小分子多肽nfibδ的应用
【专利摘要】本发明公开了一种抗肿瘤小分子多肽NFIBΔ的应用。本发明利用生物工程技术，基因重组一段NFIB截短体，为长度231个氨基酸的多肽，能特异性结合SOX2，并阻断内源性全长NFIB与SOX2的相互作用；生物学实验表明该小分子多肽NFIBΔ具有抑制肺癌细胞增殖的作用。本发明为肺肿瘤靶向治疗提供新的实验依据，并且因多肽具有高效、低毒的等特性将在肺癌靶向性治疗的药物研发上具有重要的临床应用价值。
【专利说明】
小分子多肽nfiba的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及小分子多肽NFIB"及其载体和在抗肺癌 增殖中的应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在诸多国家已居主要癌症相关死亡原 因之首。尽管近几年肺癌诊断和多模式治疗包括化疗有了长足的进步，但是预后仍然不容 乐观。肺癌的发生是积累性基因损伤，随着新的肺癌癌基因的不断发现和深入研究，针对相 应基因的靶向药物的治疗也逐渐进入临床。
[0003] 随着生物技术的高速发展，多肽类药物不断涌现。其以原料简单易得、药效高、副 作用低、用途广泛、品种繁多、目标明确、针对性强等特点受到关注，并开始用于癌症的预防 和治疗。随着生物工程技术的迅速发展，生物技术活性物质不断面世，已有不少生物技术药 物应用于临床，目前正在研究的则成倍增加，在这些品种中，大量的均为多肽和蛋白质类药 物。
[0004] 尽管诱导肿瘤的病理机制众多，细胞周期调控的异常和不受控制的细胞增殖是肿 瘤发生的共同机制。以往研究表明，转录因子S0X2在众多肿瘤中高表达，如肺癌、肝癌、乳腺 癌等。它通过直接作用于细胞周期素 Cyclin D1的启动子区，促进Cyclin D1表达，加速细胞 周期进程;而S0X2信号通路的失活，将导致癌细胞增殖的抑制，因此S0X2信号通路失活机制 也是肿瘤研究的热点领域之一。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种抗肿瘤小分子 多肽NFIB\具有抗肺肿瘤增殖的能力。本发明的另一目的是提供上述抗肿瘤小分子多肽 NFIB"的表达载体。本发明还有一目的是提供上述抗肿瘤小分子多肽NFIB%^应用。
[0006] 技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] 小分子多肽册四"在制备抗肺癌药物中的应用；所述的小分子多肽NFIBA，其氨基 酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008] 编码所述的小分子多肽NFIBΛ的基因，其DNA序列如SEQIDN0.2所示。
[0009 ]含有所述的小分子多肽NFIBA的编码基因的载体。
[0010] 所述的载体，将小分子多肽NFIBA的编码基因克隆到p3XFLAG-My C-CMV真核表达载 体，构建出重组表达质粒。
[0011] 有益效果：与现有技术相比，本发明利用生物工程技术，基因重组一段231个氨基 酸多肽的即四"到6.3kb p3XFLAG-Myc-CMV载体。经酶切和序列分析证明重组成功后，将此 重组蛋白多肽转染到肺癌A549细胞中，免疫印迹检测多肽蛋白表达，实现多肽重组。并且研 究表明该多肽能特异性结合S0X2,通过阻断内源性全长分子NFIB与S0X2相互作用，抑制 S0X2信号通路的激活，达到抑制肺肿瘤细胞增殖作用，及抗肿瘤效果。因此，作为高效、低毒 的多肽将在肺癌的药物研发上具有重要的临床应用价值。
【附图说明】
[0012]图1是肺癌组织及细胞中全长蛋白NFIB和S0X2相互作用免疫沉淀结果图；
[0013]图2是小分子多肽NFIBA的编码基因载体质粒图；
[0014]图3是多肽吧四"重组真核表达质粒双酶切电泳鉴定结果图；
[0015]图4是肺癌细胞中不同NFIB截短体多肽与S0X2相互作用免疫沉淀结果图；
[0016] 图5是流式检测肺癌细胞小分子多肽NFIB"转染后对肿瘤细胞周期的影响。
[0017] 图6是CCK8实验检测肺癌细胞小分子多肽NFIBA转染后对肿瘤细胞增殖的影响。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等 译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0019] 实施例1:肺癌组织及细胞NFIB全长蛋白和S0X2免疫共沉淀
[0020] 材料:Protein A/G beads，细胞裂解液，NFIB抗体，S0X2抗体，IgG。
[0021] 方法:新鲜组织小块匀浆;细胞予预冷的0.01M PBS洗涤2次;加入lmL PBS后，细胞 刮冰上刮取细胞，移至1.5mL离心管中，1000gX5min离心收集A 549细胞;加入配置好的500 yL细胞裂解液置于轮转仪上4°C轮转30min彻底裂解细胞，12000g 4°C离心1 Omin，将上清液 转移至新EP管。预澄清加入20yL混匀的Protein A/G beads，在DNA混合仪上转动1小时， 900g离心5min(4°C)，将上清液转移至新离心管，弃珠子。取40-60yL上清液作为Input，加入 等量2 X SDS loading buffer，沸水煮5-10min，离心后冻存。其余部分平分为两等分，分别 加入等量（lyg)Normal IgG或相应抗体，在DNA混合仪上转动2小时(4°C)。在每个离心管中 各加入30yL混勾的Protein A/G beads继续转动2小时。然后900g离心5min(4°C )，弃上清。 加入lmL洗涤缓冲液洗涤珠子。900g离心5min(4°C )，共洗涤3次。最后将40-60yL 2 X SDS loading buffer加入洗好的珠子中，沸水煮5-10min，离心后冻存。连同Input样品一起进行 We stern blot检测。
[0022] 结果如图1所示:在肺癌组织IP和细胞IP中均存在全长蛋白NFIB和SOX 2的相互作 用。
[0023]实施例2:小分子多肽NFIBA克隆载体构建及与S0X2免疫共沉淀鉴定
[0024]本发明提供一种能竞争结合S0X2并抑制肿瘤细胞增殖的小分子多肽，该小分子多 肽由其编码基因设计对应引物，经聚合酶链反应(PCR)合成后插入表达质粒。随后表达载体 转入大肠杆菌BL21，在LB培养基中培养，37 °C下诱导表达。破菌取上清，应用OMEGA公司的 DNA抽提试剂盒获得纯化目的DNA，命名为NFIBΛ;其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示，对应的 编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。之后转染肺癌A549细胞，免疫共沉淀检测NFIB "与5(^2的相互作用。具体构建过程如下：
[0025] 1)表达载体的构建:设计引物，经PCR法扩增693bp DNA目的片段，通过限制性内切 酶Hind 3和BamH 1双酶切后，插入6.3kb p3XFLAG-CMV-13质粒，载体质粒图谱如图2所示。 构建的表达载体经酶切鉴定正确，双酶切电泳鉴定结果见图3。
[0026] 材料:E.coli BL21/DE3工程菌株为本室冻存；T4DNA连接酶为Gibco BRL公司产 品；限制性内切酶为Biolab公司产品；Taq DNA聚合酶为Promega公司产品；质粒提取试剂盒 购自北京博大泰克生物技术公司；Ni离子亲和层析介质购自本元正阳公司；胎牛血清 (FCS)、DMEM培养基、1640培养基为Hyclone公司产品。
[0027] 方法：基因片段的PCR引物由上海桑尼公司合成，引物序列如下：上游引物：5'-GCTAAGCTTACCATGGGACAATCAGGAAGTCCAAGC(含Hind3酶切位点）；下游引物：5 ' -GCTGGATCCGCCCAGGTACCAGGACTGGCT(含Bam H1 酶切位点）。PCR反应体系为:H20 22yL，上游 引物lyL，下游引物lyL，NFIB全长真核表达质粒lyL(GV141载体，上海吉凯基因化学技术有 限公司构建），Taq DNA聚合酶25yL。PCR反应条件为:94°C变性4min，55°C退火，72°C引物延 伸。在基因片段两端设计了Hind III和Bam HI两个限制性酶切位点，双酶切连入p3XFLAG-Myc-CMV 质粒。连接体系为:H201 OyL，T4 连接酶 buff er lyL，T4 连接酶 2yL，Fragment lyL。另设 对照组，不加 fragment，以H20补足体积。PCR机中连接过夜。用连接产物转化JM109感受态 菌。转化步骤为：1) l〇〇yL感受态菌置于冰水，加入DNA 0.5yL，静置30分钟；2)42°C水浴2分 钟；3)冰浴5分钟;4)加入不含抗生素的LB培养基，37 °C下，150RPM震荡培养50分钟。5)将转 化菌接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，置37°C孵箱培养过夜。6)挑选阳性克隆5个，分别 接种于LB液体培养基，置37 °C摇床震荡培养。
[0028] 2)表达载体的鉴定：
[0029]挑取5个生长在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上的单克隆菌落，接种于2.OmL含 Amp的LB液体培养基中，37 °C恒温，250rpm振荡培养过夜约12~14h，用质粒小量抽提试剂盒 少量制备细菌质粒DNA;酶切鉴定含有阳性片段的质粒DNA。酶切电泳结果如图3所示:在挑 选的5个克隆中，其中3号、4号克隆电泳检测到了与目的片段大小一致的DNA条带。并且阳性 质粒送上海桑尼生物技术公司测序。将相应含阳性片段质粒DNA的感受态细胞保种，保存 于-70。。。
[0030]挑取LB琼脂培养板上生长的阳性单克隆菌落，接种于2~3mL LB选择性液体培养 基内，37°C恒温，300rpm剧烈振荡培养过夜（约12~14h);取1.5mL新鲜菌液离心，6，000g X 15min，4°C，弃上清;按照QIAGEN Plasmid Mini Kit说明书进行质粒抽提:将细菌沉淀重悬 于0.3mL Buffer P1，振荡混匀；加入0.3mL Buffer P2,剧烈颠倒混匀4~6次，室温放置 5miη;加入0.3mL预冷的Buf f er P3，立即剧烈颠倒混勾4~6次，冰浴5miη;最大转速离心 10min，弃沉淀;在此过程中用lmL Buffer QBT室温平衡QIAGEN-tip 20柱，让其在重力作用 下完全过柱;将冰浴后的细菌裂解液加入已平衡好的QIAGEN-tip 20柱，让其在重力作用下 过柱；加入2mL Buffer QC室温洗QIAGEN-tip 20柱两次；加入0.8mL Buffer QF室温洗脱 QIAGEN-tip 20柱上吸附的质粒DNA;在洗脱液中加入0.56mL异丙醇吹打混匀后沉淀质粒 DNA，4°C离心，15，000g X 30min，小心弃上清;加入lmL 70%乙醇洗涤质粒DNA，4°C离心，15， 000g X 10min，小心弃上清；37 °C烘箱或超净工作台室温干燥DNA 5~10min，加入适量 Buffer TE溶解质粒DNA，核酸蛋白定量仪定量及测定0D260/280比值来计算质粒DNA的纯 度，分装后-20 °C保存备用。
[0031] 3)截短IP:将NFIBA表达载体转入肺癌A549细胞中，细胞免疫共沉淀证明重组截短 体蛋白相互作用，具体步骤同实施例1。
[0032] 结果如图4所示:免疫沉淀检测NFIB全长(WT)及构建的不同小分子多肽包括截短1 (S1)，及截短2(S2)与ASCL1的相互作用。。结果显示，除了NFIB全长蛋白（WT)能与S0X2蛋白 相互作用外，NFIB截短突变体(S2)，即本发明专利的小分子多肽NFIBA也能与S0X2蛋白发生 相互作用，但是截短1与ASCL1无相互作用。
[0033]实施例3:小分子多肽NFIBA抗肺癌功能的检测
[0034] 1)PI染色流式细胞术证明NFIBli肺癌细胞周期的抑制
[0035]材料:A549细胞，无血清培养基，PBS，胰酶，低速振荡器，碘化丙啶，枪头。
[0036]方法:细胞按每孔4X105个的密度接种于60mm细胞培养皿内，培养过夜后，用不同 的表达质粒(表达NFIB野生全长型的3XFLAG-CMV-13质粒;空载质粒对照;表达231氨基酸小 分子多肽质粒)转染A549细胞，PI染色流式细胞分析检测细胞周 期。胰酶消化收集细胞，并用lmL PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML管中。800rpm 离心5分钟，去除上清，加5mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细 胞于0.5mL PBS中。用低速振荡器边震动边加入5mL预冷的70%乙醇，固定，4°C过夜。次日将 固定好的细胞以l〇〇〇rpm的转速离心5分钟，弃上清，加入4mL PBS清洗一次，用0.4mL PBS重 悬细胞。加入5yL 1?如864(1〇11^/11^)37°(：消化1小时，加入终浓度5〇11^/11^碘化丙啶 (propidium iodide PI)4°C避光染色过夜（或者37°C避光染色1小时），在EPICS XL流式细 胞仪上分析。
[0037] 结果如图5所示，空载对照组细胞（中）停滞在G0/G1期的细胞为70.43%，进入S期 的细胞为21.74% ;与对照空载组细胞相比，表达NFIB野生全长型的A549细胞(左)其细胞增 殖能力明显较强，进入S期的细胞为26.47%，而停滞在G0/G1期的细胞为59.54%;与此同 时，与对照空载组细胞及表达NFIB野生全长型细胞相比，表达截短体小分子多肽NFIB A的细 胞（右）其细胞增殖能力明显下降，进入S期的细胞为5.14%，而停滞在G0/G1期的细胞为 91.50%。该结果表明小分子多肽NFIBlg抑制肿瘤细胞的增殖 [0038] 2)CCK-8实验证明ΝΡΙΒ?Φ制肺癌细胞的增殖
[0039] CCK-8细胞增殖实验:在Α549细胞中，分别转染质粒空载对照，及小分子多肽NFIBa 质粒载体，48h后收集细胞，每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积100yL。每孔换液(CCK-8与培养液的比例为1:10)，37 °C孵育2h，终止培养，酶标仪以490nm波长测量各孔的吸光度 值，每组设四复孔。每24h测定各组CCK-8吸光度值一次，共检测3天，以时间为横坐标，吸光 值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
[0040] 主要方法为:①在96孔板中接种A549细胞悬液（1 ΟΟμL孔），密度为104-105/mL，将 培养板在培养箱预培养过夜(在37°C，5%C02的条件下），刺激细胞。②到达时间点后换液， 向每孔加入l〇〇yL含10yL CCK-8溶液的细胞培养基(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 0D值的读数）。③将培养板在培养箱内孵育1.5-2h。（不同时间点要保持相同的时间)④用酶 标仪测定(测定波长490nm，参照波长630nm)处的吸光度。
[0041]结果如图6所示，与空载对照组相比，转染231氨基酸的小分子多肽NFIBM^细胞增 殖速度下降。
【主权项】
1. 小分子多肽册四"在制备抗肺癌药物中的应用;所述的小分子多肽NFI ΒΛ，其氨基酸 序列如SEQ ID Ν0.1所示。2. 编码权利要求1所述的小分子多肽NFIBΛ的基因，其DNA序列如SEQIDN0.2所示。3. 含有权利要求2所述的小分子多肽NFIBA的编码基因的载体。4. 根据权利要求3所述的载体，其特征在于：将小分子多肽NFIB"的编码基因克隆到 p3XFLAG-Myc-CMV真核表达载体，构建出重组表达质粒。
【文档编号】C12N15/12GK106046134SQ201610388953
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】季俐俐, 沈爱国, 刘琨, 王铄
【申请人】南通大学