的DNA片段导入至植物细胞或植物组织，再将该细胞或者组织愈合，培养该愈伤组织使之再分化成完全的植物的方法，已知有各种各样的方法。例如参考Hiei et al.Plant J.6271-282，1994。另外，虽然由于植物的不同也有从转化细胞不经过显著的愈合化再生成植物体的情况发生，但是本发明仍对这样情况有效。为了将再分化的植物作为品种来固定的方法，已知Maruta et al.Molecular Breeding 8273-284，2001的方法。
本发明还涉及将本发明的基因组DNA片段作为植物品种改良中的标记来使用的方法。即，具有本发明的基因组DNA片段的植物可用于提高植物的品种改良的效率。为了品种改良的使用，可以是为了将本发明的基因组DNA片段导入到其它植物中的、作为基因组DNA片段提供用植物而使用，或者也可作为为通过杂交育种方法而改良品种的亲本植物来使用。例如已经公知了将具有本发明的基因组DNA片段的植物与要改良品种的植物杂交后，从由所得的后代植物制备基因组DNA，在该基因组DNA中选择含有本发明的基因组DNA片段的植物，在选择的后代植物个体中，使用特定的基因组DNA片段的排列信息，而将该DNA片段作为标记的内容，例如Komoriet al.Euphytica 129241-247，2003等中的记载。另外，作为标记的使用，可将基因组DNA片段整体作为标记，由于在该基因组DNA片段中的一部分中含有特有的序列，因此也可将该部分的序列作为标记使用。
另外，z本发明的基因组DNA片段中，也包括在温和或者苛刻的应急条件(stringency condition)下，对使用本说明书所公开的方法而得的基因组片段的碱基序列进行杂交，分离的具有生物活性的DNA及RNA。作为由苛刻的应急所产生的杂交的条件，例如在Molecular Cloning等中记载的，在0.5M磷酸钠pH7.2、1mM EDTA、7％SDS、1％BSA中与65℃使之进行杂交之后，在40mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA、5％SDS、0.5％BSA中于65℃进行清洗操作，接着在40mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA、1％SDS中于65℃进行清洗操作；作为由温和的应急而杂交的条件，可例举如下两种条件，一种为在0.5M磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA、7％SDS、1％BSA中于55℃下使之进行杂交之后，在40mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA、5％SDS、0.5％BSA中于55℃、15分钟的条件下进行清洗操作2次，以及在40mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA、1％SDS中于55℃、15分钟的条件下进行清洗操作2次，另一种为例如在Molecular Cloning中所记载的，在30％去离子的甲酰胺、0.6M NaCl、40mM磷酸钠pH7.4、2.5mM EDTA、1％SDS中于42℃使之杂交之后，在2XSSC、0.1％SDS中于室温进行两次清洗，每次各十分钟，再于相同的缓冲液中在55℃进行1小时的清洗操作，但是条件不限于此。
发明效果以往的将基因组解析中的碱基序列与已知的碱基序列相比较的研究方法、cDNA的功能推测方法中均需要解析植物的基因功能，而本发明的基因组DNA片段筛选方法不用这样，其利用新的途径来寻找与杂种优势相关的DNA片段。
本发明的基因组DNA筛选方法，对于导入的基因组DNA片段，其不需要该DNA片段特别是在原植物中与什么样的表型相关的信息，而是通过新的途径来寻找与有用于农业的性状相关的DNA片段。
本发明的基因组DNA筛选方法对筛选的性状没有限制，对于有利于农业的性状，均可广泛选择。
本发明的基因组DNA片段筛选方法，对于基因组DNA片段，由于是通过导入体植物的表型来进行筛选的，因此筛选的基因组DNA片段可以直接在导入体植物的育种中使用。
本发明的基因组DNA片段筛选方法，由于将引起杂种优势相同效果的基因组DNA片段作为克隆化的DNA片段，而且由于可以获得容易进行植物转化的DNA片段，因此与利用传统育种法所产生的杂种优势不同，不需要伴随育种的长时间和大量劳力。
另外，本发明的基因组DNA筛选方法与利用由传统的育种法所产生的杂种优势不同，由于将一品种的基因组片段导入到另一品种中，因此不受亲代品种的生殖隔离的限制，可以将以往的一代杂种育种法所不能的植物之间的杂交变为可能。因此，无论与DNA来源的植物是同种还是异种，均可通过转化而将本发明的DNA片段导入至各种植物中，由于可以利用到育种中，因此可以在短时间内、高效地利用杂种优势的优点。
另外，本发明的基因组DNA片段筛选方法，由于与QTL解析不同，不需要寻找与农业性状相关的基因位点，因此不需长时间和大量劳力，就可有效地筛选出使性状增大或者减小的基因组DNA片段。
另外，本发明的基因组DNA片段由于通过转化而引起杂种优势同样表达的效果，因此通过在通常的杂交育种法中作为标记来利用，可显著提高杂交后代的筛选效率。
附图的简单说明〔


图1〕
图1是克隆载体pSB200的基因图谱。
〔图2〕图2是克隆载体pSB25UNpHm的基因图谱。
〔图3〕图3是显示以穗大小的外部观察、一穗的粒数以及植物整体的活力为基础所筛选的转化植物的例子与对照植物的照片(代T0、被选系的数5310)。
〔图4〕图4显示了对将Oryza rufipogon的基因组DNA片段导入所筛选出的转化的稻，进行稻瘟病抵抗性测定的结果。
〔图5〕图5显示了在胁迫条件下，将Oryza rufipogon的基因组DNA片段导入所筛选出的转化的稻的叶的伸长量。
〔图6〕图6显示了在将Oryza rufipogon的基因组DNA片段导入所筛选的转化烟草的愈伤组织的增殖中，基因组DNA片段的导入效果。
〔图7〕图7是显示将玉米草的基因组DNA片段导入所筛选的转化稻的例子和对照植物的照片。
〔图8〕图8是通过Oryza rufipogon的基因组DNA片段的PCR而得到的扩增部位的显示图。
〔图9〕图9是显示通过Oryza rufipogon的基因组DNA片段的PCR而得到的扩增结果的一个例子的照片。
〔
图10〕
图10是显示使由Oryza rufipogon的基因组DNA片段而产生的限制酶片段进行电泳的一个例子的照片。
〔
图11〕
图11是显示使组合有Oryza rufipogon的基因组DNA片段的转化载体的限制酶片段进行电泳的一个例子的照片。
实施例在以下的实施例中，只要是没有特别明确显示的内容，详细的实验步骤均记载在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc，(包含Supplements up to No.59，July 2002)，或者Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York，2001。
实施例1 来自Oryza rufipogon的基因组DNA的据取以及基因组DNA文库的构建使用由农林水产省生物资源研究所提供的稻的近缘种Oryza rufipogon的种子，从在温室下栽培的Oryza rufipogon的叶子，通过通常的方法提取基因组DNA。通过限制酶TaqI将该基因组DNA进行部分限制性降解之后，通过蔗糖密度梯度离心，得到30kb至50kb的级分。使用该级分，在黏粒载体pSB200的Nsp(7524)V(有时仅记为Nsp)切断部位进行克隆，构建基因组DNA文库。
pSB200是通过在Komari et al.(Plant J.10165-174，1996)中记载的pSB11而构建的克隆载体。即，在来自于玉米的泛素启动子(ubiquitin promotor)中添加耐潮霉素基因和NOS基因的3’末端信号，以及将Nsp(7534)V切断部位添加到pSB11中。如果使用pSB200，可以构建平均片段长度在40kb左右的基因组DNA文库。另外pSB200也是高等植物的转化用载体，可将耐潮霉素基因作为筛选标记导入到各种植物中。
在该文库中的大多克隆化的DNA片段的大小为约30kb至约50kb，克隆的总数为约8万个。另外，所使用的大肠杆菌的菌株为DH5α以及GeneHog。
实施例2 由构建来源于Oryza rufipogon的基因组DNA文库的克隆所产生的印度型稻的转化将构建上述基因组DNA文库的克隆分别导入至土壤杆菌LBA4404(pSB1)(Komari et al.1996)中。导入的方法为Triparental mating(Ditta et al.ProcNatl Acad Sci.U.S.A.777347-7351，1980)。将这些土壤杆菌分别导入到稻(品种雪光(ゆきひかり))中。转化方法按照Hiei et al.1994所提出的，通过在未成熟胚中接种土壤杆菌的方法来进行。品种雪光的未成熟胚，是将按照食用出售的糙米播种，在温室中栽培而得的植物，或者通过在室温下栽培的其后代植物而得到的。
其结果，得到了将上述基因组DNA文库中所含有的总计为5310个基因组DNA片段分别导入而得的转化植物。另外，对于各个基因组DNA片段，均得到1～5个独立的转化体。本说明书中，按照常法将转化的当代植物称为T0代的植物，将其后代植物，按照代的顺序称为T1代植物、T2代植物等。
在此，将该结果套入上述公式，通过5310＝ln(1-P)/ln[1-(40×103/430×106)]得到P＝0.39，在这些5310个基因组DNA片段中，含有任意的来自Oryzarufipogon的基因组DNA片段的概率为39％。
实施例3 对通过来自Oryza rufipogon的基因组DNA文库中所含有的基因组DNA片段而获得的转化日本型稻进行评价，以及对变异植物进行筛选在温室栽培转化植物，对于各个个体进行关于植物体整体的的活力、株高、相对生长率、穗数、地上部分重量、穗重、穗长、可稔粒数、产量的调查。本说明书中的相对生长率是表示每单位株高的1日生长量，通过((研究结束日的株高-研究起始日的株高)/(研究期间的日数)/研究起始时的株高而求得。研究的结果筛选出与对照植物比较确认有任意性状变异的植物。从表1至6以及图3显示了被筛选植物的例子以及向导入的基因组DNA片段所赋予的名称。在这些例子中，在导入有同一基因组片段的转化体中，筛选显示了同样的变异多个转化体。对于个基因组片段，显示了筛选植物的平均测定值。根据植物体整体的活力的外观观察所筛选的植物，在大多数情况下对任一测定数值均出现了变化。下述的例子均是根据植物体整体的活力和任意的测定数值来进行筛选的。
下述例子中，对照植物的测定值的分布符合正态分布。另外将进行了GUS基因的转化的稻(雪光)作为对照植物。按照该正态分布，在假设不存在导入片段的效果的情况下，计算出可显示筛选了转化植物系测定值的系的出现概率。无论在任何情况下，相对于被筛选的系的数，出现概率的数值均非常小，这样的筛选系的出现期望值远小于1.0。因此，排除了没有导入片段的效果的假设，在统计上证明了筛选系出现了有意义的变异。
表1根据移植后第14日的株高与植物整体的活力筛选出的转化植物的例子和对照植物(代T0、被选拔系的数846)

表2根据移植后第21日的株高与植物整体的活力筛选出的转化植物的例子和对照植物(代T0、被选拔系的数931)

表3根据移植后第14日到第21日的相对生长率和植物体整体的活力筛选出的转化植物的例子和对照植物(代T0、被选拔系的数841)

表4根据成熟期的地上部分重量和植物体整体的活力筛选出的转化植物的例子和对照植物(代T0、被选拔系的数1464) 表5根据穗重和植物体整体的活力筛选出的转化植物的例子和对照植物(代T0、被选拔系的数1464) 表6根据穗长和植物体整体的活力筛选出的转化植物的例子和对照植物
(代T0、被选拔系的数1464)

栽培转化植物的后代植物，与上述同样进行植物的评价。另外，根据孟德尔法则，由于期望在T1代中，将含有导入的基因组DNA片段的个体从不含有的个体中分离出来，因此对于有无导入片段，使用聚合酶链反应(PCR)法进行研究。
以下的表7至9中，显示了被筛选植物的例子以及向导入的基因组DNA片段所赋予的名称。在这些例子中，在来自同一转化植物的多个后代植物中，通过PCR法确认的存在导入片段的植物均显示了同样的变异，通过PCR法没有检测出有导入片段的植物均没有显示这样的变异。另外，在下述例子中，均根据植物体整体的活力以及所测定数值来进行筛选。
在下述例子中，对照植物的测定值符合正态分布。另外，作为对照植物，使用没有转化的雪光。按照该正态分布，在假设不存在导入片段的效果的情况下，计算出可显示筛选了转化植物系测定值的系的出现概率。无论在任何情况下，相对于被筛选的系的数，出现概率的数值均非常小，这样的筛选系的出现期望值远小于1.0。因此，排除了没有导入片段的效果的假设，在统计上证明了筛选系出现了有意义的变异。
表7根据移植后第14日的株高和植物体整体的活力筛选出的转化植物的例子和对照植物(代T1、被选拔系的数114)

表8根据移植后第21日的株高和植物体整体的活力筛选出的转化植物的例子和对照植物(代T1、被选拔系的数114) 表9根据移植后第14日至第21日的相对生长率与植物整体的活力筛选出的转化植物的例子和对照植物(代T1、被选拔系的数114)
实施例4 根据抗病害性评价进行转化植物的筛选将没有转化的雪光以及越光(コシヒカリ)作为对照植物，对于实施例2中培育的转化系的T1代植物，进行稻瘟病抵抗性的评价，筛选出确认在稻瘟病相关性状有变异的植物。再将导入到这些植物中的基因组DNA片段作为在作物中可引起有益于农业变异的基因组DNA片段来筛选。
在封闭的温室中播种各系，在播种后第12日移苗，在KOITOTRON((株)小丝制造所)中栽培。对对照品种各9个个体以及转化系每系5～9个个体接种稻稻瘟病菌Magnaporthe grisea菌，评价患病程度筛选耐性系。
接种源的制备如下进行。将稻稻瘟病菌株TSU-01的菌从接种到含有10g/l蔗糖的麦片琼脂培养基(difco)中，在26℃与黑暗下培养3周。为了形成分生孢子，在平皿中加入灭菌蒸馏水10ml，使用灭菌的画笔切断菌丝之后，在照明下于25℃培养3日。在平皿中注入用灭菌蒸馏水稀释至1/2浓度的LB液体培养基(Difco)8ml，使用灭菌的画笔将分生孢子混悬。将混悬液用双重纱布进行过滤之后，将分生孢子的浓度调至约2×106conidia/ml。于临接种之前向接种源中添加Silwet L-77使其最终浓度为0.01％。
接种是通过使用画笔在移植后第19日的植物中所展开的最上位的叶子上涂布接种源来进行的。涂布之后，立刻将接种叶通入至塑料制的管中，在上下的开口部用脱脂棉塞住，并用蒸馏水充分润湿。在日长14小时、白天25℃、夜间20℃的条件下栽培1周时间。在这期间，每日1次用蒸馏水将在开口部塞住的脱脂棉润湿。切断取出接种的叶子，以0(无病症)～3(在叶的大部分存在病斑)的患病程度来评价病斑的数目以及面积。
患病品种的“越光”中大多的叶子形成大量的病斑。患病程度平均为1.5。具有中等程度稻瘟病抵抗性的“雪光”较“越光”的病斑形成少，患病程度平均为0.8。
对于有无导入片段，这里是以从各个体摘取的叶片的耐潮霉素感受性为基础来判定的。将没有耐潮霉素抵抗性的个体，即没有导入片段的个体作为分离个体除去，比较转化个体的患病程度的平均值。转化系中的大多显示了与没有转化的对照“雪光”相同程度的患病程度。以下显示了转化系的13系的例子。A014D1201、A020E0401、A023F0303以及A078C0102显示了与“雪光”相比有意义的低患病程度(图4)。特别是A078C0102的患病程度的平均为0，提示了通过导入的普通野生型稻的基因组片段，可以赋予高度的稻瘟病抵抗性。
实施例5 根据干燥耐性评价进行转化植物的筛选将实施例2中培育的转化系的T1代4872系，与作为对照植物的没有转化的雪光以及作为干燥耐性品种被报道的水原287(来自农林省生物资源研究所)相比较，进行干燥胁迫耐性的评价，筛选确认有与干燥胁迫耐性相关性状变异的植物。在封闭的温室内的育苗箱中播种各系，10日后切断叶片进行潮霉素抵抗性的检测，确定在各个体中是否含有导入片段。将显示潮霉素抵抗性的个体，即推定含有导入片段的个体培植在直径12cm、高度10cm的POLYPOT((株)东海化成)中。培养基中使用稻用育苗土((株)イングス)，每个POLYPOT中的栽培个体数量为转化体6个、对照植物2个，总计8个。供试个体数量为每品种·系12～18个(2～3个杯)。在移植2周之后(播种4周之后)终止供水，开始进行干燥胁迫处理。
一周之后，进行转化植物的干燥耐性程度的评价。评价是对每个个体进行肉眼观察的5级评价(0枯死～5完全恢复)。为了校正各杯之间的数据分散，采用各供试体的评分除以同一杯内的雪光的评分所得的结果而对各个体进行评价。根据评价结果，筛选出上位10％的植物，这些植物是含有具有高可能性赋予作物干燥耐性的基因组片段。
另外，对上述的转化植物中的有希望的4系，在临干燥处理之前以及处理1周后，测定各个体的最上位叶的叶长。将处理1周之后的叶长除以临处理之前的叶长作为各个体在干燥胁迫处理条件下的叶的伸长量。叶长测定之后进行再供水，研究4日之后的恢复程度，评价在胁迫处理条件下的叶的伸长量。评价与上述同样进行，但是作为对照植物添加了只导入GUS基因的雪光(T2)。各系的评分分布为，采用柯尔莫诺夫-斯米尔诺夫检验(Kolmogorov-Smirnov test)来分析是否与雪光的评分分布存在差别。根据该结果，从供试的4系的转化体中筛选出在胁迫处理条件下叶的伸长量有意义的多于对照植物的1系(图5)。
实施例6 评价通过来自Oryza rufipogon的基因组DNA文库中所含有的基因组DNA片段而进行了转化的玉米，筛选产生变异的植物使用在实施例1中制成的含有来自Oryza rufipogon的基因组片段的土壤杆菌(Agrobacterium)，进行玉米的转化。转化的方法按照Ishida et al 2003(PlatBiotechnol.2057-66)。导入品种是近交品种A188(来自农业水产省生物资源研究所)。另外作为载体使用pSB25UNpHm，与实施例1同样制成基因组DNA文库以及含有来自Oryza rufipogon的基因组DNA片段的土壤杆菌。再使用其与上述同样操作进行玉米的转化。结果得到了将上述基因组DNA文库所含有的共计108个基因组DNA片段分别导入而形成的转化植物。
pSB25UNpHm是将Ishida et al.Nature Biotech 14745-750，1996中记载的pSB25的bar基因的启动子变换成来自玉米的泛素启动子，再添加了Nsp(7524)V切断部位、I-SceI切断部位、I-CeuI切断部位的载体。pSB25UNpHm具有与pSB200相同的克隆能力，另外，将bar基因作为筛选标记，可以在以玉米为代表的各种植物中进行基因的导入。
将转化当代植物(T0植物)，与稻相同的室温下栽培，调查移植后第28日的株高、第35日的株高、相对生长率(((移植后第35日的株高-移植后第28日的株高)/7)/移植后第28日的株高)、着雌穗节的叶长、最大穗重量、最大穗粒数、最大穗总粒重、1粒重(最大穗总粒重/最大穗粒数)，藉此来研究导入的基因组DNA片段的效果。另外，为了校正季节引起的生长不均，计算出同盆结束日(同一鉢上げ日)时的全部个体的平均值，通过(各个体的值-平均值)/平均值的公式来标准化数据进行分析。另外，将转化GUS基因的玉米(A188)作为对照植物。结果显示，在T0植物的各性状的方差中，与最大穗总粒重以及1粒重相关的方差有意义地大于对照植物的方差。这样，提示了在导入了基因组DNA的植物的系中，测定值的分布宽度增大。
在下述例子(表10-13)中，对照植物的测定值的分布符合正态分布。按照正态分布，在假设不存在导入片段的效果的情况下，计算出可显示筛选了转化植物系测定值的系的出现概率。无论在任何情况下，相对于被筛选的系的数，出现概率的数值均非常小，这样的筛选系的出现期望值远小于1.0。结果在调查最大穗总粒重的108系的5系中，期望值小于1.0。因此，排除了没有导入片段的效果的假设，在统计上证明了筛选系出现了有意义的变异。
另外，在温室中栽培所得的转化玉米，授以在其它温室中培育的玉米品种(A188)的花粉。在此，将来自该种子的代记为T1代。在温室中栽培T1代的各系的5～8各个体，进行性状调查。由于期望在T1代中，按照孟德尔法则，将含有导入的基因组DNA片段的个体从不含有的个体中分离出来，因此对于有无导入片段，使用聚合酶链反应(PCR)法进行研究。片段的有无可以使用PCR法来进行调查。(详细过程记于实施例16)。将片段的有无和调查性状的值进行比较研究的结果发现，对于株高以及相对生长率，含有导入基因组DNA片段的个体的平均值大于该系的全部个体的平均值(表14)。
以这些结果为基础，对于1个或多个性状，筛选出产生变异的转化植物以及其后代植物。再进一步筛选出导入到这些植物中的基因组DNA片段以及在玉米中可带来有益于农业变异的基因组DNA片段。
表10根据相对生长率筛选的转化植物(玉米)的例子(代T0，非筛选系的数108，为了将包括多个离盆日的数据综合使用，数据是标准化之后的数据)

表11根据最大穗穗重筛选的转化植物(玉米)的例子(代T0，非筛选系的数108，为了将包括多个离盆日的数据综合使用，数据是标准化之后的数据)

表12根据最大穗总粒重筛选的转化植物(玉米)的例子(代T0，非筛选系的数108，为了将包括多个离盆日的数据综合使用，数据是标准化之后的数据)

表13根据最大穗粒数筛选的转化植物(玉米)的例子和对照物(代T0，非筛选系的数108，为了将包括多个离盆日的数据综合使用，数据是标准化之后的数据)

表14根据通过筛选基因组DNA片段制成的标记所判断的该片段的有无与性状的关系

实施例7 评价通过来自Oryza rufipogon的基因组DNA文库中所含有的基因组DNA片段而进行了转化的烟草，筛选产生变异的植物使用在实施例1中制成的含有来自Oryza rufiogon的基因组片段的土壤杆菌，进行烟草的转化。转化的方法按照Komari TheorAppl Genet.80167-171，1990。导入品种为SR1(Kodama et al.Plant Physiol 105601-605，1994)。
通过调查由转化的烟草细胞所生成的愈伤组织的重量，来研究Oryzarufiogon的基因组DNA片段对愈伤组织的增殖的影响。在转化中，使用将烟草叶用打孔器穿通而制成的叶片。另外，将通过只带有耐潮霉素基因和GUS基因的载体pSB134而进行转化的烟草叶片作为对照。接种土壤杆菌，在培养基中培养20日之后，测定愈合化的叶片的重量。如图6所示，可筛选出与对照相比显示出旺盛的愈合增殖的基因组DNA片段。
在与稻·玉米相同的温室中栽培转化植物以及其后代植物，通过研究植物体整体的活力、株高、相对生长率、叶数、叶长、叶宽、叶重、地上部重、产量、耐干燥性、耐盐性以及耐病性，来判断导入的基因组DNA片段的效果。在这些性状之中，对于1个或者多个性状，筛选产生变异的转化植物以及其后代植物。再筛选导入至这些植物中的基因组DNA片段，作为在烟草中可带来有益于农业变异的基因组DNA片段。
将筛选的14系的转化植物在4寸杯中适应环境并栽培后，在与稻·玉米相同的温室中栽培，调查最大叶的叶长(离盆后(鉢上げ後)2周、3周)、自然草高(离盆后3周)、株高。另外将转化GUS基因的烟草(SR1)作为对照植物。结果在转化个体中离盆2周后的最大叶的叶长长者多。(x2检测，P＝0.00012)表15转化植物(烟草)在离盆2周后的最大叶叶长的频率分布

*由实际的分离比求出的期望值在下述例子(表16-18)中，对照植物的测定值的分布符合正态分布。按照正态分布，在假设不存在导入片段的效果的情况下，计算出可显示筛选了转化植物系测定值的系的出现概率。在此例子的植物无论在任何情况下，相对于被筛选的系的数，出现概率的数值均非常小，这样的筛选系的出现期望值远小于1.0。因此，排除了没有导入片段的效果的假设，在统计上证明了筛选系出现了有意义的变异。
表16根据移植2周后的最大叶叶长筛选的转化植物(烟草)的例子和对照植物(代T0，非筛选个体数172，根据对照植物的上位70％的分布的计算)(由于含有不良存活的个体以及分布不齐，因而除去下位30％)


表17根据移植3周后的最大叶叶长筛选的转化植物(烟草)的例子和对照植物(代T0，非筛选个体数172，根据对照植物的上位70％的分布的计算)(由于含有不良存活的个体以及分布不齐因而除去下位30％)

表18根据移植3周后的自然草长筛选的转化植物(烟草)的例子和对照植物(代T0，非筛选个体数172，根据对照植物的上位70％的分布的计算)(由于含有不良存活的个体以及分布不齐因而除去下位30％)

实施例8 评价通过来自拟南芥的基因组DNA文库中所含有的基因组DNA片段而进行转化的稻，筛选产生变异的植物与Oryza rufipogon的情况相同，分离来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的基因组DNA，构建基因组DNA文库，将构建该基因组DNA文库的基因组克隆分别通过转化法导入到稻(雪光)中。结果，得到了将在上述基因组DNA文库中含有的共计1477个基因组DNA片段分别导入而得的性状转换植物。使用的拟南芥的生态型是Columbia，其种子可以通过国际拟南芥遗传资源库(例如，RIKEN BIORESOURCE CENTER)得到。与来自Oryzarufipogon的基因组DNA文库的情况相同，在室温下栽培转化植物以及其后代植物，通过调查植物体整体的活力、株高、相对生长率、穗数、地上部重、穗重、穗长、可稔粒数、产量、叶数、叶长、叶宽、叶重、耐干燥性、耐盐性以及耐病性等，来判断导入的基因组DNA片段的效果。另外，将转化GUS基因的稻(雪光)作为对照植物。在这些性状之中，对于1个或者多个性状，筛选产生变异的转化植物以及其后代植物。再筛选导入至筛选植物中的基因组DNA片段，作为在作物中可带来有益于农业变异的来自拟南芥的基因组DNA片段。
在下述例子(表19)中，对照植物的测定值的分布符合正态分布。按照正态分布，在假设不存在导入片段的效果的情况下，计算出可显示筛选了转化植物系测定值的系的出现概率。在此例子的系无论在任何情况下，相对于被筛选的系的数，出现概率的数值均非常小，这样的筛选系的出现期望值远小于1.0。结果，在调查全穗重的1477系的13系中，期望值小于1.0。因此，排除了没有导入片段的效果的假设，在统计上证明了筛选系出现了有意义的变异。
表19根据全穗重筛选的转化植物(稻)的例子和对照植物(代T0，非筛选系的数1477)

实施例9 评价通过来自非洲虎尾草的基因组DNA文库中所含有的基因组DNA片段而进行转化的稻，筛选产生变异的植物与Oryza rufipogon的情况相同，分离来自非洲虎尾草(Chloris gayana)的基因组DNA，构建基因组DNA文库，将构建该基因组DNA文库的基因组克隆分别通过转化法导入到稻(雪光)中。结果，得到了将在上述基因组DNA文库中含有的共计1450个基因组DNA片段分别导入而得的性状转换植物。所用的非洲虎尾草品种是名为カリ一デ的市售品。与来自Oryza rufipogon的基因组DNA文库的情况相同，在室温下栽培转化植物以及其后代植物，通过调查植物体整体的活力、株高、相对生长率、穗数、地上部重、穗重、穗长、可稔粒数、产量、叶数、叶长、叶宽、叶重、耐干燥性以及耐病性等，来判断导入的基因组DNA片段的效果。另外，将转化GUS基因的稻(雪光)作为对照植物。在这些性状之中，对于1个或者多个性状，筛选产生变异的转化植物以及其后代植物。再筛选导入至筛选植物中的基因组DNA片段，作为在作物中可带来有益于农业变异的来自非洲虎尾草的基因组DNA片段。
在下述例子(表20)中，对照植物的测定值的分布符合正态分布。按照正态分布，在假设不存在导入片段的效果的情况下，计算出可显示筛选了转化植物系测定值的系的出现概率。由于在此例子的系无论在任何情况下，相对于被筛选的系的数，出现概率的数值均非常小，因而这样的筛选系的出现期望值远小于1.0。结果，在调查全穗重的905系的23系中，期望值小于1.0。因此，排除了没有导入片段的效果的假设，在统计上证明了筛选系出现了有意义的变异。
表20根据全穗重筛选的转化植物(稻)的例子和对照植物(代T0，非筛选系的数905)

实施例10 评价通过来自高粱的基因组DNA文库中所含有的基因组DNA片段而进行了转化的稻以及玉米，筛选产生变异的植物与Oryza rufipogon的情况相同，分离来自高粱(Sorghum bicolor)的基因组DNA，构建基因组DNA文库，将构建该基因组DNA文库的基因组克隆分别通过转化法导入到稻(雪光)以及玉米(A188)中。结果，得到了分别将在上述基因组DNA文库中含有的2560个、200个基因组DNA片段分别导入而得的性状转换植物。所用的高粱的品种是名为ゴ一ルドソルゴ一的市售品。与来自Oryza rufipogon的基因组DNA文库的情况相同，在室温下栽培转化植物以及其后代植物，通过调查植物体整体的活力、株高、相对生长率、穗数、地上部重、穗重、穗长、可稔粒数、产量、叶数、叶长、叶宽、叶重、耐干燥性以及耐病性等，来判断导入的基因组DNA片段的效果。在这些性状之中，对于1个或者多个性状，筛选产生变异的转化植物以及其后代植物。再筛选导入至筛选植物中的基因组DNA片段，作为在作物中可带来有益于农业变异的来自高粱的基因组DNA片段。
下述显示了关于稻的全穗重的例子(表21)，在下述例子中，对照植物的测定值的分布符合正态分布。另外将转化GUS基因的稻作为对照植物。按照正态分布，在假设不存在导入片段的效果的情况下，计算出可显示筛选了转化植物系测定值的系的出现概率。由于在此示例的系无论在任何情况下，相对于被筛选的系的数，出现概率的数值均非常小，因而这样的筛选系的出现期望值远小于1.0。结果，在调查全穗重的2504系的43系中，期望值小于1.0。因此，排除了没有导入片段的效果的假设，在统计上证明了筛选系出现了有意义的变异。
表21根据全穗重筛选的转化植物(稻)的例子和对照植物(代T0，非筛选系的数2504)

另外，对于导入有高粱的片段的玉米，调查转化当代植物在移植后第28日的株高、第35日的株高、相对生长率(((移植后第35日的株高-移植后第28日的株高)/7)/移植后第28日的株高)、着雌穗节的叶长、最大穗重量、最大穗粒数、最大穗总粒重、1粒重(最大穗总粒重/最大穗粒数)，结果发现，与相对生长率、最大穗粒数、1粒重相关的方差有意义地大于对照植物的方差。另外，为了校正季节引起的生长不均，计算出同盆结束日时的全部个体的平均值，通过(各个体的值-平均值)/平均值的公式来标准化数据进行分析。
在下述例子(表22-27)中，对照植物的测定值的分布符合正态分布。另外，将转化GUS基因的玉米(A188)作为对照植物。按照正态分布，在假设不存在导入片段的效果的情况下，计算出可显示筛选了转化植物系测定值的系的出现概率。在此示例的系无论在任何情况下，相对于被筛选的系的数，出现概率的数值均非常小，这样的筛选系的出现期望值远小于1.0。结果在调查的150系中关于相对生长率的7系中，关于最大穗粒数的8系中期望值小于1.0。因此，排除了没有导入片段的效果的假设，在统计上证明了筛选系出现了有意义的变异。
根据这些结果，从来自高粱的基因组DNA片段中筛选作为在玉米中可带来有益于农业变异的基因组DNA片段。
表22根据移植后第28日的株高筛选的转化植物(玉米)的例子(代T0，非筛选系的数150，为了将包括多个离盆日的数据综合使用，数据是标准化之后的数据)

表23根据相对生长率筛选的转化植物(玉米)的例子(代T0，非筛选系的数150，为了将包括多个离盆日的数据综合使用，数据是标准化之后的数据)


表24根据最大穗穗重筛选的转化植物(玉米)的例子(代T0，非筛选系的数150，为了将包括多个离盆日的数据综合使用，数据是标准化之后的数据)

表25根据最大穗总粒重筛选的转化植物(玉米)的例子(代T0，非筛选系的数150，为了将包括多个离盆日的数据综合使用，数据是标准化之后的数据)

表26根据最大穗粒数筛选的转化植物(玉米)的例子(代T0，非筛选系的数150，为了将包括多个离盆日的数据综合使用，数据是标准化之后的数据)

表27根据叶长筛选的转化植物(玉米)的例子(代T0，非筛选系的数150，为了将包括多个离盆日的数据综合使用，数据是标准化之后的数据)


实施例11 评价通过来自玉米草的基因组DNA文库中所含有的基因组DNA片段而进行转化的稻，筛选产生变异的植物与Oryza rufipogon的情况相同，分离来自玉米草(Zea diploperenis)的基因组DNA，构建基因组DNA文库，将构建该基因组DNA文库的基因组克隆分别通过转化法导入到稻(雪光)中。结果，得到了将在上述基因组DNA文库中含有的共计1608个基因组DNA片段分别导入而得的性状转换植物。所用的玉米草的品种是作为牧草用玉米草的市售品。与来自Oryza rufipogon的基因组DNA文库的情况相同，在室温下栽培转化植物以及其后代植物，通过调查植物体整体的活力、株高、相对生长率、穗数、地上部重、穗重、穗长、可稔粒数、产量、叶数、叶长、叶宽、叶重、耐干燥性以及耐病性等，来判断导入的基因组DNA片段的效果。在这些性状之中，对于1个或者多个性状，筛选产生变异的转化植物以及其后代植物。再筛选导入至筛选植物中的基因组DNA片段，作为在作物中可带来有益于农业变异的来自玉米草的基因组DNA片段。另外，将转化GUS基因的稻(雪光)作为对照植物。导入玉米草的基因组片段之后的稻的栽培状况示于图7。
实施例12 评价通过来自苏丹草的基因组DNA文库中所含有的基因组DNA片段而进行转化的稻，筛选产生变异的植物与Oryza rufipogon的情况相同，分离来自苏丹草(Sorghum sudanese)的基因组DNA，构建基因组DNA文库，将构建该基因组DNA文库的基因组克隆分别通过转化法导入到稻(雪光)中。结果，得到了将在上述基因组DNA文库中含有的共计2644个基因组DNA片段分别导入而得的性状转换植物。所用的苏丹草的品种是作为牧草用苏丹草的市售品。与来自Oryza rufipogon的基因组DNA文库的情况相同，在室温下栽培转化植物以及其后代植物，通过调查植物体整体的活力、株高、相对生长率、穗数、地上部重、穗重、穗长、可稔粒数、产量、叶数、叶长、叶宽、叶重、耐干燥性以及耐病性等，来判断导入的基因组DNA片段的效果。在这些性状之中，对于1个或者多个性状，筛选产生变异的转化植物以及其后代植物。再筛选导入至筛选植物中的基因组DNA片段，作为在作物中可带来有益于农业变异的来自苏丹草的基因组DNA片段。
在下述的例子(表28)中，对照植物的测定值的分布符合正态分布。另外将转化GUS基因的稻作为对照植物。按照正态分布，在假设不存在导入片段的效果的情况下，计算出可显示筛选了转化植物系测定值的系的出现概率。由于在此示例的系无论在任何情况下，相对于被筛选的系的数，出现概率的数值均非常小，因而这样的筛选系的出现期望值远小于1.0。结果，在调查全穗重的2644系的21系中，期望值小于1.0。因此，排除了没有导入片段的效果的假设，在统计上证明了筛选系出现了有意义的变异。
表28根据全穗重筛选的转化植物(稻)的例子和对照植物(代T0，非筛选系的数2644)

实施例13 评价通过来自小米的基因组DNA文库中所含有的基因组DNA片段而进行转化的稻，筛选产生变异的植物与Oryza rufipogon的情况相同，分离来自小米(Seteria italica)的基因组DNA，构建基因组DNA文库，将构建该基因组DNA文库的基因组克隆分别通过转化法导入到稻(雪光)中。结果，得到了将在上述基因组DNA文库中含有的共计2952个基因组DNA片段分别导入而得的性状转换植物。所用小米的品种是作为牧草用市售品的极早生イタリアンミレツトR。与来自Oryza rufipogon的基因组DNA文库的情况相同，在室温下栽培转化植物以及其后代植物，通过调查植物体整体的活力、株高、相对生长率、穗数、地上部重、穗重、穗长、可稔粒数、产量、叶数、叶长、叶宽、叶重、耐干燥性以及耐病性等，来判断导入的基因组DNA片段的效果。在这些性状之中，对于1个或者多个性状，筛选产生变异的转化植物以及其后代植物。再筛选导入至筛选植物中的基因组DNA片段，作为在作物中可带来有益于农业变异的来自小米的基因组DNA片段。
在下述例子(表29)中，对照植物的测定值的分布符合正态分布。另外，将转化GUS基因的稻(雪光)作为对照植物。按照正态分布，在假设不存在导入片段的效果的情况下，计算出可显示筛选了转化植物系测定值的系的出现概率。在此示例的系无论在任何情况下，相对于被筛选的系的数，出现概率的数值均非常小，这样的筛选系的出现期望值远小于1.0。结果，在调查全穗重的1126系的15系中，期望值小于1.0。因此，排除了没有导入片段的效果的假设，在统计上证明了筛选系出现了有意义的变异。
表29根据全穗重筛选的转化植物(稻)的例子和对照植物(代T0，非筛选系的数1126)

实施例14 评价通过来自大黍的基因组DNA文库中所含有的基因组DNA片段而进行转化的稻，筛选产生变异的植物与Oryza rufipogon的情况相同，分离来自大黍(Panicum maximum)的基因组DNA，构建基因组DNA文库，将构建该基因组DNA文库的基因组克隆分别通过转化法导入到稻、玉米以及烟草中。所用大黍的品种是作为牧草用市售品的カラ一ドギニアクラス。与来自Oryza rufipogon的基因组DNA文库的情况相同，在室温下栽培转化植物以及其后代植物，通过调查植物体整体的活力、株高、相对生长率、穗数、地上部重、穗重、穗长、可稔粒数、产量、叶数、叶长、叶宽、叶重、耐干燥性耐盐性以及耐病性等，来判断导入的基因组DNA片段的效果。在这些性状之中，对于1个或者多个性状，筛选产生变异的转化植物以及其后代植物。再筛选导入至筛选植物中的基因组DNA片段，作为在稻、玉米或者烟草中可带来有益于农业变异的来自大黍的基因组DNA片段。
实施例15 将筛选的基因组DNA片段作为模板，通过PCR制造基因组DNA片段对于筛选的基因组DNA片段(AS4(A011D07)、AS8(A014E08)、AS19(A010B03)、AS20(A011C02)、AS22(A014D12)、AS27(A012C12)、AS28(A015C06)、AS30(A016D02))，解析末端碱基系列。根据解析的序列和载体序列设计引物，将从大肠杆菌中分离的质粒DNA作为模板使用，为了确认存在T-DNA区域的两末端而进行了PCR(图8中的PCR1以及PCR3)。
用于PCR1以及PCR3的载体区域引物的序列分别为5’-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTG-3’和5’-AACTGCACTTCAAACAAGTGTGAC-3’用于PCR1的基因组DNA片段特异的引物序列为AS45’-GATTCCGACCTCTACACGAACAAC-3’AS85’-AGAAACCCTAGCCGTCACTTCCCT-3’AS195’-TCAAGTCATTTCACAAAGTCGGAC-3’AS205’-GCTTAGAGGTGAAAATGGTAACGG-3’AS225’-TTCTGTCCTTGTTCGATTTGTCAG-3’AS275’-CCGGATTCACCGTGGTACGAAAGG-3’AS285’-TTCCAATTACCAGACACTAAAGCG-3’AS305’-TGGCACCAGACTTGCCCTCCAATG-3’用于PCR3的基因组DNA片段特异的引物序列为AS45’-GTACGGCCTGGGTCACTCACTGTC-3’AS85’-TCATCATCCTGTTATCTAGACTCC-3’AS195’-TACTTATTCCGTGAGTCGGAAGCG-3’AS205’-TCCAGTGTTATGATGTTTGGGCTG-3’AS225’-AACTCATCTTTAATCCCAGTTTGC-3’AS275’-TAACGCCATAAACAAGTGTCACTC-3’AS285’-GAACTGTGAAACTGCGAATGGCTC-3’AS305’-AAATCCACACGACTCTCGGCAACG-3’
另外，对于AS4、AS8以及AS22进行了确认在片段中央部存在的PCR(图8中的PCR2)。所用的引物的序列如下AS45’-TGGGCTCCAGCAGAAACGAACCCT-3’和5’-CTTATATTTAGGAACGGAGTGAGT-3’AS85’-AAGCGAAGGCACCCCTTCACAT-3’和5’-ACGAGGAGCCCGACAAGGAGAC-3’AS225’-TGAAATACCACTCATGAACTTCCG-3’和5’-ATTATCTGTTGTGTCCGAAATGTG-3’PCR均使用Takara ExTaq(TAKARA公司)或者Takara LA Tag(TAKARA公司)，重复由热变性(94℃、30秒)、退火(58℃、30秒)以及延长反应(72℃、30秒)形成的循环30次或35次。PCR的产物通过琼脂糖凝胶电泳来解析。
PCR解析的结果示于图9。对于PCR1、PCR2以及PCR3中的任何一个，当将各基因组DNA片段的质粒DNA用于模板时，均观察到目标大小的PCR产物。另一方面，使用pSB200作为模板时，没有观察到产物。由这些结果可显示，导入至pSB200的各ルフイポゴン片段可以通过PCR来制造(图9)。
实施例16 将筛选片段作为标记的应用由实施例3评价的可使稻变异的基因组DNA，通过实施例6向玉米进行了转化。将所得的转化玉米在室温下栽培，向转化玉米授以在其它温室培育的玉米品种A188的花粉。预测所得的后代种子将分为含有Oryza rufipogon的基因组DNA片段的个体和不含有的个体。因此将导入的基因组DNA片段的T-DNA的边缘序列部分作为标记，通过PCR法判断是否有扩增的来自Oryza rufipogon的基因组DNA片段。结果，具有该标记的植物个体适于品种培育，可用于育种工程，没有该标记的植物个体不适于品种改良。
表30中显示了有无导入基因组DNA片段与性状的测定值的关系。
表30通过筛选基因组DNA片段制成的标记得到的该片段的有无与性状的关系


实施例17 使用大肠杆菌筛选的基因组DNA片段的制造方法将含有克隆载体(pSB200)的大肠杆菌分别在-80度保存在甘油库中，该克隆载体中含有转化的基因组DNA片段，从甘油库中取大肠杆菌，将其在LA(Sp50)平皿中于28℃培养3日，培殖单菌落。将培殖的单菌落接种到LB(Sp50)液体培养基中，于28℃振动一晚培养后，将培养液移至1.5ml的微型管中，以15000rpm离心操作2分钟，进行集菌。弃去上清液，从菌的平皿中按照常法(碱法)分离质粒，使质粒DNA溶解在TE40μl中，得到筛选的基因组DNA片段以及含有克隆载体的基因组DNA片段。
实施例18 DNA片段的制造方法，其包括限制性降解所制造的DNA片段的工序使用在实施例17中制成的质粒DNA(克隆名AS88、AS90、AS95～AS102、AS104～AS106)，制备由以下成分组成的反应液。
各质粒DNA分别含有以下基因组DNA片段。(A018D06、A047C01、A082B03、A082B06、A083A01、A083A02、A083H04、A084H05、A088A12、A091E11、A049B03、A080C09、A088C09)质粒DNA4μl10x M缓冲液(Takara)2μlHindIII0.5μlSacI 0.5μlRNaseA 0.1μl灭菌水 12.9μl
总计 20μl在37℃反应1小时之后，向反应液中添加6x色素4μl，混合，取6μl用于0.7％琼脂糖凝胶电泳(100V，1小时)。电泳结束后，将凝胶用EtBr染色，得到从各基因组克隆中生成的限制性酶片段。其中的1例示于
图10。
实施例19 将用大肠杆菌制造的基因组DNA片段重组到转化用载体(pSB200)使用由大肠杆菌分离·纯化的质粒DNA(基因组DNA片段G001A03)，按照GATEWAY技术(Invitrogen公司)试剂盒附加的实验设计进行BP反应(在25℃、一晚)，进行Proteinase K处理之后，添加乙醇使质粒DNA沉淀。进行离心(15000rpm)处理之后，将所得的沉淀用70％的乙醇清洗，再用TE 10μl使之溶解。使用其中的2μl通过电子穿孔将质粒导入到大肠杆菌DB3.1中，在LA(Sp50Cm30)中平皿培养，在28℃培养3日。将培殖的单菌落在LB(Sp50Cm30)2ml中培养，按照常法(碱法)分离质粒DNA，使用HindIII以及SacI进行片段解析，进行目标质粒的筛选，由于通过BP反应aatB1-HPT-aatB2片段被置换为aatR1-ccdB-Cm-aatR2片段，载体的大小由9.8kb变成10.4kb，因此将此作为指标进行了重组质粒(G001A03DEST)的筛选(
图11泳道2)。
接着，使用上述筛选的质粒G001A03DEST，在与BP反应的相同条件下进行LR反应，进行试剂筛选标记基因变化的克隆G001A03bar的筛选。由于通过LR反应aatR1-ccdB-Cm-aatR2片段被置换为aarB1bar-aarB2片段，载体大小由10.4kb变为9.3kb，将其作为指标进行G001A03bar的筛选(
图11泳道3)。按照以上所述，成功地将目标筛选片段重组到可以对植物进行转化的载体中。
实施例20 筛选的基因组DNA克隆的解析对筛选的基因组DNA片段两端的280～500碱基的碱基序列进行研究。结果通过与表1至9以及图3中各种的基因组DNA片段相对应的序列编号来显示。另外，这些片段可通过PCR法来检出，PCR用引物对(primer pair)的序列示于下表31。
表31-1
被筛选的、来自Oryza rufipogon基因组的基因组DNA片段的例子以及可检测其的PCR用引物对

表31-2

表31-2

实施例21 将筛选的基因组DNA片段导入到植物中通过实施例2、实施例6或者实施例7中记载的方法，将实施例3～14中筛选的基因组DNA片段导入至稻、玉米以及烟草中。与实施例3～14同样评价所得的转化植物以及其后代植物。在这些性状之中，对于1个或者多个性状，筛选产生变异的转化植物以及其后代植物。再筛选导入至筛选植物中的基因组DNA片段，作为在作物中可带来有益于农业变异的基因组DNA片段。二次筛选的结果筛选出，再次导入植物也被确认可带来有益于农业的变异的基因组DNA片段、对其它植物也被确认可带来有益于农业的变异的基因组DNA片段。因此，与仅仅1次筛选的情况相比，可以筛选出价值更高的基因组DNA片段。
这样筛选的基因组DNA片段的例子示于表32表32

序列表<110>日本烟草产业株式会社(Japan Tobacco Inc.)<120>基因组DNA片断的筛选方法<130>YCT-990<160>162<210>1<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A029B04 FDNA片断A029B04的一个末端。
<400>1tcgaatttga ccatgagata cagatatgaa tcggtagaat cattataagc atgattactg60attcttaaaa agatgttgac aaatccagat tcccaattcc tcgcaggcct aatttaattt120tcccccatgg cacagggcca gcgaggtcga tcaatcacta tgggagccat actattgtag180aagttctcaa tgagatattt gcaagcaatg tggcagaact ctctgtgcag atagtgaagg240tagctctgcc atgtacacag gagtgaggtg atgaaccagc accctgtgtt tttaacaact300agataaggtg tttggcttct attgtagagc tgcatggcat atatatattt agtagaagta360aacatgcagt acattttcag tacacaagca tttttttctt 400<210>2<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A029B04 RDNA片断A029B04～A029B04 F的另一个末端。
<400>2tcgagctaat taactagcca agtgtagggt tgggagacat ctggatatca cttctgacgt60tttcctatgt gtaaactact gagatttggt atggcagttt ctgtggcact tgcacaagga120
ccagttttat tcctccttga actgtaatta accacctttt tcaccgacct tcctttcgag180tagctagaga catttctaca tgctcgaatt aattagttaa tgctaggaac tggatcccta240tttttgagtt acagaagttg ctagctactc tgttcttagt ttctcacgga gtgcagctag300ctagcttcga taaacagctc aaaaaacaga aatttagtcc tggcaaatgt atgtgccaaa360cttaatgcat gagaatatgt ttttttttct catgttactt 400<210>3<211>300<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A028C04 FDNA片断A028C04的一个末端。
<400>3tcgattaaga cagcaggacg gtggtcatgg aagtcgaaat ccgctaagga gtgtgtaaca60actcacctgc cgaatcaact agccccgaaa atggatggcg ctgaagcgcg cgacccacac120caggccatct gggcgagcgc catgccccga tgagtaggag ggcgcggcgg ccgccgcaaa180acccggggcg cgagcccggg cggagcggcc gtcggtgcag atcttggtgg tagtagcaaa240tattcaaaat agaactttga aggccgaaga ggagaaaggt tccatgtgaa cggcacttgc300<210>4<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A028C04 RDNA片断A028C04～A028C04 F的另一个末端。
<400>4tcgagggcgt tgcgcccccg atgcctctaa tcattggctt tacccgatag aactcgtaat60gggctccagc tatcctgagg gaaacttcgg agggaaccag ctactagatg gttcgattag120tctttcgccc ctatacccaa gtcagacgaa cgatttgcac gtcagtatcg cttcgagcct180ccaccagagt ttcctctggc ttcgccccgc tcaggcatag ttcaccatct ttcgggtccc240gacaggcgtg ctccaactcg aacccttcac agaagatcag ggtcggccag cggtgcggcc300cgtgagggcc tcccgctcgt cagcttcctt gcgcatccca ggtttcagaa cccgtcgact360cgcacgcatg tcagactcct tggtccgtgt ttcaagacgg 400
<210>5<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A048F12 FDNA片断A048F12的一个末端。
<400>5tcgatgtagt cctcctcgag gccgaggctg acagagatgg cgccgagaag ccggagcccc60agttgccgga cttctcggca gtacgtgctc ataatctctc tgcatgccag gaaaaagtgc120aacggaaaat taagcgtcca cgccttaatt ttggcgtttt actgaaacta gttgctgtcc180tggacttcag ctagcttgat tttactccag cacattggat tttggaatta acagacgaag240taggagaccg atgaagaatc ggtccccttc tttttgcgag gtcaagggtg cggtttacct300tttccacgat ttgtctcgag taaaaatctc gcaagttcat gcatgtctct ggtagggtga360ttagtcttct acgtgattga actgtattgc tcggttgttg 400<210>6<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A048F12 RDNA片断A048F12～A048F12 F的另一个末端。
<400>6tcgagtggtc ggcgtccccc ggccgggctc catacggctg gccacgggcg acggcactga60gctgcctaac ccgtggaaca tcgaacacct tcgtcgcttc tacccctgag gggggggtcg120ggtgtcaggt ttcgggctcg ggccaacccc gcaccccctc gggcgtgcag ggttggccgg180gggctgccac acatgcacat tcttatttct cttatttcag tatttcaata aaagcagttt240caatttccta aaggctgtat ctgtgctgtt gtttcttttg aagaatcttg acttgaaata300ggtcactcgt gctcaatcct gccctcgggg gctcgggtcg gctaaaatcg ccaaacgggg360cccagaaccg agccgtgccc cggggcatgg tgaactccgg 400<210>7<211>400
<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A049A01 FDNA片断A049A01的一个末端。
<400>7tcgaactaac gctaacaacg tgcagaaaat ctccctgcat ctcgtgatgg ttcattggat60cgtagtgggc tccaataagt ggggcttcca ggcccatctt gctggggccc aatagtaccg120aaaacgaaag tagcaccaag cttccatgca cgacgacaga aacgagcgat gacattgttg180tttctttggg aagaaggaca acacaaccga tccgttagct tgtccatttc gaccctaagt240ggtgcaaaat gattggagaa ttagtcacca aaataaataa ttgtactagt tctaagttct300gataacacaa ctagtgacca accatgacta gttctttaga gatgggtttc agattttcag360tacagagccg acgcaagttc agtgttcaga tgcgccaaat 400<210>8<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A049A01 RDNA片断A049A01～A049A01 F的另一个末端。
<400>8tcgagtgcca tcctcttctc aatgagagta accattgaaa ttctaacatc tattccatca60taaattcttg tttggagcag ctgttttggt cttgacaatt aaaacgcgtg ttaagaaaaa120caccgctctt tctattacaa tattttgctg tgggatttcc ctgattaata ccatatgaac180ttttatctta catattgcat tgtcttcatc gccaaaagtg agtgactttc agttttcttt240ttctatatat gcagcacaga tgattttgtt ttagaacgat atgatacaga gataacaacc300gaatcaaccc catttgctat tgcacttgca aaacatttgc actctgttgg cgctaagatg360tatggagcat tctggtgttc tcattgtaac gaacaaaaac 400<210>9<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon
<220>
<223>A046A06 FDNA片断A046A06的一个末端。
<400>9tcgaactacc gagctccccc taatcatttc gtcttccaag aagacgacgt gtctcgtttc60tacaaacttt gtataattgt ttggataata gaaacgataa ccttttgatc tttcaggata120gcgaataaaa tggcagctga ctattttggg atccaatttc caaggtttgg gttaaatatt180ttagcctcta caggactccc ccacacatgg aggtgagcta gcgagggtac tcttcccgtc240catagctcat acagtgtttg ggcaccgatt tgcttggaac tctgttgagg atatgaatgg300cggtttttaa tgtctctatc cataaaccca atggtagagt ggagtagctc atcatgctgc360gcaccatatc cataagggta cggttacgcc tttcagctac 400<210>10<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A046A06 RDNA片断A046A06～A046A06 F的另一个末端。
<400>10tcgaacttgt cttccaattt gcgtacctct tgtcgatatg ccatcatgtt gtcgtcaagg60caggaccact ctttcataac ttggttgaca actagctgtg aatcgcctcg aactattaga120cgctttatcc ctagagaaat tgcgatccgc agtccatgga ggagcgcctc gtactcggcg180acgttgtgag acgccgaaaa atgtatccaa agcacatagc ttaatctttc tccagtcggg240gaaattaaaa ccactcctgc tccagtgccc gaaagtcgct tcgacccgtc gaaatgcata300gtccagtgct caatcttctc cgcgggggta tcctcctggc actcggtcca ttcggcgaca360aaatcagcta acgcttggga cttgattgaa gttcggggtt 400<210>11<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A045B09 FDNA片断A045B09的一个末端。
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<223>A045B09 RDNA片断A045B09～A045B09 F的另一个末端。
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ccattggcca gaggctgttc accttggaga cctgatgcgg ttatgagtac gaccgggcgt180ggacggtact cggtcctccg gattttcaag ggccgccggg ggcgcaccgg acaccgcgcg240acgtgcggtg ctcttccggc cgctggaccc tacctccggc tgaaccgttt ccagggttgg300cgggccgtta agcagaaaag ataactcttc ccgaggcccc cgccggcgtc tccggacttc360ctaacgtcgc cgtcaaccgc cacgtcccgg ctcgggaaat 400<210>14<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
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tacgagttct atcgggtaaa gccaatgatt agaggcatcg ggggcgcaac gccctcgacc360tattctcaaa ctttaaatag gtaggacggc gcggctgctc 400<210>16<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
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<213>Oryza rufipogon<220>
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<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A009F06 FDNA片断A009F06的一个末端。
<400>35tcgagtttga ttcggattcg tttttccccg aagtttcctt ctcgccgccg gtcgccgtgg60gcctccgtcg ccgcttgcta gcccctttat aaggatcccc ggtgtctcct ctacccgccg120ccaccctcgc cttcgcctct cgccgccgcc agagccctag cgccgtgcaa ccttgcgccg180ccgtcgccgc cgtcgctcca atcgtgcgcc gccgtcgctc cagccgtcgc cgtcgctcgg240gaagaccgtc atcgtggtcg ccgtcgcgtc gccgtcctcg tccgcccctt cgccgtcgcc300ggagatcgcc ggagcgtcat cgccgccgtc gacccgaaga gcttcgccgt ttcctcctcg360tcgccgtcac cgtccgttgc ctctccgccg tcgctttggt cgtcggtgag ttcgccgtgc420cgtccgctac ccgttggtgc cttccgtttg cgtcctcgcg ccgccgcccg agccgtccgc480tccgccgagc cgccgccgcc500<210>36<211>500<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A009F06 RDNA片断A009F06～A009F06 F的另一个末端。
<400>36tcgaatagcc gtgcccgcgg ttatgggcgg gtctaacaat gtctttcgtg attagtctca60cccttctcac catagtaaat gatgctataa ttggtaataa tttgattagc tcctggtttg120gaatggaata ttcctggttt ggagatagaa ctgtgcagcc gggatggttg ttcagattgg180ttgggcctat acaacagggg atgttgtata gcgttggatt aatactgctt aattaatatt240taactgtttt aaattctcaa atgtttgcta aatgctgctt ttgcaaatgg agccctatta300tgccatcctt tgttatcctg tgcacttgca tatttgctgc gtggcttgct gagtatgtca360tatactcacc ttgcaatcat tcattcagag gaagagttct tcagtgaagc tgatggtgtg420gaggattagg tgtagccttg gtcaagctgc ctgtggagtg gagccgtcta cgctgtttat480tttattttcc gctgcttaga500<210>37
<211>500<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A009E11 FDNA片断A009E11的一个末端。
<400>37tcgagttgga gcacgcctgt cgggacccga aagatggtga actatgcctg agcggggcga60agccagagga aactctggtg gaggctcgaa gcgatactga cgtgcaaatc gttcgtctga120cttgggtata ggggcgaaag actaatcgaa ccatctagta gctggttccc tccgaagttt180ccctcaggat agctggagcc cattacgagt tctatcgggt aaagccaatg attagaggca240tcgggggcgc aacgccctcg acctattctc aaactttaaa taggtaggac ggcgcggctg300ctccggtgag ccgcgccacg gaatcgggag ctccaagtgg gccatttttg gtaagcagaa360ctggcgatgc gggatgaacc ggaagcctgg ttacggtgcc gaactgcgcg ctaacctaga420acccacaaag ggtgttggtc gattaagaca gcaggacggt ggtcatggaa gtcgaaatcc480gctaaggagt gtgtaacaac500<210>38<211>500<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A009E11 RDNA片断A009E11～A009E11 F的另一个末端。
<400>38tcgaggcggc cggccgcggc gcgtcggccg ggccggcttg gccggtggca cgggcccttg60ggggcttgcg cccctaacgt gggtcggggc gggcggcggg cgcaggcgcc gcttgctagc120ttggattctg acttagaggc gttcagtcat aatccggcac acggtagctt cgcgccactg180gcttttcaac caagcgcgat gaccaattgt gtgaatcaac ggttcctctc gtactaggtt240gaattactat cgcggcacgg tcatcagtag ggtaaaacta acctgtctca cgacggtcta300aacccagctc acgttcccta ttggtgggtg aacaatccaa cacttggtga attctgcttc360acaatgatag gaagagccga catcgaagga tcaaaaagca acgtcgctat gaacgcttgg420ctgccacaag ccagttatcc ctgtggtaac ttttctgaca cctctagctt caaactccga480aggtctaaag gatcgatagg500
<210>39<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A008B02 FDNA片断A008B02的一个末端。
<400>39tcatatatta attctctctc tctaaaaata taaaaaaaag gagtctgcgc accgagatct60gccataaaag gtccaagcca taacaagtga gaagctatac ggctcaattc taacataatt120accctaatat agctggctct ttggggtatt tgaatattct ccaagaattc tggtgcattt180accgttattg cttctgtaaa catagtagct aaataatccc aacgtgttac ataaggtaag240tattgtataa tagttcggtt ttccgcgatt ttttccattc ctctgtgtaa atagcctaat300atgggttcac aatcaataac atcttcacca tcgagagtaa cgatcagtcg aagaacacca360tgcattgatg ggtgctgagg gcccatattg actatcatga 400<210>40<211>500<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A008B02 RDNA片断A008B02～A008B02 F的另一个末端。
<400>40tcgaagacgc ggaatggtag tgaatagaga gaaagattct tctggttttc ttgttcctga60aaatattcta tctatctcct agacgccgta gagaattgag aattttcatg tctttcaatt120ctcgtactcg taattggaaa gttacggaag gagatccatc attttgcaat gaaaactaca180taaaaaactc tggacaattt cgaaatcagg ccaagcgtct taatacatat gcaaaaaaat240tcattattgg cccaccattg attagaagat ttaacttgta tgaatcgcta ttggtttgat300acgaataatg gcagttgttt cagtatgtta aggatacaga tgtatccaca attcatttag360agttacttaa tagcctattt cttataccat atctctatcc 400<210>41<211>400<212>DNA
<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A083G04 FDNA片断A083G04的一个末端。
<400>41tcgatggtag gataggggcc taccatggtg gtgacgggtg acggagaatt agggttcgat60tccggagagg gagcctgaga aacggctacc acatccaagg aaggcagcag gcgcgcaaat120tacccaatcc tgacacgggg aggtagtgac aataaataac aataccgggc gctttagtgt180ctggtaattg gaatgagtac aatctaaatc ccttaacgag gatccattgg agggcaagtc240tggtgccagc agccgcggta attccagctc caatagcgta tatttaagtt gttgcagtta300aaaagctcgt agttggacct tgggccgggc cggccggtcc gcctcacggc gagcaccgac360ctgctcgacc cttctgccgg cgatgcgctc ctggccttaa 400<210>42<211>360<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A083G04 RDNA片断A083G04～A083G04 F的另一个末端。
<400>42tcgagttatc atgaatcatc ggatcagcgg gcggagcccg cgtcagcctt ttatctaata60aatgcgcccc tcccggaagt cggggtttgt tgcacgtatt agctctagaa ttactacggt120tatccgagta gcacgtacca tcaaacaaac tataactgat ttaatgagcc attcgcagtt180tcacagttcg aattagttca tacttgcaca tgcatggctt aatctttgag acaagcatat240gactactggc aggatcaacc aggtagcacg tcctccgcga cgagcccgcg ccgtccgacg300cgcgtcgccg ccgcccccgg gtcgggagcg gcggacacgg cggcggccgg gcgggctgtc360<210>43<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A088E02 FDNA片断A088E02的一个末端。
<400>43tcgagcctcc accagagttt cctctggctt cgccccgctc aggcatagtt caccatcttt60cgggtcccga caggcgtgct ccaactcgaa cccttcacag aagatcaggg tcggccagcg120gtgcggcccg tgagggcctc ccgctcgtca gcttccttgc gcatcccagg tttcagaacc180cgtcgactcg cacgcatgtc agactccttg gtccgtgttt caagacgggt cggatgggga240gcccgcaggc cgttgcagcg cagcgccccg aggggcgcgc cagaggcgcg cggtgaccgg300ctgcgccgac gacggctgcc gggggcgcgg agcccccggg ctttggccgc cggcgcggcc360gacaacggtc cacgccccga gccgatcggc ggaccagccg 400<210>44<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A088E02 RDNA片断A088E02～A088E02 F的另一个末端。
<400>44tccaggcgtg gagcctgcgg cttaatttga ctcaacacgg ggaaacttac caggtccaga60catagcaagg attgacagac tgagagctct ttcttgattc tatgggtggt ggtgcatggc120cgttcttagt tggtggagcg atttgtctgg ttaattccgt taacgaacga gacctcagcc180tactaactag ctatgcggag ccatccctcc gcagctagct tcttagaggg actatggccg240tttaggccac ggaagtttga ggcaataaca ggtctgtgat gcccttagat gttctgggcc300gcacgcgcgc tacactgatg tattcaacga gtatatagcc ttggccgaca ggcccgggta360atcttgggaa atttcatcgt gatggggata gatcattgca 400<210>45<211>400<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A089F12 FDNA片断A089F12的一个末端。
<400>45tcgagcagtc cgccggcagc cgacgggttc ggggccggga cccccgagcc cagccctcag60
agccaatcct tttcccgaag ttacggatcc gttttgccga cttcccttgc ctacattgtt120ccattggcca gaggctgttc accttggaga cctgatgcgg ttatgagtac gaccgggcgt180ggacggtact cggtcctccg gattttcaag ggccgccggg ggcgcaccgg acaccgcgcg240acgtgcggtg ctcttccggc cgctggaccc tacctccggc tgaaccgttt ccagggttgg300cgggccgtta agcagaaaag ataactcttc ccgaggcccc cgccggcgtc tccggacttc360ctaacgtcgc cgtcaaccgc cacgtcccgg ctcgggaaat 400<210>46<211>360<212>DNA<213>Oryza rufipogon<220>
<223>A089F12 RDNA片断A089F12～A089F12 F的另一个末端。
<400>46tcgaacagcc gactcagaac tggtacggac aaggggaatc cgactgttta attaaaacaa60agcattgcga tggtcctcgc ggatgctgac gcaatgtgat ttctgcccag tgctctgaat120gtcaaagtga agaaattcaa ccaagcgcgg gtaaacggcg ggagtaacta tgactctctt180aaggtagcca aatgcctcgt catctaatta gtgacgcgca tgaatggatt aacgagattc240ccactgtccc tgtctactat ccagcgaaac cacagccaag ggaacgggct tggcggaatc300agcggggaaa gaagaccctg ttgagcttga ctctagtccg actttgtgaa atgacttgag360<210>47<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A029B04 F的正向引物。
<400>47tcgaatttga ccatgagata caga 24<210>48<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A029B04 F的反向引物。
<400>48aagaaaaaaa tgcttgtgta ctga 24<210>49<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A029B04 R的正向引物。
<400>49tcgagctaat taactagcca agtg 24<210>50<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A029B04 R的反向引物。
<400>50aagtaacatg agaaaaaaaa acat 24<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A028C04 F的正向引物。
<400>51tcgattaaga cagcaggacg gtgg 24<210>52<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A028C04 F的反向引物。
<400>52gcaagtgccg ttcacatgga acct 24<210>53<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A028C04 R的正向引物。
<400>53tcgagggcgt tgcgcccccg atgc 24<210>54<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A028C04 R的反向引物。
<400>54ccgtcttgaa acacggacca agga 24
<210>55<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A048F12 F的正向引物。
<400>55tcgatgtagt cctcctcgag gccg 24<210>56<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A048F12 F的反向引物。
<400>56caacaaccga gcaatacagt tcaa 24<210>57<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A048F12 R的正向引物。
<400>57tcgagtggtc ggcgtccccc ggcc 24<210>58<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增DNA片断A048F12 R的反向引物。
<400>58ccggagttca ccatgccccg gggc 24<210>59<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A049A01 F的正向引物。
<400>59tcgaactaac gctaacaacg tgca 24<210>60<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A049A01 F的反向引物。
<400>60atttggcgca tctgaacact gaac 24<210>61<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A049A01 R的正向引物。
<400>61tcgagtgcca tcctcttctc aatg 24<210>62<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A049A01 R的反向引物。
<400>62gtttttgttc gttacaatga gaac 24<210>63<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A046A06 F的正向引物。
<400>63tcgaactacc gagctccccc taat 24<210>64<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A046A06 F的反向引物。
<400>64gtagctgaaa ggcgtaaccg tacc 24<210>65
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A046A06 R的正向引物。
<400>65tcgaacttgt cttccaattt gcgt 24<210>66<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A046A06 R的反向引物。
<400>66aaccccgaac ttcaatcaag tccc 24<210>67<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A045B09 F的正向引物。
<400>67tcgacgacga cgcggcgaag ccga 24<210>68<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增DNA片断A045B09 F的反向引物。
<400>68ccgccgcatc ccgccgtccc cgcg 24<210>69<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A045B09 R的正向引物。
<400>69tcgaggatgc ctgtggagtg gtgt 24<210>70<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A045B09 R的反向引物。
<400>70ccgtggaccg ccgcttcgtt tccc 24<210>71<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A049A07 F的正向引物。
<400>71
tcgagcagtc cgccggcagc cgac 24<210>72<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A049A07 F的反向引物。
<400>72atttcccgag ccgggacgtg gcgg 24<210>73<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A049A07 R的正向引物。
<400>73tcgaaccatc tagtagctgg ttcc 24<210>74<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A049A07 R的反向引物。
<400>74gcttcagcgc catccatttt cggg 24<210>75<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A040D06 F的正向引物。
<400>75tcgacgggtt ctgaaacctg ggat24<210>76<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A040D06 F的反向引物。
<400>76gagcagccgc gccgtcctac ctat24<210>77<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A040D06 R的正向引物。
<400>77tcgagccccc aactttcgtt cttg24<210>78<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A040D06 R的反向引物。
<400>78agcgtatatt taagttgttg cagt24<210>79<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A036A03 F的正向引物。
<400>79tcgaaaatga ccgtcaacaa aacc24<210>80<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A036A03 F的反向引物。
<400>80atcaaaaagg catcatttgg tgag24<210>81<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A036A03 R的正向引物。
<400>81tcgatgcatt gagcagaaag gaat24
<210>82<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A036A03 R的反向引物。
<400>82atattcttcc accaaaaagt atct24<210>83<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A051E08 F的正向引物。
<400>83tcgatgaaga acgtagcgaa atgc24<210>84<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A051E08 F的反向引物。
<400>84atatgcttaa actcagcggg tagt24<210>85<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A051E08 R的正向引物。
<400>85tcgatgcgag agccgagata tccg24<210>86<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A051E08 R的反向引物。
<400>86cccgtcgctc ctaccgattg aatg24<210>87<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A023D09 F的正向引物。
<400>87tcgacgccat actgatgagc aatg24<210>88<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A023D09 F的反向引物。
<400>88gttgatgctc ttctctgcgt catc24<210>89<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A023D09 R的正向引物。
<400>89tcgaatgcca gttaaagtga tgcc24<210>90<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A023D09 R的反向引物。
<400>90ctactgcgcc gagcccacgc tgag24<210>91<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A030B02 F的正向引物。
<400>91tcgaagcttc acagttgata act 24<210>92
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A030B02 F的反向引物。
<400>92gaggtttcga acccaggttg tcta24<210>93<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A030B02 R的正向引物。
<400>93tcgaggtgaa ctattttttt tctt24<210>94<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A030B02 R的反向引物。
<400>94ggccctcggg gccgaggcgg gagt24<210>95<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增DNA片断A043F04 F的正向引物。
<400>95tcgaccacct tctcagaagc aaaa24<210>96<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A043F04 F的反向引物。
<400>96aacatccaac agattgagac act 24<210>97<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A043F04 R的正向引物。
<400>97tcgatagcac cattgggact atac24<210>98<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A043F04 R的反向引物。
<400>98
tgattcgaac aaatttaggg tatt24<210>99<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A049E02 F的正向引物。
<400>99tcgattaaga cagcaggacg gtgg24<210>100<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A049E02 F的反向引物。
<400>100cccggctcgg gaaatcttaa cccg24<210>101<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A049E02 R的正向引物。
<400>101tcgaccgaat cgggttttcg gtcg24<210>102<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A049E02 R的反向引物。
<400>102ggatggccgg gctgccacgc gcac24<210>103<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A010C09 F的正向引物。
<400>103tcgaccgaat cgggttttcg 20<210>104<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A010C09 F的反向引物。
<400>104accgaaaact gtgtgcgagc 20<210>105<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A010C09 R的正向引物。
<400>105tcgatgtcgg ctcttcctat 20<210>106<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A010C09 R的反向引物。
<400>106gggctggatc tcagtggatc 20<210>107<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A011C02 F的正向引物。
<400>107tcgagttagg gatttgattg 20<210>108<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A011C02 F的反向引物。
<400>108aatttgtaat gctgcgatct 20
<210>109<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A011C02 R的正向引物。
<400>109tcgaaggtgg tgtcaaatta 20<210>110<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A011C02 R的反向引物。
<400>110gttgtcgctg ccacctgatc 20<210>111<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A010B03 F的正向引物。
<400>111tcgaacagcc gactcagaac 20<210>112<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A010B03 F的反向引物。
<400>112cccggatcgg cccgagggac 20<210>113<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A010B03 R的正向引物。
<400>113tcgaaggatc aaaaagcaac 20<210>114<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A010B03 R的反向引物。
<400>114ggcttggcgg aatcagcggg 20<210>115<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A009F06 F的正向引物。
<400>115tcgagtttga ttcggattcg 20<210>116<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A009F06 F的反向引物。
<400>116ggcggcggcg gctcggcgga 20<210>117<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A009F06 R的正向引物。
<400>117tcgaatagcc gtgcccgcgg 20<210>118<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A009F06 R的反向引物。
<400>118tctaagcagc ggaaaataaa 20
<210>119<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A009E11 F的正向引物。
<400>119tcgagttgga gcacgcctgt 20<210>120<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A009E11 F的反向引物。
<400>120gttgttacac actccttagc 20<210>121<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A009E11 R的正向引物。
<400>121tcgaggcggc cggccgcggc 20<210>122<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增DNA片断A009E11 R的反向引物。
<400>122cctatcgatc ctttagacct 20<210>123<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A008B02 F的正向引物。
<400>123tcatatatta attctctctc tcta24<210>124<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A008B02 F的反向引物。
<400>124tcatgatagt caatatgggc cctc24<210>125<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A008B02 R的正向引物。
<400>125tcgaagacgc ggaatggtag tgaa24<210>126<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A008B02 R的反向引物。
<400>126ggatagagat atggtataag aaat24<210>127<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A083G04 F的正向引物。
<400>127tcgatggtag gataggggcc tacc24<210>128<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A083G04 F的反向引物。
<400>128ttaaggccag gagcgcatcg ccgg24<210>129
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A083G04 R的正向引物。
<400>129tcgagttatc atgaatcatc ggat24<210>130<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A083G04 R的反向引物。
<400>130gacagcccgc ccggccgccg ccgt24<210>131<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A088E02 F的正向引物。
<400>131tcgagcctcc accagagttt cctc24<210>132<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增DNA片断A088E02 F的反向引物。
<400>132cggctggtcc gccgatcggc tcgg24<210>133<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A088E02 R的正向引物。
<400>133tccaggcgtg gagcctgcgg ctta24<210>134<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A088E02 R的反向引物。
<400>134tgcaatgatc tatccccatc acga24<210>135<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A089F12 F的正向引物。
<400>135
tcgagcagtc cgccggcagc cgac24<210>136<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A089F12 F的反向引物。
<400>136atttcccgag ccgggacgtg gcgg24<210>137<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A089F12 R的正向引物。
<400>137tcgaacagcc gactcagaac tggt24<210>138<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增DNA片断A089F12 R的反向引物。
<400>138ctcaagtcat ttcacaaagt cgga24<210>139<211>22
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR1的载体区域引物<400>140ctgaaggcgg aaacgacaat tg 22<210>140<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR3的载体区域引物<400>140aactgcactt aaacaagtgt ac 24<210>141<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR1的基因组DNA片断AS4特异性引物<400>141gattccgacc tctacacgaa caac 24<210>142<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR1的基因组DNA片断AS8特异性引物<400>142agaaacccta gccgtcactt ccct 24<210>143<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR1的基因组DNA片断AS19特异性引物<400>143tcaagtcatt tcacaaagtc ggac 24<210>144<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR1的基因组DNA片断AS20特异性引物<400>144gcttagaggt gaaaatggta acgg 24<210>145<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR1的基因组DNA片断AS22特异性引物<400>145ttctgtcctt gttcgatttg tcag 24
<210>146<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR1的基因组DNA片断AS27特异性引物<400>146ccggattcac cgtggtacga aagg 24<210>147<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR1的基因组DNA片断AS28特异性引物<400>147ttccaattac cagacactaa agcg 24<210>148<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR1的基因组DNA片断AS30特异性引物<400>148tggcaccaga cttgccctcc aatg 24<210>149<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>用于PCR3的基因组DNA片断AS4特异性引物<400>149gtacggcctg ggtcactcac tgtc 24<210>150<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR3的基因组DNA片断AS8特异性引物<400>150tcatcatcct gttatctaga ctcc 24<210>151<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR3的基因组DNA片断AS19特异性引物<400>151tacttattcc gtgagtcgga agcg 24<210>152<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR3的基因组DNA片断AS20特异性引物
<400>152tccagtgtta tgatgtttgg gctg 24<210>153<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR3的基因组DNA片断AS22特异性引物<400>153aactcatctt taatcccagt ttgc 24<210>154<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR3的基因组DNA片断AS27特异性引物<400>154taacgccata aacaagtgtc actc 24<210>155<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR3的基因组DNA片断AS28特异性引物<400>155gaactgtgaa actgcgaatg gctc 24
<210>156<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR3的基因组DNA片断AS30特异性引物<400>156aaatccacac gactctcggc aacg 24<210>157<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR2的基因组DNA片断AS4的中央部分特异性引物<400>157tgggctccag cagaaacgaa ccct 24<210>158<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR2的基因组DNA片断AS4的中央部分特异性引物(反向)<400>158cttatattta ggaacggagt gagt 24<210>159<211>22<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR2的基因组DNA片断AS8的中央部分特异性引物<400>159aagcgaaggc accccttcac at 22<210>160<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR2的基因组DNA片断AS8的中央部分特异性引物(反向)<400>160acgaggagcc cgacaaggag ac 22<210>161<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR2的基因组DNA片断AS22的中央部分特异性引物<400>161tgaaatacca ctcatgaact tccg 24<210>162<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于PCR2的基因组DNA片断AS22的中央部分特异性引物(反向)<400>162
attatctgtt gtgtccgaaa tgtg 2权利要求
1.能为植物带来农业上有益变异的基因组DNA片段的筛选方法，其特征在于，包括以下工序(1)从植物制备基因组DNA，使用克隆载体，构建基因组DNA文库；(2)将基因组片段分别导入到植物中，制成转化植物，其中该基因组片段被包含在构成基因组DNA文库的多个基因组克隆的每一个中；(3)栽培转化植物或者其后代植物，筛选在表型上产生可有益于农业的变异的植物；(4)在工序(3)所筛选的植物中，筛选工序(2)中导入的基因组DNA片段作为目标基因组DNA片段；(5)根据情况，将在工序(4)中筛选的基因组DNA片段的全部或者一部分导入至植物中，重复工序(3)以及(4)，在每次重复时，筛选可向植物赋予表型上有益于农业变异的基因组DNA片段，作为目标基因组DNA片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，筛选的基因组DNA片段的大小在可导入到克隆载体的可能大小范围内，且在1kb或1kb以上。
3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其中，工序(2)包括向植物细胞或者组织的基因组中导入基因组片段、从该植物细胞到植物体的再生、栽培再生植物的各个工序。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其中，向植物细胞或者组织的基因组中导入基因组DNA片段是通过选自生物导入法、物理导入法、化学导入法的方法来进行。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的筛选方法，其中，在植物中可有益于农业的变异是指，与没有变异的植物相比，给在通常的栽培条件下植物体以及其含有成分的至少一部分带来大小或量增大或减少的变异，或者带来其生长速度增大的变异，或者带来抗病虫害的变异。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的筛选方法，其中，在植物中可有益于农业的变异是指，与没有变异的植物相比，在向植物供给比通常的栽培条件更多胁迫的栽培条件下，给植物体以及其含有成分的至少一部分带来大小或量增大或减少的变异，或者带来其生长速度增大的变异，或者带来抗病虫害的变异。
7.根据权利要求5或6所述的筛选方法，其中，在工序(2)中转化的植物与在工序(1)中成为基因组DNA供给源的植物是同种的植物。
8.根据权利要求5或6所述的筛选方法，其中，在工序(2)中转化的植物与在工序(1)中成为基因组DNA供给源的植物是异种的植物。
9.根据权利要求7或8所述的筛选方法，其中，根据情况，在工序(5)中导入基因组DNA片段的植物与在工序(2)中转化的植物是同种的植物。
10.根据权利要求7或8所述的筛选方法，其中，根据情况，在工序(5)中导入基因组DNA片段的植物与在工序(2)中转化的植物是异种的植物。
11.根据权利要求9或10所述的筛选方法，其中，根据情况，将在工序(5)中导入基因组DNA片段的植物，是在与在工序(2)中转化植物相同的栽培条件下进行栽培。
12.根据权利要求9或10所述的筛选方法，其中，根据情况，将在工序(5)中导入基因组DNA片段的植物，是在与在工序(2)中转化植物不同的栽培条件下进行栽培。
13.在能为植物带来农业上有益变异的基因组DNA片段的制造方法，其特征在于，包括培养含有克隆载体的大肠杆菌的工序，该克隆载体含有通过权利要求1～12中任一项所述方法筛选的基因组DNA片段，以及在大肠杆菌中制备含有扩增的基因组DNA片段的克隆载体的工序。
14.基因组DNA片段的制造方法，其特征在于，将通过权利要求1～12中任一项所述的方法筛选的基因组DNA片段作为模板，通过生物化学的扩增方法进行扩增。
15.DNA片段的制造方法，其包括将通过权利要求13或14的方法所制造的基因组DNA片段进行限制性降解的工序。
16.通过权利要求13～15中任一项所述的方法制造的DNA片段。
17.具有可有益于农业的变异的植物的制造方法，其包括将可带来有益于农业变异的基因组DNA片段导入到植物中的工序，该基因组DNA片断是通过具有如下特征的方法制造的该方法包括培养含有克隆载体的大肠杆菌的工序，该克隆载体含有通过权利要求1～16中任一项所述方法筛选或者制造的基因组DNA片段，以及在大肠杆菌中制备含有扩增的基因组DNA片段的克隆载体的工序。
18.根据权利要求17所述的具有可有益于农业的变异的植物的制造方法，其中，将可带来有益于农业变异的基因组DNA片段导入至植物的工序包括向植物细胞或者组织中导入基因组片段、从该植物细胞到植物体的再生、栽培再生植物的各个工序。
19.根据权利要求18所述的植物的制造方法，其中，向植物细胞或者组织中导入基因组DNA片段是通过选自生物导入法、物理导入法、化学导入法的方法来进行。
20.根据权利要求17～19中任一项所述的植物的制造方法，其中，导入有可带来有益于农业变异的基因组DNA片段的植物，与该基因组DNA片段的来源植物是同种植物。
21.根据权利要求17～19中任一项所述的植物的制造方法，其中，导入有可带来有益于农业变异的基因组DNA片段的植物，与该基因组DNA片段的来源植物是异种植物。
22.根据权利要求17～21中任一项所述的方法制造的植物。
23.在能为植物带来农业上有益变异的基因组DNA片段的分析方法，其特征在于，包括培养含有克隆载体的大肠杆菌的工序，该克隆载体中含有通过权利要求1～12中任一项所述的方法所筛选的基因组DNA片段，以及在大肠杆菌中制备含有扩增的基因组DNA片段的克隆载体，并解析在克隆载体中的植物基因组DNA片段的核苷酸序列的工序。
24.DNA片段的分析方法，其包括将通过权利要求1～12中任一项所述的方法所筛选的基因组DNA片段进行限制性降解的工序。
25.DNA片段的分析方法，其特征在于，将通过权利要求1～12中任一项所述的方法所筛选的基因组DNA片段作为模板，通过生物化学的扩增法来进行扩增。
26.根据权利要求24或25所述的分析方法，其中，分析包括解析基因组DNA片段的限制性降解产物或者通过生物化学扩增法的扩增产物的核苷酸序列的工序。
27.将通过权利要求1～12中任一项所述的方法所筛选的基因组DNA片段作为植物品种改良中的标记来使用的方法。
28.根据权利要求27所述的方法，其包含把通过权利要求1～12中任一项所述方法筛选的基因组DNA片段作为标记，将在基因组DNA中具有该标记的植物个体判断为适于品种改良，而没有该标记的植物个体判断为不适于品种改良。
29.根据权利要求28所述的方法，其包含从后代植物个体中制备基因组DNA，具有上述基因组DNA片段的后代植物判定为可使用于品种改良的进一步工序中，其中所述后代植物是将已知具有通过权利要求1～12中任一项所述方法所筛选的基因组DNA片段的植物与要品种改良的植物杂交所得的后代植物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，已知具有通过权利要求1～12中任一项所述方法所筛选的基因组DNA片段的植物是权利要求22所述的植物。
全文摘要
本发明提供了在植物中导入可进行有益于农业的植物的改良的基因组DNA片段的筛选方法。本发明的方法包括以下工序(1)从植物制备基因组DNA，使用克隆载体，构建基因组DNA文库；(2)将基因组片段分别导入到植物中，制成转化植物，其中该基因组片段被包含在构成基因组DNA文库的多个基因组克隆的每一个中；(3)栽培转化植物或者其后代植物，筛选在表型上可产生有益于农业变异的植物；(4)在工序(3)所筛选的植物中，筛选工序(2)中导入的基因组DNA片段作为目标基因组DNA片段。
文档编号A01H5/00GK1898382SQ20048003893
公开日2007年1月17日 申请日期2004年10月22日 优先权日2003年10月24日
发明者久保友明, 小鞠敏彦, 宇佐美悟, 高仓由光, 樋江井佑弘, 石田佑二 申请人:日本烟草产业株式会社