专利名称：山羊葡萄糖转运载体4基因及其重组表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及山羊葡萄糖转运载体4基因及其重组表达载体和应用。
背景技术：
葡萄糖是一种极性分子，需要借助于胞膜上的运载蛋白进入细胞内。在哺乳类细胞内有两类葡萄糖转运载体Na+葡萄糖协同转运蛋白和易化葡萄糖转运蛋白(Glut)。参与人体葡萄糖转运的主要的是易化葡萄糖转运蛋白。至今在哺乳类动物体内已发现13种Glut，其中Glut4是一个主要的研究热点。由于葡萄糖是乳腺上皮细胞合成乳糖的主要前体，所以给泌乳动物的乳腺提供葡萄糖是新陈代谢的重点。因为乳糖维持着乳的渗透压，所以乳糖合成速率是影响产奶量的 主要原因。另外，葡萄糖除了是重要的乳糖合成前体，还可以产生ATP、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，也是合成蛋白质、脂肪和核苷酸的前体。一头泌乳牛每产Ikg牛奶需要72g葡萄糖。因此，一头日产奶量40kg的奶牛，它的乳腺每天需要摄入3kg的葡萄糖。事实如此，乳腺摄入的葡萄糖是血糖总量的60 85%。Glut4是胰岛素依赖型蛋白，主要存在于胰岛素敏感的组织中骨骼肌，心肌和脂肪组织，Glut4是这些组织中的主要的葡萄糖运载体。近年来由于葡萄糖钳夹技术的应用，已经证实细胞外膜上葡萄糖载体的含量与细胞葡萄糖最大转运能力呈正相关关系，葡萄糖跨膜转运是骨骼肌利用葡萄糖的主要限速过程。基础状态和胰岛素刺激状态下，葡萄糖利用分别占全身的20 %和70 % 85 %。Glut4在促进葡萄糖的吸收和利用上起了关键限速的作用。尤其是在胰岛素状态下，Glut4起决定性作用。通过增加细胞GLUT4的表达，可以达到促进细胞吸收葡萄糖，增加细胞能量代谢和合成代谢的目的。本发明提供了山羊葡萄糖转运载体4基因GLUT4序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有山羊葡萄糖转运载体4基因的真核表达载体P⑶NA3. 1-GLUT4和含有这种载体的大肠杆菌(E. coli)细胞JMI09/pCDNA3. 1-GLUT4以及稳定转染的山羊乳腺上皮细胞株GMGE/p⑶NA3. 1-GLUT4。利用本发明成果，可以用于构建转基因整合载体，提高山羊乳腺对葡萄糖的摄取能力，增加产奶量。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种山羊葡萄糖转运载体4基因。本发明的另一目的是提供含有该基因的重组表达载体。本发明的又一目的是提供该基因的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种葡萄糖转运载体基因GLUTl，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
所述的基因GLUT4，该基因的编码序列如序列表SEQ ID NO : I中第144-1673位所
示核昔酸。含有本发明所述的GLUT4基因的真核表达载体pCDNA3. 1-GLUT4。含有真核表达载体pCDNA3. 1-GLUT4的大肠杆菌(E. coli)受体细胞JM109/pCDNA3. 1-GLUT4。 本发明所述真核表达载体P⑶NA3. 1-GLUT4稳定转染的山羊乳腺上皮细胞株GMGE/pCDNA3. 1-GLUT4。本发明所述的葡萄糖转运载体基因GLUT4在提高哺乳动物乳腺细胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的应用。本发明所述的真核表达载体P⑶NA3. 1-GLUT4在提高哺乳动物乳腺细胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的应用。有益效果葡萄糖转运载体基因可以提高山羊乳腺上皮细胞的葡萄糖的吸收和乳糖的合成。体外转染山羊乳腺上皮细胞的荧光定量PCR结果显示，稳定转染组(只转染P⑶NA3. 1-GLUT4)的GLUT4表达量高于对照组(正常培养的山羊乳腺上皮细胞)接近55倍。通过测定培养24h和48h的培养基中葡萄糖的含量，24h转染组葡萄糖的吸收量达到1.990±0. 0141yg/yg蛋白，显著高于对照组的1.771±0. 00346 yg/yg蛋白；48h转染组葡萄糖的吸收量达到9. 287±0. 278μ g/μ g蛋白，极显著的高于对照组细胞(I. 99±0· 014μ g/μ g蛋白)。48h转染组乳糖合成量达到178. 679±32· 968ng/y g蛋白显著高于对照组细胞(49. 926±4. 192ng/yg蛋白)。
图I :真核表达载体pCDNA3. 1-GLUT4的质粒图谱图2 :GLUT4基因的克隆图片图3 NheI/HindIII 双酶切 pCDNA3. 1-GLUT4 鉴定4 :转染GLUT4基因的山羊乳腺上皮细胞GLUT4基因相对表达量图5 :转染GLUT4基因的山羊乳腺上皮细胞对葡萄糖吸收的变化图6 :转染GLUT4基因的山羊乳腺上皮细胞乳糖合成量的变化
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。具体涉及的材料和试剂如下羊肌肉组织来自于无感染病史的萨能奶山羊(购自南京溧水种山羊养殖场)，将组织于液氮冷冻，骨架载体 pCDNA3. I ( + ) (Company Invitrogen ；Catalog Number V79020 ；Product pCDNA3. I ( + ) Vector);山羊乳腺上皮细胞(实验室分离);E. coli JM109 (购自大连宝生物，Takara )。试剂TRizol, MLV-反转录酶，rTaq 酶，pMD19_T 载体，Agarose Gel DNAPurification Kit, TaKaRa DNA Ligation Kit 内切酶 Xho I, Not I, KpnI, Cla I等均购自TAKARA公司；0MEGA无内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；脂质体Lipofectamine2000,胎牛血清购自 Invitrogen 公司；DMEM/F12 培养基(货号C12430)购自Gibco公司；青链双抗(购自碧云天)；胰岛素、催乳素、氢化可的松(购自南京生兴生物有限公司)；进口葡萄糖检测试剂盒(Company :Biovisin Catalog Number K606-100Product Glucose Assay Kit)乳糖检测试剂盒(Company :Biovisin CatalogNumber :K624_100Product Lactose Assay Kit),其他试剂均为国产或进口分析纯级。实施例I载体pCDNA3. 1-GLUT4的构建及酶切验证I. 1GLUT4基因的克隆首先匀浆器匀浆肌肉组织样品，然后TRizol法提取总RNA。以萨能奶山羊肌肉织的总RNA为模板，以oligod(T)18引物采用invirtrogen公司的M-MLV反转录酶合成cDNA
第一链。引物设计和合成参照NCBI上的牛GLUT4基因全序列(Bos taurus solute carrier family2 (facilitated glucose transporter)，member4 (SLC2A4)，mRNA)登录号NM174604。用DNASTAR做限制性内切酶分析，用primer5. O设计引物扩增GLUT4基因的CDS区。引物设计如下GLUT4引物上游引物GLUT4-F :5’ -TCTCGCCAGACTCGCACTC-3’ (SEQ ID NO. 3)；下游引物GLUT4-R :5，-TGCTCAGACCACCGTTCCCT-3’ (SEQ ID NO. 4)反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸2min，共30个循环；然后72°C延伸10min，4°C终止。I. 2将GLUT4基因克隆到pMD19_T载体上将PCR扩增的目的条带经胶回收纯化后，与PMD19-T载体连接得到质粒PMD19-T-GLUT4，转化E. coli JM109感受态，挑取菌落做菌落PCR鉴定筛选阳性克隆；筛选出阳性克隆，提质粒PMD19-T-GLUT4，酶切、PCR鉴定，送交上海生工测序。测序结果生物信息学分析显示1837bp的序列包含了 GLUT4中的⑶S部分。I. 3将GLUT4插入到骨架载体pCDNA3. I ( + )的Nhe I和HindIII之间GLUT4基因酶切连接引物上游引物F :5’ -GCTAGCATGCCGTCGGGCTTCCAACA-3’ (SEQ ID NO. 5)下游引物R :5’ -AAGCTTTCAGTCATTCTCATCCGGCCCT-3’ (SEQ ID NO. 6)提取步骤I. 3中含有质粒PMD19-T-GLUT4的大肠杆菌的质粒，使用Nhe I和HindIII内切酶分别酶切质粒pMD19-T-GLUT4和pCDNA3. I ( + )。经切胶回收后，将GLUT4片段与骨架载体P⑶NA3. I ( + )用T4连接酶相连接，如(图2)。I. 4 重组质粒 pCDNA3. 1-GLUT4 的鉴定用克隆GLUT4基因CDS区的引物分别进行PCR扩增检验。同时使用内切酶Nhe I和HindIII对质粒进行酶切鉴定。由图可知载体pCDNA3. 1-GLUT4经Nhe I和HindIII酶切后，切出大小1539p和5428bp的片段，与预期结果一致(图3)。同时进行PCR验证。以上鉴定证实pCDNA3. 1-GLUT4载体构建成功。I. 5转染质粒pCDNA3. 1-GLUT4的提取和纯化将重组质粒P⑶NA3. 1-GLUT4用OMIGA无内毒素质粒提取试剂盒提取和纯化质粒，_20°C保存，用于细胞转染。
实施例2.山羊乳腺上皮细胞的分离和培养(I)准备材料高压后的眼科剪刀(一大一小)，刮毛刀，镊子各两把，小的术齿镊一把，无菌培养皿2个，小青瓶两个。2%的碘酊I瓶，75%的酒精I瓶，加双抗的PBS两瓶。DMEM/F12培养基，添加15%的胎牛血清，EGF10ng/ml, 200ug/ml的双抗。(2)实验步骤①、取材选取两个月左右的小羊，尽量挑选耳组织上血管组织较少的部位用刮毛刀刮毛，先用2%的碘酊棉球擦拭要切取部位，I分钟后用75%的酒精擦拭，用高压消毒后的眼科剪刀，剪取Icm2左右的耳部组织，放人含250u/ml的青链双抗的PBS中，4度浸泡，立即带回实验室(四小时之内)。②、处理将样品移入超净台中，将山羊的皮肤置于无菌培养皿中，用含500IU · mL-1双抗的PBS洗涤2次，剪除毛茬，轻轻刮去表皮组织和皮下组织，保留真皮层，将剩余组织在70%乙醇中浸泡30s，再含200ug/ml的双抗PBS洗涤组织3 5次，然后剪·成Imm3大小的组织块，移入组织培养瓶的底壁上，用吸管将组织块均匀地铺开，小心翻转培养瓶，置于37度、5% CO2培养箱中静置4 6h。在组织块周围开始变干以前加入DMEM培养液，浸没组织块，过夜，第2天补加入2 3mL DMEM培养液，每隔2 3d观察并换液。原代细胞采用DMEM添加15%胎牛血清进行贴壁培养，细胞长成致密单层后，用O. 25%胰酶消化，待大部分细胞变圆时，加培养液终止消化，并反复吹打。因为成纤维细胞消化脱壁比上皮细胞快，在前3代传代经酶消化，待细胞刚变圆即终止消化，只收集脱壁细胞，这样便可得到纯化的成纤维细胞。当细胞生长至70% 80%汇合状态时即可冷冻保存，以备细胞特性分析以及基因转染使用。实施例3.山羊乳腺上皮细胞的转染及稳定转染细胞株的筛选将山羊乳腺上皮细胞接种于60mm孔培养板中，每个板用5ml培养基进行培养，转染前1山待细胞铺满培养皿底的70% 80%时，改用无血清、无抗生素的DMEM/F12培养基洗涤细胞2次，用不含血清的DMEM/F12培养基培养24小时后转染。次日转染按Lipofectamine2000说明书进行转染,脂质体(uL)与质粒(ug)的比例为3 : 2。细胞培养6h后弃去混合液，加入体积分数10%胎牛血清、不含抗生素的DMEM/F12培养基继续培养。第2天，想培养基中加入700 μ g/ml的G418药物，筛选14天。挑去单克隆汇集到24孔培养板中，将G418的浓度降至400 μ g/ml，继续培养和传代，直至6孔培养板。乳腺上皮细胞的转染效率比较低，瞬时转染后检测葡萄糖和乳糖的变化不明显，并且受转染时细胞状态的影响较大。所以我们筛选了稳定转染的山羊乳腺上皮细胞用于检测培养上清中葡萄糖和乳糖的变化。实施例4. pCDNA3. 1-GLUT4稳定转染的山羊乳腺上皮细胞GLUT4基因的表达检测细胞诱导表达及样品处理山羊乳腺上皮细胞和P⑶NA3. 1-GLUT4稳定转染的山羊乳腺上皮细胞分别大量繁殖后，以IXio5的密度接种6孔培养板，分别培养，在细胞涨至50%时加诱导培养基。诱导培养基成分DMEM+10%胎牛血清、胰岛素(10μ g/mL)、催乳素(I μ g/mL)、氢化可的松(20μ g/mL)和1%青链双抗。在诱导后4天,用TRizol提取每孔细胞的总RNA，用MLV-反转录酶反转录成cDNA，进行荧光定量PCR检测GLUT4基因表达量的变化，使用的荧光定量PCR仪为ABI7500，使用的试剂为TAKARA公司的SYBR Premix ExTaq II (TlRNaseH Plus)。荧光定量PCR结果显示，稳定转染组(只转染pCDNA3. 1-GLUT4)的GLUT4表达量高于对照组(正常培养的山羊乳腺上皮细胞)接近55倍(图4)。实施例5.稳定转染的山羊乳腺上皮细胞培养液中葡萄糖吸收和乳糖合成的检测细胞诱导表达及样品处理山羊乳腺上皮细胞和P⑶NA3. 1-GLUT4稳定转染的山羊乳腺上皮细胞分别大量繁殖后，以IXio5的密度接种6孔培养板，分别培养，在细胞涨至50%时加诱导培养基。诱导培养基成分DMEM+10%胎牛血清、胰岛素(10 μ g/mL)、催乳素(1μ g/mL)、氢化可的松(20μ g/mL)和1%青链双抗。在诱导后4天更换新鲜培养基，并在之后的24h和48h分别收细胞培养液上清和细胞蛋白，使用葡萄糖检测试剂盒和乳糖检测试剂盒分别检测培养液上清中的葡萄糖含量和乳糖含量；测定细胞蛋白用于矫正细胞数量。结果显示，24h转染组葡萄糖的吸收量达到1.990±0. 0141yg/yg蛋白，显著高于对照组的I. 771 ±O. 00346 μ g/ μ g蛋白；48h转染组葡萄糖的吸收量达到9. 287±0. 278μ g/μ g蛋白，极显著的高于对照组细胞(I. 99+0. 014 μ g/μ g蛋白)(图 5)。而48h转染组乳糖合成量达到178. 679±32. 968ng/yg蛋白显著高于对照组细胞(49·926±4· 192ng/yg 蛋白)(图 6)。
权利要求
1.一种葡萄糖转运载体基因GLUTl，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根据权利要求I所述的基因GLUT4，其特征在于该基因的编码序列如序列表SEQIDNO. I中第144-1673位所示核昔酸。
3.含有权利要求I所述的GLUT4基因的真核表达载体pCDNA3.1-GLUT4。
4.含有权利要求3所述的真核表达载体P⑶NA3.1-GLUT4的大肠杆菌(E. coli)受体细胞 JM109/pCDNA3. 1-GLUT4。
5.权利要求3所述真核表达载体P⑶NA3.1-GLUT4稳定转染的山羊乳腺上皮细胞株GMGE/pCDNA3. 1-GLUT4。
6.权利要求I所述的葡萄糖转运载体基因GLUT4在提高哺乳动物乳腺细胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的应用。
7.权利要求3所述的真核表达载体pCDNA3.1-GLUT4在提高哺乳动物乳腺细胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，涉及山羊葡萄糖转运载体4基因及其重组表达载体和应用。葡萄糖转运载体基因GLUT1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。含有本发明所述的GLUT4基因的真核表达载体pCDNA3.1-GLUT4。本发明葡萄糖转运载体基因可以提高山羊乳腺上皮细胞的葡萄糖的吸收和乳糖的合成。因此可在提高哺乳动物乳腺细胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中应用。
文档编号C12R1/91GK102899328SQ201210374619
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者庾庆华, 朱立麒, 杨倩, 林 建 申请人:南京农业大学