专利名称：鲤春病毒血症病毒(svcv)的rt-lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种鲤春病毒血症病毒(SVCV)的RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
鲤春病毒血症(Spring viremia of carp, SVC)是由鲤春病毒血症病毒(SVCV)感染鲤科鱼后弓I起的一种急性、出血性传染性疾病。以全身出血及腹水、发病急、死亡率高为特征。常在鲤科鱼特别是在鲤鱼中流行，常于春季暴发并引起幼鱼和成鱼死亡。该病最初在欧洲报道，后主要在欧洲的鲤鱼养殖中广泛传播，并造成了巨大的经济损失，是国际动物卫生组织(OIE)规定需要向OIE申报的疾病之一。在我国也被列为《中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》中的二类动物疫病。
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在水生动物的国际贸易方面，鲤春病毒血症病毒一直是严重影响我国观赏鱼出口的一种贸易壁垒。早在上个世纪，英国政府宣称我们的一批观赏鱼中含有鲤春病毒，于是禁止我们对其出口，要求我们所有出口观赏鱼饲养场进行SVC的检测与净化后才能对其出口。随后，中国观赏鱼出口的传统市场法国、意大利、西班牙、比利时、日本和新加坡等国相继提出了类似要求。这对国家创汇带来巨大损失。2002年美国爆发两次鲤春病毒血症病毒疫病，经OIE参考实验室鉴定，证明该病毒株与1998年英国从中国进口的金鱼中分离到的SVC病毒株一致，它被称之为“中国株”。此举直接把美国SVC病毒株的来源指向中国，对中国活鱼尤其是观赏鱼的出口构成了重大威胁。鲤春病毒血症病毒(SVCV),又名鲤弹状病毒,属弹状病毒科(Rhabdoriridae),水泡病毒属(Vesiculorirus)。病毒粒子90nnTl80nm,宽60nnT90nm,有类脂囊膜，核衣壳中空，螺旋状对称，直径50nm。病毒基因组为单股、负链、不分节段的RNA，长约11019个核苷酸，主要包含5个基因。病毒粒子浮力密度在CsCl中为1. 195δ/πιΓ . 200g/ml，在15%飞0%的蔗糖溶液中为1. 16g/ml，在5°/Γ25%的蔗糖梯度中沉降系数为38iT40S。病毒的抵抗力不强，感染性受环境因子的影响较大，对酸、热及脂溶剂敏感，PH值Γ10时稳定，在13°C 22°C均可生长，最适生长温度为17°C。与其他鱼类弹状病毒感染不一样，SVCV主要危害越冬以后的幼鲤和一龄以上的鲤鱼，死亡率较高。低水温期，由于鲤鱼免疫力降低，容易大面积流行、暴发鲤春病毒病。感染途径是以水体为媒介，通过鳃进入鱼体，再通过粪、尿排出体外。外伤也是一个重要的传播途径。无症状的带毒鱼体能持续数周不断地排出病毒，在低水温时病毒能在被感染的鲤鱼血液中保持11周之久，即呈现持续性的病毒血症时期。鲤春病毒血症病毒破坏鱼体内的水盐平衡，鲤鱼急性感染时，在临床上表现为病鱼无目的的漂游，体发黑，腹部肿大。皮肤和鳃渗血，无外部溃疡及其他细菌病症状。消化道出血，可见到腹水严重带血；肠炎、心、肾、鳔有时连同肌肉也出血，内脏水肿。肝部血管有血管炎及水肿。最后导致血管坏死，肝实质也多处坏死。当病鱼出现这种显性感染时，其肾、脾、腮、脑中会含有大量病毒。但有文献报道，在鱼脑组织中最易检测出病毒。当面对的是无临床症状的鱼时，由于无法确定该鱼类是否感染SVCV，是处于感染的那个阶段，无法确认那个组织最有可能含有病毒，因此，在剖取鱼组织脏器时需要将肾脏、肝脏、脾脏和脑等4个组织器官都采到样品，以保证无论鱼正处于哪个感染阶段都能被检测到病毒。培养分离鲤春病毒血症病毒一般需要15天以上才能得出结果，检测周期太长，不适应口岸快速检测和大通关的时代要求。因此，建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的的检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种鲤春病毒血症病毒的RT-LAMP检测引物组。本发明的另一个目的在于提供一种鲤春病毒血症病毒的RT-LAMP检测试剂盒。本发明的另一个目的在于提供鲤春病毒血症病毒的RT-LAMP检测方法。本发明所采用的技术方案如下
一种鲤春病毒血症病毒(SVCV)的RT-LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示
SVCV-F3 TGGCAACCTGTAATTCAG`C (SEQ ID N0:1)；
SVCV-B3 CACGGTCTCATCTGTGATC (SEQ ID N0:2)；
SVCV-FIP GGTCCGTACCATCTGTAATCACATCTCCATCTGTCTTCAGTACA (SEQ ID NO:3);SVCV-BIP GGCATCTGTCACAACAGTGTCAATCCAGTGTCCTCCGTAC (SEQ ID N0:4)；
SVCV-LF CATGGCAGATCCATCCAGAA (SEQ ID NO:5);
SVCV-LB CCCATTCTGTTCATTTGGAGC (SEQ ID NO:6)。一种鲤春病毒血症病毒(SVCV)的RT-LAMP检测试剂盒，其包括权利要求1所述的检测引物组。一种鲤春病毒血症病毒(SVCV)的RT-LAMP检测试剂盒，包括以下成分(I)权利要求I所述的引物组；(2)逆转录酶；(3) DNA聚合酶；(4) RT-LAMP反应液；(5)阳性对照和阴性对照。上述检测试剂盒，其引物组中外引物、内引物、环引物的摩尔比为1 8 :4。上述检测试剂盒,所述DNA聚合酶为DNA聚合酶；所述逆转录酶为逆转录酶。上述检测试剂盒，所述RT-LAMP反应液含有IOmM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、150mM MgS04水溶液，三者的体积比是8 :5 :2。上述检测试剂盒，所述阳性对照为含有鲤春病毒血症病毒(SVCV)囊膜糖蛋白基因片段的T载体克隆，阴性对照为DEPC水。本发明的检测试剂盒中还可以含有显色剂，所述显色剂为荧光染料SYBR Green
Io利用上述的试剂盒检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的方法，包括如下步骤 Cl)待检样品RNA的提取采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA ；
(2)恒温基因扩增反应25μ I反应体系含有SVCV-F3 O. 2 μ M, SVCV-B3 O. 2 μ Μ,SVCV-FIP1. 6 μ M, SVCV-BIP1. 6 μ Μ, SVCV-LF O. 8 μ Μ, SVCV-LB O. 8 μ Μ, RT-LAMP 反应液12. 5 μ 1，逆转录酶IU’ DNA聚合酶8U，待检RNA I lOOng，用DEPC水补齐到25 μ I ;设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63 65°C反应60 90min，并在80°C 持续 2min ；
(3)结果判断通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。在试剂盒中含有显色剂的情况下，往反应管中加入10XSYBR Green I O. 5μ 1，然后将反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner中，根据仪器所实时读取的荧光信号来判断扩
增结果。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等有益效果
(1)快速高效整个扩增只用60 90min即可完成，扩增产量可达IO9 101°个拷贝；
(2)操作简便不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；
(3)高特异性
本发明根据鲤春病毒血症病毒(SVCV)的囊膜糖蛋白基因G基因，GenBank登录号为AY527273.1)设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
(4)闻灵敏度最低检测极限可达到2.4pg/反应；
(5)鉴定简便可通过观察加入SYBRGreen I颜色变化或者是否存在焦磷酸镁沉淀来判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
图1是实施例4特异性实验的检测结果图(1、2 =DEPC水对照；3、4 SVCV RNA ;5、6 VHSV RNA ;7、8 IHNV RNA)；
图2是实施例4特异性实验的检测结果图(1、2 :DEPC水对照；3、4 HRV RNA ;5、6 =PFRVRNA ;7、8 SVCV RNA)；
图3是实施例5的检测结果图(SVCV RNA, I 10°倍稀释；2 :101倍稀释；3 102倍稀释；4 :103倍稀释；5 :104倍稀释；6 :105倍稀释；7 :106倍稀释；8 :DEPC水对照)。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。实施例1鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒的建立
鲤春鱼病毒血症病毒的RT-LAMP检测试剂盒，包括RT-LAMP引物组、RT-LAMP反应液、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、阳性对照和阴性对照。
(I)RT-LAMP引物设计以鲤春病毒血症病毒(SVCV)的囊膜糖蛋白基因(^斤G基因，GenBank登录号为AY527273.1)为靶基因，利用在线设计软件Primer Explorerversion4(http://primerexplorer. jp/e)进行 LAMP 引物的设计。引物序列见表 I。
权利要求
1.一种鲤春病毒血症病毒(SVCV)的RT-LAMP检测引物组,包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示SVCV-F3 TGGCAACCTGTAATTCAGC (SEQ ID N0:1)；SVCV-B3 CACGGTCTCATCTGTGATC (SEQ ID N0:2)；SVCV-FIP GGTCCGTACCATCTGTAATCACATCTCCATCTGTCTTCAGTACA (SEQ ID NO:3);SVCV-BIP GGCATCTGTCACAACAGTGTCAATCCAGTGTCCTCCGTAC (SEQ ID N0:4)；SVCV-LF CATGGCAGATCCATCCAGAA (SEQ ID NO:5);SVCV-LB CCCATTCTGTTCATTTGGAGC (SEQ ID NO:6)。
2.—种鲤春病毒血症病毒(SVCV)的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组。
3.根据权利要求2所述的鲤春病毒血症病毒(SVCV)的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分(I)权利要求1所述的引物组；(2)逆转录酶；(3) DNA聚合酶；(4)RT-LAMP反应液；(5)阳性对照和阴性对照。
4.根据权利要求3所述的鲤春病毒血症病毒(SVCV)的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于外引物、内引物、环引物的摩尔比为1 8 :4。
5.根据权利要求3所述的鲤春病毒血症病毒(SVCV)的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于所述DNA聚合酶为DNA聚合酶；所述逆转录酶为逆转录酶。
6.根据权利要求3所述的鲤春病毒血症病毒(SVCV)的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于所述RT-LAMP反应液含有10mM dNTPUO X ThermoPol反应缓冲液、150mM MgS04水溶液，二者的体积比是8 5 :2。
7.根据权利要求3所述的鲤春病毒血症病毒(SVCV)的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于阳性对照为含有鲤春病毒血症病毒(SVCV)囊膜糖蛋白基因片段的T载体克隆，阴性对照为DEPC水。
8.利用权利要求2 7任一项所述的试剂盒检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的方法，包括如下步骤 (1)待检样品RNA的提取采用病毒RNA提取试剂盒提取样品RNA； (2)恒温基因扩增反应:25iil反应体系含有SVCV-F30. 2 u M, SVCV-B3 0. 2 u M,SVCV-FIP1. 6 uM, SVCV-BIP1. 6uM, SVCV-LF 0. 8 u M, SVCV-LB 0. 8 u M, LAMP 反应液12. 5 iil，逆转录酶1U，DNA聚合酶8U，待检RNA I lOOng，用DEPC水补齐到25 yl ;设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63 65°C反应60 90min，并在80°C持续 2min ； (3)结果判断通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增結果。
9.根据权利要求3所述的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于还含有显色剂SYBRGreenIo
10.利用权利要求9所述的试剂盒检测鲤春病毒血症病毒(SVCV)的方法，包括如下步骤 (1)待检样品RNA的提取采用病毒RNA提取试剂盒提取纯化样品RNA； (2)恒温基因扩增反应25iU反应体系含有SVCV-F30. 2 u M, SVCV-B3 0. 2 u M,SVCV-FIP1. 6 uM, SVCV-BIP1. 6uM, SVCV-LF 0. 8 u M, SVCV-LB 0. 8 u M, RT-LAMP 反应液.12. 5 μ 1，逆转录酶 1U，DNA 聚合酶 8U，10 X SYBR Green I 0·5μ1，待检 RNA I lOOng，用DEPC水补齐到25μ I ;设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63 65° C反应60 90min，并在80°C持续2min ； (3)结果判断将上述反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。
全文摘要
本发明公开了一种鲤春病毒血症病毒(SVCV)的RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法。检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶、逆转录酶和对照；试剂盒还可以有显色剂。其检测方法是通过提取待检病毒RNA，利用逆转录酶的逆转录活性，采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63～65℃对样品RNA模板进行扩增，可检测到纯病毒RNA的pg级，其鉴定采用加入SYBRGreenIESE-Quant-tubeScanner仪器检测或者利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化判断扩增与否，确定待检样品是否含有鲤春病毒血症病毒RNA。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
文档编号C12R1/93GK103045759SQ201210514699
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者李红梅, 石磊, 唐大运, 常彦磊, 袁忠, 张璜 申请人:广州迪澳生物科技有限公司