专利名称：利用透性化细胞β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种低聚半乳糖的制备方法，特别是一种利用透性化细胞β -半乳糖苷酶制备低聚半乳糖的方法，属于酶制剂制备与功能性低聚糖生产领域。
背景技术：
随着公众饮食结构的变化，具有调节生理活性功能的食品——功能性食品需求量增大，其中功能性低聚糖尤其受到人们的青睐。我国于2007年启动了 “国家公众营养改善OLIGO (低聚糖)项目”，使功能性低聚糖的市场需求大幅增加。其中，低聚半乳糖因具有水溶性好、粘度低，对热和酸稳定等优点，可用于提高食品色泽、风味、质地以及延长货架期； 同时，低聚半乳糖还可增殖肠道内的双歧杆菌，改善人体肠道菌群分布与脂质代谢，并可促进钙、维生素吸收，提高人体免疫力，因此开发低成本制备低聚半乳糖的技术方法具有重要意义。目前，低聚半乳糖多以乳糖为底物，利用β-半乳糖苷酶的催化活性将乳糖水解生成的半乳糖基转移至乳糖上而制得，其中β-半乳糖苷酶的提取纯化是制约低聚半乳糖工业化生产的关键。β -半乳糖苷酶广泛存在于动、植物和微生物中，已报道的产酶微生物包括细菌、霉菌和酵母菌等，其中酵母菌产酶的最适PH为中性，适于牛乳水解及治疗乳糖不耐症；但由于乳酸克鲁维酵母产生的半乳糖苷酶为胞内酶，使得提取纯化过程复杂、且难度大、效率低，因此利用游离β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工艺成本较高。细胞膜具有选择透过性，采用透性化技术处理细胞，可改变其通透性，同时保持细胞整体结构完整，并可保证胞内酶仍具有催化活性。渗透处理方法包括物理法(如渗透压法、反复冻融法、热休克法和超声细胞破碎法)、化学法(如表面活性剂法、有机溶剂法和螯合剂法)以及生物化学法(如抗生素法和酶法)等。专利CN 1225389Α利用无水乙醇和氯仿，经过冷冻干燥处理得到透性化乳酸克鲁维酵母细胞β -半乳糖苷酶，但制备过程中因使用氯仿，使产品不能直接用于食品行业。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用透性化细胞β -半乳糖苷酶，操作简便且低成本的制备低聚半乳糖的方法。本发明的另一目的是提供一种无毒性的透性化细胞β -半乳糖苷酶的制备方法，该透性化细胞半乳糖苷酶是由乳酸克鲁维酵母经细胞渗透处理技术而获得，能够以乳糖为底物催化合成低聚半乳糖。为了实现上述目的，本发明所选产半乳糖苷酶的菌株为乳酸克鲁维酵母，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(北京)，菌种名称乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis), CICC 编号1773。本发明的技术方案如下一种利用透性化细胞β_半乳糖苷酶制备低聚半乳糖的方法，其特征在于，向乳糖溶液中加入透性化细胞β -半乳糖苷酶，乳糖溶液浓度为10(T500g/L，透性化细胞β -半乳糖苷酶加入量为20(Tl500mg/g乳糖，30^450C，反应2 15h后，离心分离，得到的上清液即为低聚半乳糖溶液。本发明所述透性化细胞β -半乳糖苷酶的制备方法为由乳酸克鲁维酵母经细胞渗透处理技术获得，所用乳酸克鲁维酵母购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种名称乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，CICC 编号1773。上述细胞渗透处理技术为向每克乳酸克鲁维酵母细胞中加入5(T200mL的PBS缓冲液(50mmol/LpH 8. ONaH2PO4-Na2HPO4)制得悬浮细胞；再向其中加入无水乙醇，无水乙醇与悬浮细胞的体积比为2:5 1:1，于25°C下振荡fl5min，离心后弃去上清液，所得沉淀经PBS缓冲液洗涤两次后即得透性化细胞β -半乳糖苷酶。上述乳酸克鲁维酵母的发酵条件为温度28 30°C，摇床转速10(T250rpm，接种量5 10% (v/v)，在液体培养基中培养8tT30h。
上述乳酸克鲁维酵母发酵所用液体培养基组成与配制方法为酵母膏3. 0g，麦芽浸膏3. 0g，蛋白胨5. 0g，乳糖20. 0g，蒸馏水1. 0L, pH 7. 0,121°C高压灭菌20min。本发明利用透性化乳酸克鲁维酵母细胞β -半乳糖苷酶制备低聚半乳糖，其有益效果在于(I)利用透性化细胞半乳糖苷酶制备低聚半乳糖，避免了胞内酶的提取纯化过程，简化了工艺操作，降低了生产成本。(2)透性化细胞中β -半乳糖苷酶所处环境仍为胞内环境，使其表现出比游离酶更高的催化合成低聚半乳糖的活性，更有利于发挥其催化功能。(3)本发明采用无水乙醇处理乳酸克鲁维酵母制备透性化细胞，未引入氯仿等具有毒性的化学试剂，无食品安全问题，可广泛应用于食品行业。(4)透性化细胞中β -半乳糖苷酶类似囊化固定化酶形式，易于从反应体系中分离回收，并可多次重复利用，可显著降低低聚半乳糖的生产成本。
图1透性化细胞β -半乳糖苷酶制备低聚半乳糖色谱分析图；图2 (a)透性化细胞β -半乳糖苷酶最适pH曲线图；图2 (b)透性化细胞β -半乳糖苷酶最适温度曲线图；图3乳酸克鲁维酵母发酵时间对产β -半乳糖苷酶酶活的影响曲线图。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不仅限于实施例。实施例中所用的无水乙醇、蛋白胨、酵母膏、麦芽糖等均为市售产品。乳酸克鲁维酵母，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(北京)，菌种名称乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis), CICC 编号1773。实施例中低聚半乳糖的含量及收率采用高效液相色谱检测计算而得，色谱条件为示差检测器，Aminex ΗΡΧ-87Η色谱柱，流动相为O. 05Μ H2SO4,流速O. 6mL/min,柱温65°C，进样量20 μ L。低聚半乳糖的含量通过标准糖样品(葡萄糖、半乳糖、乳糖)的标准曲线计算得到。低聚半乳糖收率=低聚半乳糖实际生成量/低聚半乳糖理论生成量X 100%。以乳糖为底物，采用透性化细胞β-半乳糖苷酶催化乳糖制备的低聚半乳糖溶液经高效液相色谱检测分析，包含有葡萄糖、半乳糖、转移二糖、低聚半乳糖以及部分未被分解的乳糖，各组分的保留时间及出峰顺序如图1所示。实施例1:乳酸克鲁维酵母透性化细胞的制备对乳酸克鲁维酵母进行发酵实验，培养基组成为酵母膏3.0g，麦芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸馏水L0L，pH 7.0，121°C高压灭菌20min。发酵条件为28°C，摇床转速lOOrpm，接种量5%(v/v)，培养8h，所得乳酸克鲁维酵母发酵液的酶活约为1. OOU/mL。将发酵液在5000rpm、4°C下离心5min，沉淀经水洗后加入PBS缓冲液稀释至50g/L，制得悬浮细胞。按无水乙醇与悬浮细胞稀释液体积比为2:5加入无水乙醇,251€下震荡处理lmin。在5000rpm、4°C下离心5min后,沉淀用PBS缓冲
液洗涤两次，弃去上清液，取沉淀即可得到透性化细胞β -半乳糖苷酶，并用PBS缓冲液稀释至20g/L。透性化细胞β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖取100mL100g/L乳糖溶液，按透性化细胞加入量为(200mg/g乳糖)加入100mL20g/L的透性化细胞溶液，在30° C、160rpm的水浴摇床中反应2h，取100 μ L酶解液稀释20倍，在12000rpm下离心2min，上清液过0. 45 μ m水膜后进高效液相色谱检测，得到低聚半乳糖含量为10g/L，收率为10%。实施例2 乳酸克鲁维酵母透性化细胞的制备对乳酸克鲁维酵母进行发酵实验，培养基组成为酵母膏3.0g，麦芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸馏水L0L，pH 7.0，121°C高压灭菌20min。发酵条件为30°C，摇床转速160rpm，接种量8% (v/v)，培养12h，所得乳酸克鲁维酵母发酵液的酶活约为7. 00U/mL。将发酵液在5000rpm、4°C下离心5min，沉淀经水洗后加入PBS缓冲液稀释至50g/L，制得悬浮细胞。按无水乙醇与悬浮细胞稀释液体积比为4:5加入无水乙醇,25°C下震荡处理lOmin。在5000rpm、4°C下离心5min后,沉淀用PBS缓冲液洗涤两次，弃去上清液，取沉淀即可得到透性化细胞β -半乳糖苷酶，并用PBS缓冲液稀释至300g/L。透性化细胞半乳糖苷酶制备低聚半乳糖取100mL300g/L乳糖溶液，按透性化细胞加入量为(1000mg/g乳糖)加入100mL300g/L的透性化细胞溶液，在45° C、160rpm的水浴摇床中反应6h，取100 μ L酶解液稀释20倍，在12000rpm下离心2min，上清液过0. 45 μ m水膜后进高效液相色谱检测，得到低聚半乳糖的含量为54g/L，收率为18%。实施例3 乳酸克鲁维酵母透性化细胞的制备对乳酸克鲁维酵母进行发酵实验，培养基组成为酵母膏3.0g，麦芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸馏水L0L，pH 7.0，121°C高压灭菌20min。发酵条件为30°C，摇床转速250rpm，接种量10% (v/v)，培养20h。所得乳酸克鲁维酵母发酵液的酶活约为8. 69U/mL。将发酵液在5000rpm、4°C下离心5min，沉淀经水洗后加入PBS缓冲液稀释至50g/L，制得悬浮细胞。按无水乙醇与悬浮细胞稀释液体积比为1:1加入无水乙醇，25°C下震荡处理15min。在5000rpm、4°C下离心5min后，沉淀用PBS缓冲液洗涤两次，弃去上清液，取沉淀即可得到透性化细胞β -半乳糖苷酶，并用PBS缓冲液稀释至125g/L。采用oNPG比色法测定透性化细胞β -半乳糖苷酶的酶活力。以最高酶活力为100%，各次测定的酶活力与最高酶活力之比为相对酶活。由图2 (a) (b)可知，透性化细胞β_半乳糖苷酶的酶学性质最适反应pH为7. O 9. O,为中性和弱碱性酶；最适温度为37° C，温度高于50°C时基本检测不到酶活，该酶可用于乳清和乳糖的水解。透性化细胞半乳糖苷酶制备低聚半乳糖取100mL500g/L乳糖溶液，按透性化细胞加入量为(250mg/g乳糖)加入100mL125g/L的透性化细胞溶液，在37° C、200rpm的水浴摇床中反应IOh，取100 μ L酶解液稀释20倍，在12000rpm下离心2min，上清液过O. 45 μ m水膜后进高效液相色谱检测，得到低聚半乳糖的含量为100g/L，收率为20%。实施例4 乳酸克鲁维酵母透性化细胞的制备对乳酸克鲁维酵母进行发酵实验，培养基组成为酵母膏3.0g，麦芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸馏水L0L，pH 7.0，121°C高压灭菌20min。发酵条件为:30°C，摇床转速160rpm，接种量10% (v/v)，分别培养4、8、12、16、20、22、24、30h，采用oNPG比色法测定透性化细胞β _半乳糖苷酶的酶活力，如图3所示，可知乳酸克鲁维酵母的最佳发酵时间为20h，此时所得发酵液的酶活约为8. 69U/mL。将发酵液在5000rpm、4°C下离心5min,沉淀经水洗后加入PBS缓冲液稀释至50g/L,制得悬浮细胞。按无水乙醇与悬浮细胞稀释液体积比为1:1加入无水乙醇，25°C下震荡处理lOmin。在5000rpm、4°C下离心5min后,沉淀用PBS缓冲液洗漆两次,弃去上清液,取沉淀即可得到透性化细胞β -半乳糖苷酶，并用PBS缓冲液稀释至150g/L。透性化细胞β -半乳糖苷酶制备低聚半乳糖取100mL100g/L乳糖溶液，按透性化细胞加入量为(1500mg/g乳糖)加入100mL150g/L的透性化细胞溶液，在37° C、160rpm的水浴摇床中反应15h，取100 μ L酶解液稀释20倍，在12000rpm下离心2min，上清液过0. 45 μ m水膜后进高效液相色谱检测，得到低聚半乳糖的含量为14g/L，收率为14%。实施例5乳酸克鲁维酵母透性化细胞的制备对乳酸克鲁维酵母进行发酵实验，培养基组成为酵母膏3.0g，麦芽浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，乳糖20.0g，蒸馏水L0L，pH 7.0，121°C高压灭菌20min。发酵条件为30°C，摇床转速160rpm，接种量10%(v/v)，培养20h，所得乳酸克鲁维酵母发酵液的酶活约为8. 69U/mL。将发酵液在5000rpm、4°C下离心5min，沉淀经水洗后加入PBS缓冲液稀释至50g/L，制得悬浮细胞。按无水乙醇与悬浮细胞稀释液体积比为1:1加入无水乙醇，25°C下震荡处理lOmin。在5000rpm、4°C下离心5min后，沉淀用PBS缓冲液洗涤两次，弃去上清液，取沉淀即可得到透性化细胞β -半乳糖苷酶，并用PBS缓冲液稀释至250g/L。透性化细胞β -半乳糖苷酶制备低聚半乳糖取100mL200g/L乳糖溶液，按透性化细胞加入量为(1250mg/g乳糖)加入100mL250g/L的透性化细胞溶液，在37° C、200rpm的水浴摇床中反应2h，取100 μ L酶解液稀释20倍，在12000rpm下离心2min，上清液过0. 45 μ m水膜后进高效液相色谱检测，计算低聚半乳糖的收率；反应后的混合物离心(5000rpm, 5min,4°C )，弃去上清液，分离出透性化细胞β _半乳糖苷酶，在透性化细胞中再加入IOOmL 200g/L乳糖溶液，按上述条件反应，经色谱检测分析、计算低聚半乳糖的收率；重复上述操作，直至无低聚半乳糖生成，可得到透性化细胞半乳糖苷酶的重复利用次数为3次。本发明公开了一种利用透性化细胞β -半乳糖苷酶制备低聚半乳糖的方法。本领域技术人员可通过借鉴本发明内容，适当改变工艺参数，结构设计等环节实现。本发明通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明核心思想、范围和内容下对本文有关的 流程进行适当改动或组合，来实现本发明技术，另外，所有类似的替换和改动对本技术领域人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明核心精神、范围和内容中。
权利要求
1.一种利用透性化细胞3 -半乳糖苷酶制备低聚半乳糖的方法，其特征在于，向乳糖溶液中加入透性化细胞P -半乳糖苷酶，乳糖溶液浓度为10(T500g/L，透性化细胞P -半乳糖苷酶加入量为20(Tl500mg/g乳糖，30^500C，反应2 15h后，经离心分离得到的上清液即为低聚半乳糖溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是透性化细胞￠-半乳糖苷酶的制备方法为乳酸克鲁维酵母经细 胞渗透处理技术获得，所用乳酸克鲁维酵母，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种名称乳酸克鲁维酵母，CICC编号1773。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是细胞渗透处理技术为向每克乳酸克鲁维酵母细胞中加入5(T200mL的PBS缓冲液制得悬浮细胞；再向其中加入无水乙醇，无水乙醇与悬浮细胞的体积比为2: 5 1:1，于25°C下振荡f 15min，离心后弃去上清液，所得沉淀经PBS缓冲液洗涤两次后即得透性化细胞3-半乳糖苷酶。
4.如权利要求3所述方法，其特征是乳酸克鲁维酵母的发酵条件为温度28 3(TC，摇床转速10(T250rpm，接种量为体积比5 10%，在液体培养基中培养8h 30h。
5.如权利要求4所述方法，其特征是乳酸克鲁维酵母发酵所用液体培养基为酵母膏·3. 0g，麦芽浸膏3. 0g，蛋白胨5. 0g，乳糖20. 0g，蒸馏水1. 0L,pH 7. 0，121°C高压灭菌20min。
全文摘要
本发明涉及一种利用透性化细胞β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖的方法，向乳糖溶液中加入透性化细胞β-半乳糖苷酶，乳糖溶液浓度为100~500g/L，透性化细胞β-半乳糖苷酶加入量为200~1500mg/g乳糖，30~45℃，反应2~15h后，离心分离，得到的上清液即为低聚半乳糖溶液。利用透性化细胞β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖，避免了胞内酶的提取纯化过程，简化了工艺操作，降低了生产成本。采用无水乙醇处理乳酸克鲁维酵母制备透性化细胞，未引入氯仿等具有毒性的化学试剂，无食品安全问题，可广泛应用于食品行业。并可多次重复利用，可显著降低低聚半乳糖的生产成本。
文档编号C12N9/38GK102994589SQ20121051480
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年12月4日
发明者齐崴, 王梦凡, 何志敏, 张帅帅, 邢肖肖, 苏荣欣 申请人:天津大学