出GhPH0T2基因的⑶S全长序列；
经过酶切、链接，把目的片段链接到super-1300载体上；
经过测序验证，获得含有目的基因GhPH0T2序列的超表达载体。
[0036]其次，将所构建的含有GhPH0T2序列的超表达载体转化农杆菌GV3101感受态细胞，然后利用农杆菌浸染技术浸染拟南芥phot2突变体，转化GhPH0T2基因，具体过程为:
将上述所构建的含有目的基因(即GhPH0T2基因)的超表达载体super-1300重组质粒转化农杆菌GV3101感受态细胞，筛选，并培养；
在拟南芥phot2突变体(来源同实施例1)幼苗花序长至5?10 cm高时，将拟南芥花序浸没在上述农杆菌菌液中，每株浸花30 s；
将浸花过的苗盆平放在托盘中，以塑料膜覆盖保持湿度，避光放置16?24 h后取出，正常培养;5~7天后，重复侵染一次。
[0037]最后，筛选阳性植株并进行鉴定，具体过程为:
对上述农杆菌侵染后的拟南芥继续培养，收获种子；
将所收获的种子撒种于含25 mg/L潮霉素的MS培养基平板上，4°C春化3 d，移到材料室培养，阳性植株对潮霉素有抗性，可正常生长，阴性植株对潮霉素敏感，不能正常生长最后死亡；
将所筛选的阳性拟南芥苗移栽到营养土中，培养直至成熟，然后收集种子；
将所收集的种子撒种，培养，继续用潮霉素筛选并做进一步分子鉴定(将收到的Ml代种子播种到含潮霉素抗性的0.6%的MS培养基上，以一周后长根表型作为筛选指标，将筛选获得的潮霉素抗性苗移栽到营养土中培养，当幼苗长至六片真叶时，即可取叶片提取DNA，做PCR鉴定)，将所筛选的阳性苗进一步扩大繁殖，获得目的基因稳定表达的纯合体。
[0038]对获得的纯合体拟南芥种子培育，并进行小孔避光照射实验(相关实验过程参考实施例1)。需要说明的是，为准确区分蓝光受体PHOTl和PH0T2在拟南芥中介导叶绿体运动的影响，对照实验中设置了拟南芥photlphot2双突变体(由日本九州大学Ken1-chiroShimazaki教授赠送)。需要解释的是，现有针对拟南芥中PHOTl、PH0T2基因的研究认为，拟南芥中PHOTl在强弱光下都具有介导叶绿体聚光运动的功能；而当PH0T2突变后，虽然会导致拟南芥缺乏避光运动，但由于PHOTI所介导叶绿体聚光运动的影响，使得仅当PH0T2突变的影响获得有效体现，因而需要设置PHOTl PH0T2双突变体，以排除PHOTl聚光功能对实验的干扰。另外需要说明的是，拟南芥AtPH0T2基因(基因库:AY093141.1)和棉花GhPH0T2(基因库:KHG01262.1)的N端氨基酸序列均包含两个光电压敏感区(L0V1和L0V2)，C端氨基酸序列均包含对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的催化领域;这些功能域的氨基酸序列具有较高的同源性。
[0039]相关实验结果如图3所示，图中C-1、C_9为两个拟南芥回补棉花GhPH0T2基因的材料。从图3的(a)、(c)中可以看出，拟南芥回补材料C-l、C-9与野生型(WT)均能表现出避光现象，而phot2单突变体和photlphot2双突变体的叶绿体避光能力则丧失的较为明显。而从RT-PCR反应结果(图3(b))可以看出，仅有拟南芥回补材料C-1、C-9能够成功表达翻译棉花基因GhPH0T2。进一步提取植物组总蛋白后，western杂交(图3(d)中GFP作为一抗)结果表明，仅有两个回补的拟南芥材料C-1、C-9在130KD左右位置处表达有目的条带，表明棉花基因GhPH0T2得到了成功表达。
[0040]综上所述，棉花基因GhPH0T2可成功转入其他植物基因组中并且获得正确表达，而且该基因特异性的调节和控制叶绿体的避光运动。
[0041 ] 实施例4
为进一步证明GhPH0T2基因(CotAD_58277基因)调节叶绿体的避光反应，发明人用花粉管通道法转化了野生型棉花植株(中棉所16号)，对于GhPH0T2基因在超表达后，叶片避光能力变化情况进行检验，相关实验过程简介如下。
[0042]花粉管通道法转化野生型棉花植株(中棉所16号)时，具体转化和处理过程为:
使用实施例3中构建好含棉花GhPH0T2基因super-1300超表达载体的菌种，采用LB培养基，37°C、220rpm摇瓶培养过夜，收集菌体并重提质粒，将所提取的质粒用无菌水稀释至10ng/yL备用；
其次，对于栽培后开花期棉花采用自交夹自交法，每天下午将第二天要开的花蕾自交；最后，选取自交开花授粉后18?24小时的花进行花粉管注射，将所制备的重组后的目的质粒DNA注射进子房，注射时间大约在上午6?12时，注射时，剥去粉红色花瓣和柱头，从子房顶端沿纵轴插入至子房中轴长度约2/3处，轻轻推动微量注射器，将质粒溶液推入受精子房中；注射完成后，继续培养，收获棉花种子。
[0043]对于收获的种子，进一步播种后，于真叶上使用40mg/L潮霉素筛选，叶片无反应的为阳性植株，然后取叶片提取DNA进行进一步的PCR鉴定;对与PCR鉴定正确的阳性苗进一步扩大繁殖，获得目的基因稳定表达的纯合体。
[0044]对所获得的纯合体种子栽培种植后，取叶片进行透光率检测和southernblot杂交检测。其中透光率检测为:
以卤素灯光纤冷光源，对准光强测量仪探头，调到固定光强400 μπιο?.m—2.s—1，然后将叶片盖在光纤输出口，将光强测量仪探头对准且紧挨着叶片的另一面即可测得透过叶片的光强，透过叶片的光强与卤素灯光纤冷光源输出光源光强的比值即为透光率。
[0045]相关实验结果如图4所示。图中P-18、P_30为所获得的两个转基因材料，图中阳性对照为同样操作条件下注射未重组质粒材料组，CK组为未进行任何处理的对照组，阴性对照组为注射重组质粒后筛选鉴定纯合体过程中自交一代后PCR鉴定时无法扩增出标记基因的植株材料。
[0046]从图4(a)、图4(b)中可以看出，转GhPH0T2基因的转基因棉花(GhPH0T2超表达)与原始材料(中棉16)相比较，一天之内无论何时检测，转基因棉花的透光效果和透光率都优于原始材料。进一步的分子鉴定结果显示，如图4(c)所示，转基因棉花中GhPH0T2基因的表达量明显提尚(条带壳度$父尚)，而且在两个转基因材料中可鉴定到标记基因(GFP蛋白)。进一步的southern blot的杂交结果(图4(d))也表明所鉴定植株(Ρ_18、Ρ_30)为转基因植株。
[0047]综上所述，通过上述实施例可以明确看出，棉花GhPH0T2基因特异性与叶绿体运动相关，而且敏感度较高，将该基因失活后，植株叶片无法响应光伤害，叶绿体无法做出避光运动，而将该基因转入其他植物(如拟南芥)或将该基因在棉花中超表达后，可使植物叶片的避光能力得到提升，能够更加及时、更好地相应光伤害，对于培育新的耐受强光伤害植物新品种具有较好应用价值。
【主权项】
1.棉花GhPH0T2基因在植物抗强光伤害中的应用，其特征在于，该基因与叶绿体避光运动相关。2.如权利要求1所述棉花GhPH0T2基因在植物抗强光伤害中的应用，其特征在于，蓝光强度超过10 nmol.πΓ2.s—1时，含有GhPH0T2基因的棉花植株中的叶绿体出现避光运动。3.利用棉花GhPHOT2基因培养耐光伤害植物新品种的方法，其特征在于，将棉花GhPH0T2基因转化植株，或超表达后，可提升植物的耐光能力。
【专利摘要】本发明属于基因工程应用技术领域，具体涉及棉花<i>GhPHOT2</i>基因在植物抗强光伤害方面的应用。该基因与叶绿体避光运动相关。当蓝光强度超过10？μmol·m-2·s-1时，含有<i>GhPHOT2</i>基因的棉花植株中的叶绿体出现避光运动。将棉花<i>GhPHOT2</i>基因转化植株，或超表达后，可提升植物的耐光能力。光照对植物的生理反应起着非常重要的调节作用。本发明认为：含有棉花<i>GhPHOT2</i>基因的植株对光伤害敏感度更高，即对光伤害的响应更为迅速和敏感，在面临超过适应量的光照伤害时，能够调节叶片中叶绿体更为及时和迅速的做出避光运动，从而避免光伤害。以本发明为基础，可为培育耐强光的逆境植物新品种提供了新的可能性。
【IPC分类】C12N15/29, A01H5/00
【公开号】CN105567704
【申请号】CN201610122692
【发明人】张骁, 赵翔, 臧毅浩
【申请人】河南大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月4日