专利名称：拟南芥wrky57基因及其制备方法和提高农作物抗干旱能力的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及以转基因植物技术为主的农业生物技术，更具体地说，本发明涉及拟南芥WRKY57基因，同时，还涉及所述基因的制备方法和其在农业上的用途。
背景技术：
WRKY转录调控因子自成一个家族，是由于它们高亲和性地结合在基因启动子区W 盒(C/TTGACT/C)的典型且保守的 WRKY 结构域上(Eulgem T 等，2000，Trends Plant Sci.， 5 199-206)。WRKY基因家族是植物特有的超级基因家族，在其蛋白质N-端含有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和CX 4-5 CXnHXH/C(X为任一氨基酸)，属于锌指型转录调控因子。 WRKY蛋白质能特异地结合靶基因启动子的DNA特异序列TTGACC(W盒)，从而调节基因表达(Eulgem T 等，2000，Trends Plant Sci. ,5 199-206 ；Yu 等 2001，The Plant Cell,13 1527-1539)。目前已知WRKY基因家族各成员基因的分子生物学功能主要参与并调控植物生长发育、形态建成、代谢调控和抗逆境信号转导途径建立。由此推测，随着植物从低等到高等和从水生环境向陆生环境的演化，植物面临着一系列与其生长发育、形态建成、代谢调控和抵抗逆境因子胁迫相关的信号转导途径的建立，WRKY基因家族可能是为了满足植物上述信号转导途径建立所需而迅速扩增。多个WRKY基因家族的成员都参与了对生物胁迫的响应(Yu 等 2001，The Plant Cell，13 :1527_1539 ;Chen 等 2010，Mol Plant-Micro Interactions, 23 =558-565) 近年来，越来越多的证据证明WRKY基因家族成员在各种非生物逆境中起着关键的作用(Miller 等 2008，Physiologia Plantarum, doi 10. 1111/ j. 1399-3054. 2008. 01090. χ. )WRKY53通过跟ESR/ESP的拮抗作用在拟南芥的衰老中起重要作用(Ying Miao 和 Ulrike Zentgraf，2007，The Plant cell，19 :819_830)，WRKY53 组蛋白甲基化引起的表观遗传重编程控制拟南芥的衰老过程(Nicole等2009，The Plant Journal, 58 333-346). WRKY63 (AB03)介导了拟南芥对ABA的响应和对干旱的耐受性(Ren 等2010，The Plant Journal,63 417-429).另外，拟南芥的WRKY75蛋白调节了植物对磷的吸收和对根的发育过程(Ballachanda 等 2007，Plant Physiology, 143 1789-1801). WRKY10 (MINI3)跟HAIKU2的相互作用在调节种子大小过程中起着关键的作用(Luo等 2005，PNAS, 102 17531-17536).拟南芥WRKY44蛋白质协同整合植物体表毛发生和种子外表皮发育等两条信号转导途径的建立(Johnson等，2002，The Plant Cell，14 :1359_1375)。 沙漠豆科植物Retama raetam的WRKY基因协同整合豆科植物抗旱性和种子休眠等两条信号转导途径的建立(Pnueli L.等，2002，Plant J. ,31 :319_330)，而来源于灌丛(Larrea tridentate)的UWRKY21蛋白质作为植物激素ABA信号转导途径的激活因子参与ABA介导的灌丛抗旱性建立(Zou X.，等，2004，J. of Biological Chem.，279 :55770_55779)。但是，迄今为止拟南芥WRKY57基因的功能还没有被真正揭示；关于WRKY57基因提高植物抗干旱能力的研究尚未见报导；该基因的功能还未被阐明。
发明内容
本发明是基于这样一种发现而完成的，本发明人的最新研究工作证实，WRKY57基因的启动子处的一个T-DNA插入突变体Salk-117358能显著提高植物对干旱胁迫的抗性； 高表达相应的拟南芥WRKY57基因既能显著地提高转基因植物对植物逆境相关激素ABA的反应水平，又能提高转基因植物的抗干旱水平。植物生长所处的周围环境时刻多变，经常受到多个逆境因子的协同胁迫，对多个逆境因子胁迫适应性建立无疑是一个综合协同整合过程，并与植物形态发生、发育和形态建成密切相协调。转录调控因子WRKY基因家族在这个综合协同整合过程之中发挥十分重要的分子生物学功能，是植物对多个逆境因子胁迫适应性建立与植物形态建成协调整合的根本机制所在。从目前的基础研究成果来看，转录调控因子WRKY基因能有效地增强植物对逆境因子胁迫的适应能力。因此，利用WRKY基因培育抗逆境能力显著提高的农作物、园艺植物和牧草新品种将成为可能。因此，本发明的目的在于提供一种拟南芥WRKY57基因。本发明的另一目的在于提供所述基因的制备方法。本发明进一步的目的是提供利用所述基因在提高农作物抗旱能力方面的应用。本发明的目的通过下述技术方案予以实现。☆除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。A.本发明提供了一种从拟南芥中分离出的WRKY57基因，该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID Na 1所述；该基因的氨基酸序列如序列表中SEQ ID Na 2所述。B.本发明提供了一种所述的WRKY57基因的制备方法，该方法采用下述步骤(1)将生长3周的Col-O野生型苗，采用Logemarm等(1987)的修改方法，提取总 RNA。(2) DNA 消化采用 Fermentas 公司的 DNaseI 进行 DNA 消化。取 3 μ 1 (约 3-5 μ g) RNA 样品，2·5μ1 DNaseI, 2. 5 μ 1 IOX buffer for DNaseI,0. 5μ 1 RNase inhibitor, 16. 5 μ 1 DEPC-H20,混勻后37°C放置45min后放于冰上。加入2. 5 μ 1 2. 5mM的EDTA，混勻后65°C放置IOmin终止反应。(3)第一链的合成米用 Inventrogen 公司的 Reverse Transcription System Kit。加入1-3 μ 1经消化后的RNA样品，1 μ 1的寡核苷酸，1 μ 1的3’ PCR primer,混勻后于70°C 温浴 5min，然后置于冰上2min 后加入2μ 1 的 5 X first-strand buffer, 1 μ 1 DTT, 1 μ 1 dNTP Mix和1 μ 1的反转录酶，混勻后42°C放置Ihr后放于冰上。(4) cDNA的扩增将2 μ 1第一链合成产物与9 μ 1的脱离子的无菌水， 3μ IlOXExtaq PCR buffer, 2 μ 1 50 X dNTP Mix. 2 μ 1 5' PCR primer, 2 μ 1 3' PCR primer，和 0· 25 μ 1 Extaq Polymerarse 至 30 μ 1，稍离心进行 PCR。取 5μ1 PCR 产物进行琼脂糖胶检测。(5) cDNA的克隆与测定采用试剂盒所提供的载体，16°C连接过夜，转化后提取质粒进行测序。C.本发明提供了利用所述基因在提高农作物抗旱能力方面的应用，主要进行了以下几方面的研究工作(1)本发明获得的拟南芥WRKY57基因，构建了相应的植物表达载体，转化相应的
4农杆菌；(2)利用重组农杆菌介导农作物的外源基因转化，将拟南芥WRKY57基因导入相应农作物，获得相应的转基因植物；(3)进行相应的农作物转基因植物的抗干旱能力评估。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果1.本发明首次成功地从拟南芥中分离出WRKY57基因，并且确定了它的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列；2.通过基因功能分析，揭示了拟南芥WRKY57基因能显著地提高植物的抗干旱能力；3.由模式植物拟南芥内所证实的基因功能，也能有效地在其它重要经济农作物内得到验证和生产应用，预示着广阔的应用前景。
图1是拟南芥WRKY57的核苷酸序列；图2是拟南芥WRKY57的氨基酸序列；图3是高表达WRKY57转基因植株的筛选；图4是对WRKY57抗旱功能的比较；图5是WRKY57植株与野生型植株失水率的比较图；图6是转基因植株的抗旱水平显著提高的效果的图；图7是转基因植株与野生型植株失水率的比较图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例，对本发明作进一步清楚地说明，但它们并不是对本发明保护范围的限定。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出的变形或者是等同的技术手段，均属于本发明的保护范围。实施例1-WRKY57cDNA 的克隆拟南芥总RNA的提取采用Logemann等(1987)的修改方法。根据Ferments公司的 Reverse Transcription System Kit 说明得到 WRKY57cDNA。根据拟南芥 WRKY57 基因核苷酸序列设计相应的引物，进行PCR扩增，获得特异基因片段。随后，将RT-PCR扩增产物克隆到pMDIS-T载体(大连TaKaRa公司)上，并测序和预测氨基酸序列，具体见图1、图2所示。
实施例2——高表达WRKY57转基因植株的筛选将获得的WRKY57全长cDNA克隆到p0CA30中。构建好的质粒转化到农杆菌GV3101 中，采用活体植株农杆菌浸花法进行转化，得到的转基因种子采用含有卡那霉素(50yg πιΓ1)的MS培养基进行筛选获得T1转基因植株，进一步利用Northern blot analysis进行确认。试验结果如图3所示。实施例3
——抗干旱性分析生长4周的WRKY57突变体与野生型拟南芥植株，饱和给水ld，然后连续干旱3周， 试验结果如图4所示。生长4周的高表达WRKY57与野生型拟南芥植株，饱和给水ld，然后连续干旱3周， 试验结果如图6所示。实施例4——叶片蒸腾速率的测定取生长时间和大小相似的野生型和WRKY57突变体植株的叶片剪下后放在称量盘中，置于实验桌上，室内温度为20°C，相对湿度为 50%，自然脱水，分别在0、20、40、60、 80、100、120、140、160、180、200分钟进行称量，试验结果如图4所示。取生长时间和大小相似的野生型和转基因植株的叶片剪下后放在称量盘中，置于实验桌上，室内温度为20°C，相对湿度为 50%，自然脱水，分别在0、20、40、60、80、100、 120、140、160、180、200分钟进行称量，试验结果如图7所示。
权利要求
1.一种从拟南芥中分离出的WRKY57基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID Na 1所述。
2.一种从拟南芥中分离出的WRKY57基因，其特征在于，该基因的氨基酸序列如序列表中SEQ ID Na 2所述。
3.—种权利要求1所述的WRKY57基因的制备方法，其特征在于采用下述顺序的步骤(1)将生长3周的Col-O野生型苗，采用Logemarm的修改方法，提取总RNA；(2)DNA消化采用Fermentas公司的DNaseI进行DNA消化；取3_5 μ gRNA样品，2. 5 μ 1 DNaseI,2. 5 μ 1 IOX buffer for DNaseI，0. 5μ 1 RNase inhibitor,16. 5 μ 1 DEPC-H20，混勻后37°C放置45min后放于冰上；加入2. 5 μ 1 2. 5mM的EDTA，混勻后65°C放置IOmin终止反应；(3)第一链的合成米用Inventrogen公司的Reverse Transcription System Kit ；力口入1-3 μ 1经消化后的RNA样品，1 μ 1的寡核苷酸，1 μ 1的3’PCR primer,混勻后于70°C温浴5min，然后置于冰上2min后加入2μ 1 的5Xfirst-strand buffer, 1 μ 1 DTT，1 μ 1 dNTP Mix和1 μ 1的反转录酶，混勻后42°C放置Ihr后放于冰上；(4)cDNA的扩增将2μ 1第一链合成产物与9μ 1的脱离子的无菌水，3 μ IlOXExtaq PCR buffer, 2 μ 1 50 X dNTP Mix. 2 μ 1 5' PCR primer, 2 μ 1 3' PCR primer,和 0· 25 μ 1 Extaq Polymerarse M 30 μ 1，稍离心进行PCR ；取5 μ 1 PCR产物进行琼脂糖胶检测；(5)cDNA的克隆与测定采用试剂盒所提供的载体，16°C连接过夜，转化后提取质粒进行测序。
4.权利要求1或2所述的WRKY57基因在培育抗旱性植物品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种拟南芥WRKY57基因及其制备方法和应用。本发明的研究揭示了所述的WRKY57基因启动子处的一个T-DNA插入而导致该基因高表达的突变体(Salk_117358)能显著提高植物对干旱胁迫的抗性；高表达相应的拟南芥WRKY57基因也能显著提高转基因植物的抗干旱水平。因此，利用该基因培育抗干旱能力显著提高的农作物新品种将成为可能。
文档编号A01H5/00GK102358904SQ20111033508
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月30日 优先权日2011年10月30日
发明者余迪求, 姜艳娟 申请人:中国科学院西双版纳热带植物园