专利名称：适用于pcr的棉花基因组dna快速、批量制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法。
背景技术：
棉花是我国乃至世界范围内重要的经济作物，目前我国是世界上最大的棉花生产国。近年来，随着分子生物学技术与遗传育种技术的不断发展，一大批具有抗生物胁迫(抗虫)和抗非生物胁迫(抗除草剂、抗旱)的基因成功转入棉花。这些优质的基因资源为作物丰产和减少环境污染做出了重大的贡献。然而在培育新品种时，每一代转基因棉花的大田检测工作一直是困扰育种家和分子生物学研究者的一大难题。因为该环节工作量大，费时费力。经常需要短时间内从大田种植的几千株甚至上万株棉花中鉴定出转基因阳性株。这就需要一种简便、高效、快速的鉴定转基因大田试验材料的分子生物学方法。而且，根据我国转基因农作物安全性申报的要求，转基因棉花安全性申报也需要进行分子生物学检测。目前对转基因作物的检测方法可分为蛋白检测方法和核酸检测方法，而核酸检测方法中的聚合酶链式反应(PCR)技术由于其高灵敏度、高特异性、操作简便已经成为转基因植物及其产品检测的主要方法。
进行PCR检测的前提是快速大量的提取棉花的基因组DNA。目前，对于小麦、玉米、 水稻、大豆和油菜等均已建立起高效快速提取基因组DNA的技术。但对于棉花来说，由于棉花富含棉酚、多糖、单宁等次生代谢产物，该类物质在细胞破碎时极易氧化，并能与核酸和蛋白结合形成复合物，影响高质量棉花DNA的提取，进而影响后续PCR、酶切等一系列分子生物学操作。比如传统的CTAB法利用高盐溶液沉淀蛋白和酸性多糖，低盐溶液沉淀核酸的原理去除蛋白和糖类物质，但这样便增加了加入不同浓度NaCl并抽提、离心将其去除的操作，同时为了提高得率往往需要长时间的沉淀、冰浴等步骤。而SDS法以及基于该法改进的各种方法则利用SDS充分裂解细胞释放核酸物质，并用氯仿异戊醇反复抽提的方法来纯化DNA，但是该法对棉花这种富含次级代谢产物的物种来说提取效率很低。很多改进的 SDS法加入抗氧化物质来抑制酚类物质的氧化以提高产率，但效果并不理想。有学者提出 CTAB-SDS结合的改良方法提取棉花基因组DNA，虽然得到了大量的高质量的基因组DNA，但仍步骤复杂、耗时较长，不适于转基因棉花的快速PCR检测。另外，以往的取材方法多为取功能叶后包入纸袋或塑料袋中带回实验室，然后直接放入冰箱冷冻直至使用。这样的取材方法增加了材料在离体、运输、实验前装管编号等环节的操作时间以及样品反复冻融的次数，导致DNA降解，进一步增加了棉花高质量基因组DNA提取的难度。
PCR技术可以实现在体外对目标DNA进行上百万次的扩增，因此是目前最准确的检测转基因作物及其产品的方法之一。该技术对模板DNA的纯度要求并不是十分严格，而且需要的量也并不是很多。因此，能够找到一种快速提取并能满足PCR扩增需求的棉花基因组DNA的方法是解决转基因棉花育种中阳性株检测工作量大问题的关键。发明内容3
本发明目的在于，提供一种适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法， 该方法将棉花植株顶部的幼嫩叶片装入离心管中，加入提取液和钢珠，对样品进行破碎处理，然后水浴，加抽提液抽提，用异丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗一遍，沉淀溶于水即为提取的 DNA。本发明解决了棉花基因组DNA提取步骤复杂、耗时耗力的问题，提供了一种能够快速、 批量的提取满足PCR检测需求的DNA的方法，采用该方法能够从棉花叶片中高效、快速、简便的提取满足PCR检测的模板DNA，能够应用于转基因棉花育种和安全性申报等环节中的分子生物学检测。
本发明所述的适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法，按下列步骤进
a、取健康的棉花叶片0.05-0. 15g放入2mL离心管内，加入600 μ L的提取液为 NaCl、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、聚乙烯聚吡咯烷酮、β -巯基乙醇和RNase A的混合物，并加入两粒钢珠；
b、将步骤a装有样品的离心管放入细胞破碎仪内，于30HZ的频率破碎5min处理， 将处理后的离心管放入温度65°C水浴锅中水浴IOmin ；
C、取出离心管，在室温下加入700 μ L氯仿异戊醇的抽提液抽提一次，7000rpm离心 6min,
d、吸上清于新的离心管中，加等体积的异丙醇混匀，室温放置lOmin，12000rpm离心6min,弃上清,得到DNA粗提沉淀；
e、将所得DNA粗提沉淀用ImL体积浓度为75%的乙醇洗涤，12000rpm离心3min， 弃上清液，得到DNA沉淀，再加60 μ L灭菌双蒸水，温度_20°C保存即可。
步骤a中所述的提取液为NaCl 500mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50mmol/L，pH=8. O、 十二烷基硫酸钠2%、聚乙烯聚吡咯烷酮6%、β -巯基乙醇1%和终浓度为20 μ g/mL的RNase A的混合物。
步骤a中钢珠的粒径为4_6mm。
步骤a中的棉花叶为从大田棉花植株顶部取幼嫩叶片装入2mL离心管投入液氮罐中带回实验室储存于-80°C冰箱，或从任何室内栽培的棉花植株上取幼嫩叶片装入2mL离心管投入液氮中并存于-80°C冰箱。
步骤C中抽提液体积比氯仿异戊醇=24:1。
本发明所述的适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法，该方法中的提取液中β_巯基乙醇属于易挥发成分，该成分能够阻止酚类物质的褐化，所以在使用前根据叶片的老幼程度加入占混合液体积比1%_3%的用量。本发明的基本原理为提取液中聚乙烯聚吡咯烷酮(PVP)和β -巯基乙醇，能有效的去除多酚；十二烷基硫酸钠(SDS)能够溶解细胞膜上的脂质与蛋白，分离核酸和蛋白；氯仿抽提能够去除大部分的色素、蛋白、酚类、多糖等物质。DNA的沉淀只采用异丙醇，DNA的洗涤采用60%-80%的乙醇。与其他DNA提取的方法相比，本发明所得DNA可于温度-20°C长期保存备用也可直接使用。
利用本发明在提取棉花基因组总DNA的实施例中均获得了大量的DNA，提取的DNA 颜色为嫩黄色至浅褐色(依叶片的老幼程度)。经核酸分析仪检测，0D260/280均在I. 7-2. O 之间，光吸收曲线均表现较好的峰值，提取的DNA含有轻微的蛋白和杂质的污染。经琼脂糖凝胶电泳上检测表明，该方法提取的棉花总DNA有清晰主带，同时将所提DNA经PCR检测，均得到清晰、大小正确的扩增条带；说明该方法提取的DNA能够满足PCR检测的要求。
本发明所述方法与现有的棉花DNA提取方法相比，具有如下优点
快速、简便本发明利用机械方法破碎细胞，一次破碎48份样品，15min内即可完成96份样品的破碎。与传统的CTAB、SDS法相比，步骤简单，可在2小时内完成96份样品的提取，一人一天可提取400份样品,而传统方法完成96份样品的提取一般都在5-6小时；
成本低本发明减少了以往棉花提取过程中繁琐的去杂步骤，减少了试剂的使用种类，仅采用提取液、氯仿异戊醇、异丙醇和乙醇等几种试剂就可以完成全部的步骤；
DNA得率高0.05g棉花叶片采用本方法可获得浓度为60_100yg DNA，可做 500-700次PCR扩增的模板；
DNA质量符合PCR检测的需求以本发明所述方法提取的棉花DNA为模板进行PCR 扩增，均得到清晰、大小正确的扩增条带；
所需材料少，取材范围广本发明对棉花生长周期中幼苗期、开花期和结铃期的顶端幼嫩叶片以及植株中部的功能叶均适用，但对处于生长后期的老叶和植株底部的衰老叶片提取效果不如幼嫩叶片的好；
提供了一种适合大田样品采样、运输和储存的方法取棉花植株顶部的幼嫩叶片装入2mL离心管，投入液氮罐带回实验室，储存于-80°C冰箱中。检测时直接取出离心管使用，避免了以往采集装袋、运输和实验前分装管对材料的反复冻融；
本发明所述方法获得的DNA同传统方法获得的DNA —样，可稀释短期使用也可长期储存。
图I为本发明中提取棉花基因组总DNA的电泳图，其中M，DL2000DNA marker ;泳道1-3为对照I所得的匀浆上清中DNA ;泳道4-6为对照2所得抽提液中DNA ;泳道7_9为本发明所得DNA ;泳道10-12为对照3提取的DNA ；
图2为本发明提取的DNA和由对照3提取的DNA，经核酸分析仪测定得出的含量对比图，其中1-5为随机挑选的5份样品的测定值；1为本发明所得核酸含量，2为对照3所得核酸含量；
图3为本发明提取转ScALDH基因棉花与受体株的DNA经PCR扩增后实施的效果图，其中M，DL2000 DNA marker ;泳道I为质粒阳性对照；泳道2_5为对照I提取的DNA为模板的PCR结果；泳道6-9为对照2提取的DNA为模板的PCR结果；泳道10-13为本发明提取的DNA为模板的PCR结果；泳道14-17为对照3提取的DNA为模板的PCR结果，其中5、9、13、17为受体转基因阴性株；
图4为本发明提取转EsDREB基因棉花与受体株的DNA经PCR扩增后实施的效果图，其中M，DL2000 DNA marker ;泳道I为质粒阳性对照；泳道2_5为对照I提取的DNA为模板的PCR结果；泳道6-9为对照2提取的DNA为模板的PCR结果；泳道10-13为本发明提取的DNA为模板的PCR结果；泳道14-17为对照3提取的DNA为模板的PCR结果，其中5、9、13、17为受体转基因阴性株；
图5为本发明提取转TcLEA基因棉花与受体株的DNA经PCR扩增后实施的效果图， 其中M，DL2000 DNA marker ;泳道I为质粒阳性对照；泳道2_5为对照I提取的DNA为模板的PCR结果；泳道6-9为对照2提取的DNA为模板的PCR结果；泳道10-13为本发明提取的 DNA为模板的PCR结果；泳道14-17为对照3提取的DNA为模板的PCR结果，其中5、9、13、 17为受体转基因阴性株。
具体实施方式
实施例I (本发明所述方法)
样品的采集棉花叶为从大田棉花植株顶部取幼嫩叶片装入2mL离心管投入液氮罐中带回实验室储存于-80°C冰箱，或从任何室内栽培的棉花新鲜采集的材料；取 O. 05-0. 15g本实验室大田种植并由卡那霉素检测阳性的转ScALDH基因(1450bp)、EsDREB 基因(750bp)、TcLEA基因(310bp)棉花株系和对照株系幼嫩叶片放入2mL离心管(生工生物工程(上海)股份有限公司生产)，立即投入液氮罐中带回实验室储存于温度-80°C冰箱；
转基因棉花基因组DNA的提取
取健康储存的棉花叶片放入2mL离心管内，加入600 μ L的提取液为NaCl 500mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50mmol/L，pH=8. O、十二烷基硫酸钠2%和聚乙烯聚吡咯烷酮 6%、β -巯基乙醇1%和终浓度为20 μ g/mL的RNase A的混合物，并加入两粒钢珠(细胞破碎仪自带)，粒径为4-6mm ；
将装有样品的离心管放入细胞破碎仪内，于30HZ的频率破碎5min处理，将处理后的离心管放入温度65°C水浴锅中水浴IOmin ；
取出离心管，在室温下加入700 μ L体积比氯仿异戊醇=24:1的抽提液抽提一次，7000rpm 离心 6min ；
吸上清于新的离心管中，加等体积的异丙醇混匀，室温放置lOmin，12000rpm离心 6min，弃上清，得到DNA粗提沉淀，在吸上清时尽量轻柔，不要触动蛋白层，避免吸到杂质；
将所得DNA粗提沉淀用ImL体积浓度为75%的乙醇洗涤，12000rpm离心3min，弃上清液得沉淀，倒置离心管于通风处，晾干，附着于管壁底部的沉淀为DNA，再加60 μ L灭菌双蒸水，温度-20°C保存即可；
提取DNA的PCR检测
将实施例I所述方法提取的DNA为模板，以阳性质粒为阳性对照，进行PCR扩增反应。所用引物分别为
ScALDH (DL-f : 5 ’ CCATGACGGGGGAAGTGAAGGAGTATC3，和 DL_r : 5’ CTAGGGACTCCCACGTTGCGCATG3’ )，EsDREB(DL_f:5’ TTC TTCCTC AAATGCCTTCTGG3’ 和
DL-r:5，ATGCAAAACTTACATCAAGACAATG3，)TcLEA(DL-f:5，CAGAGAGAGAAAGAGAGAGCG G T3’ 和 DL-r:5’ CTTGTTCGCATTGCTGGTAGTCA3’ )。扩增体系及反应体系如下
权利要求
1.一种适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法，其特征在于按下列步骤进行 a、取健康的棉花叶片O.05-0. 15g放入2mL离心管内，加入600 μ L的提取液为NaCl、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、聚乙烯聚吡咯烷酮、β -巯基乙醇和RNase A的混合物，并加入两粒钢珠； b、将步骤a装有样品的离心管放入细胞破碎仪内，于30HZ的频率破碎5min处理，将处理后的离心管放入温度65°C水浴锅中水浴IOmin ； C、取出离心管，在室温下加入700 μ L氯仿异戊醇的抽提液抽提一次，7000rpm离心6min， d、吸上清于新的离心管中，加等体积的异丙醇混匀，室温放置lOmin，12000rpm离心6min,弃上清,得到DNA粗提沉淀； e、将所得DNA粗提沉淀用ImL体积浓度为75%的乙醇洗涤，12000rpm离心3min，弃上清液，得到DNA沉淀，再加60 μ L灭菌双蒸水，温度_20°C保存即可。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤a中所述的提取液为NaCl500mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50mmol/L，pH=8. O、十二烷基硫酸钠2%、聚乙烯聚吡咯烷酮6%、β -巯基乙醇1%和终浓度为20 μ g/mL的RNase A的混合物。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤a中钢珠的粒径为4-6mm。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤a中的棉花叶为从大田棉花植株顶部取幼嫩叶片装入2mL离心管投入液氮罐中带回实验室储存于-80°C冰箱，或从任何室内栽培的棉花植株上取幼嫩叶片装入2mL离心管投入液氮中并存于_80°C冰箱。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤c中抽提液体积比氯仿异戊醇=24:I0
全文摘要
本发明公开了一种适用于PCR的棉花基因组DNA快速、批量制备方法，涉及作物育种领域转基因作物的分子检测。该方法是由取棉花植株顶部的幼嫩叶片装入离心管中，加入提取液和钢珠，对样品进行破碎处理，然后水浴，加抽提液抽提，用异丙醇沉淀DNA，再用乙醇洗涤，沉淀溶于水即为提取的DNA。本发明解决了棉花基因组DNA提取步骤复杂、耗时耗力的问题，提供了一种能够快速、批量的提取满足PCR检测需求的DNA的方法，能够应用于转基因棉花育种和安全性申报等环节中的分子生物学检测。
文档编号C12N15/10GK102925430SQ20121051482
公开日2013年2月13日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者张道远, 李小双, 李海燕 申请人:中国科学院新疆生态与地理研究所