长链非编码rna loc401317的原位杂交探针、试剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种长链非编码RNA LOC401317的原位杂交探针、试剂及其应用。该长链非编码RNA LOC401317可以用于制备鼻咽癌患者的预后制剂，特别是制备出原位杂交检测法预测鼻咽癌患者预后的试剂盒。通过研究证实LOC401317在鼻咽癌组织中表达下调，低表达LOC401317的鼻咽癌患者比高表达LOC401317的鼻咽癌患者预后差，因此，将LOC401317的表达用于鼻咽癌患者的预后预测，可以为鼻咽癌患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
【专利说明】长链非编码RNA L0C401317的原位杂交探针、试剂及其应 用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA L0C401317的原位杂 交探针、试剂及其应用方法。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌是常见高发的头颈部恶性肿瘤，容易发生颈部淋巴结转移，预后较差。研究 表明，这种肿瘤的发生发展是多基因参与、多步骤、多阶段的复杂过程，其中抑癌基因的失 活与癌基因的激活发挥了关键的作用。
[0003] TP53基因（编码P53蛋白）自1979年被克隆以来，一直是肿瘤分子生物学研究领 域最引人注目的重要抑瘤基因之一。大量的证据表明，TP53基因通过调控一系列信号转导 通路广泛参与了多种恶性肿瘤的发生发展。在细胞受到各种致癌因素的刺激时，P53蛋白 激活并通过转录调控下游关键靶基因的表达，阻滞细胞周期、诱导细胞分化、启动细胞衰老 及凋亡、参与DNA损伤修复维持基因组的稳定、调节能量代谢和抑制肿瘤血管生成，从而阻 止肿瘤的发生发展。已有的研究发现，TP53基因是包括鼻咽癌在内的多种恶性肿瘤中最常 见的突变基因之一，33%?76%的患者存在TP53基因异常。因此，恢复鼻咽癌中TP53基因 功能或逆转其下游信号通路，对鼻咽癌的治疗具有重要的意义。
[0004] 长链非编码 RNAs (long non-coding RNAs, IncRNAs)是一类长度超过 200nt、缺少 特异完整的开放阅读框、无或很少有蛋白编码功能的RNAs分子。最近的研究表明，IncRNAs 通过在表观遗传、转录和转录后水平广泛调节基因的表达，它们参与了生物体生长、发育、 衰老及死亡等重要生命活动的调控。越来越多的研究表明IncRNAs的异常表达或功能缺失 与肿瘤的发生发展密切相关。一些IncRNAs分子在肿瘤的诊断和治疗方面具有重要的意 义，且可以作为肿瘤预后判断新的分子标记。目前，已经克隆的人类IncRNAs基因已超过4 万多个，但绝大部分IncRNA的功能未知。
[0005] 为了寻找鼻咽癌中TP53基因调控的下游IncRNAs及其在鼻咽癌中的应用价值，我 们在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因，收集不同时间点的细胞用新一代IncRNAs芯片检测了 已知IncRNA的表达水平。芯片检测的结果显示，IncRNA L0C401317的表达差异最显著，其 表达明显上调，提示L0C401317可能具有抑瘤基因的作用。
[0006] 我们构建了表达L0C401317的真核表达载体，转染到鼻咽癌细胞株中，在体外培 养系统和裸鼠移殖瘤体内模型中均证实IncRNA L0C401317可明显抑制鼻咽癌细胞的增殖， 抑制肿瘤细胞的生长，因此L0C401317是一个新的抑瘤性IncRNA。将L0C401317真核表达 载体负载到多聚赖氨酸修饰的硅纳米颗粒上制成纳米基因转运体，多聚赖氨酸修饰的硅纳 米颗粒，可保护L0C401317载体免受核酸酶降解，延长作用时间，且有更高的转染效率。
[0007] 进一步地，我们检测了 L0C401317在临床离体肿瘤样本中的表达水平，并分析了 L0C401317表达水平与临床病例资料的相关性。我们从鼻咽癌及相对应的正常对照组织中 抽提RNA后通过逆转录，实时定量PCR，检测了 L0C401317的表达情况，结果显示L0C401317 在鼻咽癌组织中表达下调。我们随后又利用原位杂交的方法，进一步在存档石蜡样本验证 了 L0C401317在鼻咽癌中表达显著下调，因此针对L0C401317的检测制剂可用于鼻咽癌的 辅助诊断，结合临床回访资料进行生存曲线分析发现L0C401317表达低的患者其生存时间 短于该IncRNA表达高的患者，因此针对该IncRNA的检测制剂也可以用于鼻咽癌的预后判 断。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供长链非编码RNA L0C401317的原位杂交探针、试剂及其应用 方法，利用长链非编码RNA L0C401317序列可以制备用于鼻咽癌辅助诊断或者预后预测的 制剂。
[0009] lncRNAsL0C401317的应用方法，用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂， 该长链非编码RNA L0C401317的序列见SEQ NO: 1。
[0010] 所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的制剂为原位杂交检测试剂。
[0011] 所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测L0C401317表达的寡核苷酸 探针，序列如下：
[0012] L0C401317 探针 I : 5 ' -TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3，
[0013] L0C401317 探针 2 :5，-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3，。
[0014] 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。
[0015] 试剂盒中含有上述用于原位杂交检测L0C401317表达的寡核苷酸探针：
[0016] L0C401317 探针 I : 5，-TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3，
[0017] L0C401317 探针 2 :5，-AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3，；
[0018] 阳性对照探针（检测看家基因 GAPDH):
[0019] GAPDH 探针 1 :5' -CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3'
[0020] GAPDH 探针 2 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3'。
[0021] 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物 检测试剂、DAB染色试剂；
[0022] 其它常规生物化学试剂，包括20x柠檬酸钠缓冲溶液（saline sodium citrate, SSC)，硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)，去离子甲醜胺（Deionized Formamide), 多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脱氧腺苷酸（polydeoxyadenylic acid, Poly dA)，变性剪切的娃精 DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)， 酵母转运1?熟(}^381:1：-1?敵，〖1?敵)，二硫苏糖醇（01'1')，5〇1邓罕氏缓冲液（〇6111^1(1丨8'8 solution),磷酸缓冲液（PBS buffer),胃蛋白酶K,牛血清白蛋白（BSA),三乙醇胺 (TEA)，醋酸酐，阻断试剂（Blocking reagent agent)，TNB 缓冲液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 5 % 阻断试剂），TNT 缓冲液（即：ρΗ7· 5 的 0· IM Tris-Cl+0. 15Μ NaCl+0. 05% Tween 20) 〇
[0023] 我们通过原位杂交在鼻咽癌和正常鼻咽上皮存档石蜡组织标本中发现L0C401317 在鼻咽癌中表达显著下调，且L0C401317的表达与预后密切相关，L0C401317表达低的患者 更快地死亡，提示L0C401317可作为鼻咽癌预后预测的分子标志。本发明为鼻咽癌的辅助 诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用 前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为TP53基因可诱导IncRNA L0C401317表达情况；
[0025] A :在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因表达载体0、12、24和48小时后用实时荧光定 量PCR检测TP53基因的表达，TP53基因 mRNA表达水平显著上调；
[0026] B :在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因表达载体0、12、24和48小时后用Western Blotting方法检测TP53基因的表达，TP53基因蛋白表达水平显著上调；
[0027] C :在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因表达载体0、12、24和48小时后用荧光素酶报 告基因活性方法检测TP53基因表达的p53蛋白作为核转录因子的转录活性，p53转录活性 显著上调；
[0028] D :在鼻咽癌细胞系中转染TP53基因表达载体12、24和48小时后利用IncRNA芯 片检测细胞内IncRNA表达水平的变化，本图显示了细胞中转染TP53基因后表达上调最显 著的30个基因；
[0029] E :实时荧光定量PCR技术验证IncRNA芯片的结果，转染TP53基因后细胞中 IncRNA L0C401317的表达显著上调；
[0030] 图2为在鼻咽癌细胞中导入IncRNA L0C401317抑制鼻咽癌细胞的生长情况；
[0031] A :生长曲线实验表明在鼻咽癌细胞中转染L0C401317表达载体后细胞生长速度 减慢；
[0032] B :流式细胞分析仪检测转染L0C401317表达载体后，鼻咽癌细胞周期阻滞于GO/ Gl期；
[0033] C :流式细胞分析仪检测转染L0C401317表达载体后，凋亡的鼻咽癌细胞明显增 多；
[0034] 图3为动物实验证实IncRNA L0C401317抑制鼻咽癌细胞的生长和增殖情况；
[0035] A :在鼻咽癌细胞中转染L0C401317表达载体后，注射到裸鼠腋窝皮下，每周测量 移殖瘤大小，L0C401317可显著抑制鼻咽癌细胞的增殖；
[0036] B :35天后处死裸鼠，大体观察表明重表达L0C401317组移殖瘤最小；
[0037] C :处死裸鼠后取出移殖瘤比较和测量移殖瘤大小，重表达L0C401317组移殖瘤最 小；
[0038] 图4为利用实时荧光定量PCR的方法检测鼻咽癌离体样本中L0C401317的表达情 况；L0C401317在鼻咽癌（T)中的表达比正常对照（N)样本中显著下调；
[0039] 图5为原位杂交检测L0C401317在鼻咽癌及正常鼻咽粘膜中的表达情况；左图为 鼻咽癌组织，右图为正常鼻咽粘膜组织（放大倍数：200X)，L0C401317在鼻咽癌中表达水 平较低；
[0040] 图6为鼻咽癌中L0C401317的表达与患者的预后相关分析；L0C401317表达低或 者不表达的患者更快的死亡。
【具体实施方式】
[0041] 以下结合【具体实施方式】进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0042] 实施例1，在鼻咽癌细胞中导入TP53基因，IncRNA L0C401317表达显著上调
[0043] 1.材料与方法：
[0044] I. 1试剂及试剂盒
[0045] 琼脂糖（agrose)等常用生化试剂、胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限 公司，利用RNeasy? Mini Kit(Qiagen)抽提试剂盒抽提高质量的RNA，Superscript? III (Invitrogen)试剂盒将RNA逆转录成cDNA。荧光素酶报告基因检测试剂盒 Dual-Luciferase Reporter Assay System购自Promega公司。本发明所用的鼻咽癌细胞 HNE2为中南大学肿瘤研究所保存。细胞培养所用RPMI1640培基和胎牛血清，及消化细胞 所用的胰蛋白酶均为美国Gibco公司产品。IncRNA芯片为安捷伦公司产品，该芯片规格为 4*180K，其中 IncRNAs 探针 46506 条。
[0046] ΤΡ53真核表达质粒购自美国Clontech公司，用于检测ρ53蛋白转录活性的 pp53-TA-luc荧光素酶报告质粒购自碧云天公司。
[0047] 实时荧光定量检测引物序列有：
[0048] ΤΡ53 基因上游引物：5' -CCCTTCCCAGAAAACCTACC-3'
[0049] ΤΡ53 基因下游引物：5' -CTCCGTCATGTGCTGTGACT-3'
[0050] 内参看家基因 GAPDH 上游引物：5' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
[0051] 内参看家基因 GAPDH 下游引物：5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'
[0052] L0C401317 上游引物：5，-CTTTCTTGCTGGCATCGTTACC-3，
[0053] L0C401317 下游引物：5 ' -CTTGCCCCTCTAAGAACTTCGT-3 '
[0054] Western blotting检测ρ53蛋白及内参基因 GAPDH表达的抗体购自Cell Signaling Technology 公司。
[0055] I. 2细胞培养与转染
[0056] 将生长状态良好的鼻咽癌细胞HNE2按2 X IO5个细胞/孔接种于6孔板中，将6孔 板置于37°C，5% CO2培养箱中，待培养细胞生长至50-70%密度即可开始TP53真核表达载 体的转染；转染过程如下：
[0057] 在无菌EP管中加入3 μ 1的Iipofectamine 2000于100 μ 1无血清培养基中混勻 静置5min ;将ΤΡ53表达载体加入100 μ 1无血清培养基中；然后与上述包含Iipofectamine 的100 μ 1无血清培养基温和混匀，室温静置30分钟，使DNA与脂质体形成复合体；用 D-Hank' s液洗涤细胞3次；将上述混合物中加入800 μ 1无血清培养基（无抗生素），温和 混匀后加入6孔板中的1个孔；将6孔板置于CO2培养箱中，37°C培养6小时，然后弃上清， 加入完全培养基继续培养12、24和48小时。
[0058] 1. 3实时荧光定量法检测TP53基因和L0C401317的表达
[0059] 鼻咽癌细胞HNE2转染TP53真核表达载体后于0、12、24和48小时收集细胞，抽提 细胞中的总RNA，2 μ g RNA经逆转录成cDNA后，进行实时荧光定量PCR。
[0060] 实时荧光定量PCR反应体系
[0061]
【权利要求】
1. 长链非编码RNA L0C401317的应用方法，其特征在于，用于制备鼻咽癌辅助诊断或 者疗效预测的制剂，该长链非编码RNA L0C401317的序列见SEQ N0:1。
2. 根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的鼻咽癌辅助诊断或者疗效预 测的制剂为原位杂交检测试剂。
3. 根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于， 所述的原位杂交检测试剂中包括用于原位杂交检测L0C401317表达的寡核苷酸探针， 序列如下： L0C401317 探针 1 :5' -TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3' L0C401317 探针 2 :5' -AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3'。
4. 根据权利要求2或3所述的应用方法，其特征在于， 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。
5. 根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于， 试剂盒中含有用于原位杂交检测L0C401317表达的寡核苷酸探针： L0C401317 探针 1 :5' -TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3' L0C401317 探针 2 :5' -AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3' ； 试剂盒中还含有阳性对照探针， GAPDH 探针 1 :5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3' GAPDH 探针 2 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3,。
6. 根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于， 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测 试剂、DAB染色试剂； 其它常规生物化学试剂，包括20x SSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚 脱氧腺苷酸，变性剪切的娃精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，50xDenhardts' s solution, PBS buffer,胃蛋白酶K,牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐， 丁咄缓冲液卬117.5的0.1]\11'1^8-(：1+0.1511恥(：1+0.5%阻断试剂； TNT 缓冲液：pH7. 5 的 0? 1M Tris-Cl+0. 15M NaCl+0. 05% Tween 20。
7. 用于制备鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂的寡核苷酸探针，序列 如下： L0C401317 探针 1 :5' -TTAAAAATAAATCTATGGCAAAGAAGAAGCGGGA-3' L0C401317 探针 2 :5' -AAGGAGGGAAAAATAAAAATCAAACACATTCTGC-3'。
8. 用于鼻咽癌辅助诊断或者疗效预测的原位杂交检测试剂，是包含有权利要求7所述 的寡核苷酸探针的试剂盒。
9. 根据权利要求8所述的原位杂交检测试剂，其特征在于，试剂盒中还含有阳性对照 探针： GAPDH 探针 1 :5'-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3' GAPDH 探针 2 :5, -GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3,。
10. 根据权利要求8或9所述的原位杂交检测试剂，其特征在于， 试剂盒中还含有：地高辛寡核苷酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测 试剂、DAB染色试剂； 其它常规生物化学试剂，包括20x SSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酰胺，多聚腺苷酸，多聚 脱氧腺苷酸，变性剪切的娃精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，50xDenhardts' s solution, PBS buffer,胃蛋白酶K,牛血清白蛋白，三乙醇胺，醋酸酐， 丁咄缓冲液卬117.5的0.1]\11'1^8-(：1+0.1511恥(：1+0.5%阻断试剂； TNT 缓冲液：pH7. 5 的 0? 1M Tris-Cl+0. 15M NaCl+0. 05% Tween 20。
【文档编号】C12N15/11GK104388543SQ201410584311
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】李桂源, 曾朝阳, 熊炜, 龚朝建, 李小玲, 张文玲, 李夏雨, 曾勇, 周鸣, 马健, 彭淑平, 向波 申请人:中南大学