纤维样变性易感基因及其应用的制作方法

专利名称：纤维样变性易感基因及其应用的制作方法
技术领域：
总的来说，本发明涉及遗传学和医学领域。具体来说，本发明公开了人类纤维样变性易感基因的鉴定，其可用于肝病、肝硬化、皮肤瘢痕疙瘩、肥胖症和任何纤维样变性疾病中发生的纤维样变性的诊断或预后，或用于纤维样变性易感性的诊断。更具体来说，本发明公开了 6号染色体上CTGF基因的某些等位基因，其与纤维样变性的易感性相关，并代表了用于筛选治疗活性药物的新靶点。更具体来说，本发明涉及CTGF基因和表达产物中的特定突变以及基于这些突变的诊断工具和试剂盒。本发明还可用于在所有人类纤维样变性疾病中发生的纤维样变性的预防和/或治疗。
背景技术：
纤维样变性是在器官、其任何部分或组织中，例如在肝脏、其任何部分或组织中， 尤其是对损伤做出响应而发生的纤维结缔组织的过度生长。异常纤维样变性发生在各种不同病因的慢性肝脏炎症中，例如在肝炎病毒和血吸虫感染中。以前显示，某些被血吸虫感染的对象缓慢形成纤维样变性，而其他对象快速形成纤维样变性，这部分取决于位于Chr 6q22-q23上的主要基因(Dessein等，1999 ； Mohamed-Ali 等，1999)。血吸虫病由在其宿主的血管系统中发育并产卵的蠕虫引起，一些蠕虫被载运到肝脏，它们在那里引发门静脉周间隙中的炎症。因为蠕虫在其人类宿主中生活数年，因此在被感染对象中常见慢性肝脏炎症并伴有大量组织破坏。组织修复需要在受损组织中沉积细胞外基质蛋白(ECMP)，它们晚些时候被正常肝细胞更新代替。在一些患者中，ECMP积累在门静脉周间隙中，形成纤维样变性沉积物，其减少血流，引起静脉曲张、腹水。在慢性或重复损伤数月或数年后，纤维样变性变得永久和不可逆。对象死于纤维样变性的结果。在南方国家，据估计3. 5亿被感染对象中的5至10 %可能发展严重肝纤维样变性。 在血吸虫感染的对象中没有良好的标志物允许对肝纤维样变性的进展进行预测和跟踪。肝纤维样变性的诊断主要基于肝脏活检、弹性测定法(Boursier等，2008 ；Macias 等，2008)以及超声波分析(Richter 等，2001 ；Lambertucci 等，2004 ；King 等，2003)。取决于临床背景，活检样品通过经皮、经颈静脉的放射照相引导的细针或腹腔镜途径获得。组织病理学检查能够使临床医生对坏死性炎症的严重性进行评级并对纤维样变性程度进行分级。Metavir评分系统在如下的1_4量级上对纤维样变性的阶段进行评分F0 =无纤维样变性，Fl =不具有隔膜的门静脉纤维样变性，F2 =门静脉纤维样变性并具有少量隔，F3 =具有大量隔而没有肝硬化，F4 =肝硬化(Bedossa等，1996)。肝脏活检是侵入性和高花费的操作，并且只对肝脏的一小部分取样。因此，它不能提供肝纤维样变性的全面评估，并易受取样变动和观察者间和观察者内误差的影响。此外，肝脏活检伴有3%的显著发病率和0.03%的死亡率(Garcia-Tsao等，199；3)。潜在的并发症包括与活检相关的局部血肿、感染和疼痛。非侵入性测试(例如血清学标志物、组织弹性测定法、超声波分析)也被使用，但是尚未准备好用于常规临床使用。
已经在主要是患有慢性丙型肝炎或由丙肝病毒引起的肝硬化的患者中对血液标志物组进行了测试。这些研究表明，这些血清标志物能够在约35%的患者中判断出或排除纤维样变性(Sebastiani等，2006)。然而，当对患者个体进行考察时，这些标志物不能可靠地区分纤维样变性的各种不同阶段。更近的研究将三组血清标志物合并以设计改进诊断精确度的算法(Parkes等，2006)。被评估的三个组是APRI (天冬氨酸转氨酶与血小板比率指数)、FornS指数(血小板、Y-谷氨酰转肽酶、胆固醇)和Fibrotest (GGT、触珠蛋白、胆红素、载脂蛋白Α、α -2-巨球蛋白)。由APRI继之以Fibrotest所构成的算法将纤维样变性的诊断精确度提高至超过90%。该研究组估计，使用这种算法能够避免高达50%的肝脏活检需要。然而，使用这种算法不能辨别纤维样变性的各个阶段。这些血清标志物的限制是当存在高度活动的肝脏炎症时假阳性的可能性。Fibroscan是用于对肝纤维样变性进行分级的另一项革新方法，其基于弹性成像， 提供了肝组织平均刚度的快速测量(Ziol等，200 。使用探头将低频低振幅的振动传送到肝脏中。该振动波触发弹性剪切波，其通过肝脏的速度与以千帕斯卡(kPa)计的组织刚度成正比。与肝脏活检相比，Fibroscan技术的灵敏度在79至95%的范围内，特异性为78至 95%。然而，该技术的限制与弹性波在流体或脂肪组织中的衰减相关，这种衰减将损害患者中纤维样变性的评估。此外，Fibroscan是极其昂贵的仪器。然而，不存在对纤维样变性的发展和治疗效果进行预后的有效方法。已经测试了大量分子用于肝纤维样变性治疗。例如，已使用皮质类固醇在自体免疫和酒精性肝炎中抑制肝脏炎症(Czaja等，2003)。已证明，熊去氧胆酸通过结合胆酸从而也降低肝脏炎性在PBC患者中增加存活率(Poupon等，1997)。使用特异性受体拮抗剂 (TNF-α、IL-I受体拮抗剂)和前列腺素E中和炎性细胞因子，已经在鼠类模型中测试，但尚未在人类中测试(Bruck等，1997)。缩减肝纤维样变性的另一个有吸引力的靶点是肝脏星形细胞活化的下调。将 Y-干扰素与病毒唑组合使用来治疗丙肝感染。据推断，干扰素的抗纤维样变性效应可能部分与星形细胞活化的下调相关。该机制能够解释在患有病毒性丙型肝炎、对α-干扰素没有病毒学响应的患者中所描述的纤维样变性的改善(Poynard等，1998)。目前正在人类中进行抗氧化剂(N-乙酰半胱氨酸、a -生育酚)试验。血管紧张肽 II受体在星形细胞活化中上调，因此血管紧张肽转化酶抑制剂和血管紧张肽受体抑制剂已在体外和动物中被证明具有抗纤维样变性活性。这一点还没有在人类中重复(Jonsson等， 2001)。通过基质金属蛋白酶促进基质降解，是在鼠类模型中显示出有益的抗纤维样变性策略(Iimuro等，200 。肝脏星形细胞的特异性凋亡是另一个有趣的理论想法，但是还没有被调查(Gressner等，1998)。旨在逆转纤维样变性的治疗通常对于长期使用来说毒性太强 (即皮质类固醇、青霉胺)或没有证实过的效果(即秋水仙素)。总而言之，目前缺乏有效且良好耐受的抗纤维样变性药物，并且当前的纤维样变性治疗限于有毒因子的去除。以前已经报道，纤维样变性发展受到Chr 6q23上主要基因座的显著影响 (Dessein等，1999)。还已提出，CTGF基因通过与各种前纤维形成生长因子包括P⑶F、VEGF 和主要纤维形成分子TGF-β的协同增效作用，造成纤维样变性增加(Leask等，2006)。更具体来说，CTGF起到TGF- β下游调节剂的作用(Leask等，2006 ；Leask等，2003)。它增加TGF-β与其受体的结合，干扰对TGF-β的Smad-7负反馈回路(Wahab等，2005)；它抑制主要的TGF-β拮抗剂ΒΡΜ-7的受体结合(Abreu等，2002)。CTGF对TGF-β作用的重要结果是刺激肝脏星形细胞和其他实质细胞转移分化到参与进行性纤维样变性过程的产ECMP的肌成纤维细胞中(Kalluri等，2003 ;Neilson等，2005)。据认为，CTGF还通过其与ECMP上的纤连蛋白结构域结合的能力增加ECMP联网(Gressner等，2007 ；Yoshida等，2007)。CTGF 由各种细胞产生，所述各种细胞包括肝细胞(Kobayashi等，2005 ；Gressner等，2007)、肝脏星形细胞、肌成纤维细胞和内皮细胞(Gressnet等，2008)。在受不同病因来源的纤维样变性影响的不同组织包括肝脏中，已报道CTGF转录本的过表达(Rachfal等，200 。在大鼠中进行的实验工作已显示，通过siRNA抑制CTGF阻止或减轻了组织纤维样变性(Li等，2006 ； George 等，2007)。然而，控制人类纤维样变性易感性的遗传因子以及它们对纤维样变性进展的影响，还没有被鉴定。发明概述本发明的目的是提供用于纤维样变性预后和治疗的新的遗传方法。本发明现在公开了人类纤维样变性易感基因座——CTGF基因座(CC^)的鉴定，其可用于检测纤维样变性、特别是肝纤维样变性的易感性及其诊断和预后，以及用于治疗活性药物的筛选。具体来说，本发明涉及的方法包含在来自对象的样品中检测CTGF基因座(CC^)中是否存在变异， 所述变异的存在表明纤维样变性的存在或易感性。本发明的具体目的在于检测对象中发生纤维样变性的易感性或对纤维样变性进行诊断和/或预后的体外方法，所述方法包含在来自所述对象的样品中检测CTGF基因或多肽是否存在变异，所述变异的存在表明纤维样变性的存在或纤维样变性的易感性。本发明的具体目的在于评估(预测)纤维样变性的进展的方法。在优选实施方案中，所述变异位于CTGF基因的起始密码子上游201Λ和CTGF基因的3，UTR下游20kb之内。优选情况下，变异位于CTGF基因的起始密码子上游15. 3kb区域和CTGF基因的非翻译区(3，UTR)下游14. Ikb区域的附近序列中。在另一个优选实施方案中，所述变异是一个或多个碱基的突变、插入或缺失。在更优选实施方案中，所述变异是与纤维样变性相关的一个或几个单核苷酸多态性(SNP)或 SNP的单倍型。优选情况下，所述单核苷酸多态性是CTGF基因两侧的SNP，其是与CTGF基因位置接近的等位基因变体。本发明的方法允许对发生在选自肝病纤维样变性、肝硬化、皮肤瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和肥胖症的人类纤维样变性疾病中的纤维样变性进行检测和预后。尤其是，肝纤维样变性可以由甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒(HCV)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum) (S. japonicum)或曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni) (S. mansoni)感染弓I起。在具体实施方案中，方法包含在感染HCV的对象的生物样品中检测CTGF基因座中是否存在SNP rs9402373和/或rs6918698，其中在rs9402373位置处存在等位基因C和/ 或在rs6918698位置处存在等位基因G，指示对象中发生肝纤维样变性的风险或肝纤维样变性的发生或肝纤维样变性的不良预后。优选情况下，CTGF基因座中的变异通过执行选择性杂交测定法、序列测定法、微测序测定法和/或等位基因特异性扩增测定法来确定。在本发明的另一方面，CTGF基因中的所述变异通过限制性酶消化来确定，至少一个所述SNP的检测指示纤维样变性。本发明还涉及为患有纤维样变性或对发生纤维样变性易感的对象选择治疗化合物的方法，所述方法包含将测试化合物与CTGF多肽或基因或其片段相接触，并确定所述测试化合物增强或降低与CTGF基因相关的途径的生物活性或功能的能力。


图1 渔民中CTGF( = CCN2)基因座的关联性组(Correlation bin)。如材料和方法中所述，在70位不相关对象上对33个标志物进行基因分型。使用 Haploview软件确定SNP之间的关联性(r2值)。最深的颜色表示最强的关联性。关联性组 (r2 > 0. 05)如下=SNP rs9321314、rs6940184、rsl2523697、rs9493149 和 rsl2529636 在 1 组中；SNP rsl2527705 和 rsl2526196 在 2 组中；SNP rs9399005、rs6918698 和缺失 / 插入 (D/I)rs3037970 在 3 组中；SNP rs2151532 和 SNP rsl931002 在 4 组中；SNP rs9493150、 rs92850U rsll966728、rsl2198610 和新的插入 / 缺失(132319925-/GAAA)在 5 组中；SNP rs774760Urs7768619 和 rs9402373 在 6 组中；SNP rsl2527379 和 rs2095252 在 7 组中。在8个病例和2个对照中，对CCN2 (3. 2kb)和起始密码子上游15. 3kb以及3，UTR 区中14. Ikb进行了测序。它揭示出61个SNP，其中50个以前已被描述。因为发明人正在寻找具有主要效应的基因，因此他们集中于研究MAF > 20%的53 个SNP。在70位渔民上对MAF >20%的33个SNP进行了基因分型。使用Haploview软件确定SNP之间的关联性(r2值)。下图显示r2值xlOO。最深的颜色表示最强的关联性。在该图上方，提供了带有每个标志物的相对位置的物理图谱。这些标志物被分组在7个关联性(r2 = 0. 5)组(I 至 VII)中。SNP rs9321314、rs6940184、rsl2523697、rs9493149 和 rsl2529636 在 1 组中；SNP rsl2527705 和 rsl2526196 在 2 组中；SNP rs9399005、rs6918698 和 D/I rs3037970 在 3 组中；SNP rs2151532 和 SNP rsl931002 在 4 组中；SNP rs9493150、rs928501、rsll966728、 rsl2198610 和新的插入 / 缺失(132319925-/GAAA)在 5 组中；SNP rs7747601、rs7768619 和 rs9402373 在 6 组中 SNP rsl2527379 和 rs2095252 在 7 组中。在全部渔民样品QOl个对照和99个病例)中对22个SNP进行进一步基因分型。 单变量分析的结果显示在图1顶部和表1和4中。与肝纤维样变性相关的SNP是组II中的 SNP rsl2527705 (ρ = 0. 02，OR = 2. 3)和 SNP rsl2526196 (ρ = 0. 02，OR = 2. 2)、组 III 中的 SNP rs9399005(p = 0. 02，OR = 2. 2)、SNP rs6918698(p = 0. 02，OR = 2)和 D/ I rs3037970(p = 0. 003，OR = 2. 6)、组 IV 中的 SNP rsl931002(p = 0. 004，OR = 2. 3)和 rs2151532(p = 0. 02，OR = 1. 98)以及组 VI 中的 SNP rs9402373 (ρ = 0. 015，OR = 2)。将分析根据性别(P < 0. 001)、暴露(捕鱼年数:p < 0. 001，生于船上φ <0.01)和治疗次数 (P <0.01)进行了调整。在本分析中，在同时测试两个SNP的多变量分析中，D/I rs3037970排除 rs6918698。同样地，SNP rsl931002 排除 SNP rs2151532 ；SNP rsl256196 排除 SNP rsl2527705 和 SNP rs9399005。这表明 SNP 或缺失 rsl2526196、rs30337970、rsl931002、rs9402373与肝纤维样变性(HF)具有最强相关性。当在相同的回归模型中对所有4种SNP 进行测试时(表 4 下部)，SNP rsl2526196 (ρ = 0. 007，OR = 3)、rs9402373 ((ρ = 0· 002， OR= 2.8)和 rsl931002(p = 0.002，OR= 2.8)显示出与 HF 独立相关。存在于 53. 9%的对照和67. 5%的病例中的单倍型1002C、6196T与HF相关(ρ < 0. 005)。发明人还测试了与具有门静脉高血压迹象的晚期HF相关的表型。他们发现(巧4个对照和151个病例) 的 rs9402373 (ρ = 0. 005，OR = 2. 6)和 rs3037970 (ρ = 0. 05，OR = 2)与该表型相关，SNP rsl256196显示出与该更严重疾病表型相关的趋势(p = 0. 12)。性别(p = 0. 001)作为协变量进入模型。这表明rs9402373和rs3037970两者可能对严重疾病具有更重要的贡献。图2A 电泳迁移率变动分析揭示出核因子与SNP rsl2526196和rs9402373的等位基因特异性结合。按照材料和方法，使用刺激过的人类肝细胞系(HEPG2)的核提取物执行EMSA。 12526196T等位基因以与C等位基因相比更高的亲和性结合核因子(复合物1)。SNP rs9402373C等位基因结合核因子(复合物幻，该核因子不被G等位基因结合。使用SNP rsl2527705和SNP rsl931002没有观察到等位基因特异性结合。图2B :rs9402373多态性的竞争性电泳迁移率变动分析。竞争性反应使用100或200fmol无生物素酰化的rs9402373G和C探针来进行。使用浓度为200fmol的无生物素酰化的rs9402373C探针而不是无生物素酰化的rs9402373G 进行的竞争性反应，竞争生物素酰化的rs9402373C探针的结合。图3显示了在HCV或血吸虫感染的对象中SNP rs9402373与肝纤维样变性的关联性的后设分析。发明详述本发明鉴定了纤维样变性发生中最关键的步骤，并提供了有价值的遗传标志物来预测纤维样变性、特别是肝纤维样变性中的疾病进展。纤维样变性的早期检测和纤维样变性的定期监测，将允许启动能够停止和甚至逆转该过程的抗纤维样变性治疗。这将反过来阻止人类纤维样变性疾病例如肝纤维样变性或肝硬化的发展和该病症造成的发病和死亡。这些各种早期纤维样变性检测技术的开发良好预示了患有肝病患者的未来护理。本发明人现在已经鉴定了与人类纤维样变性相关的主要基因。他们已经显示，在分别感染有日本血吸虫和曼氏血吸虫的两个中国人、一个苏丹人和一个巴西人组群中的纤维样变性，显著依赖于位于CTGF基因中的等位基因变体。这些变体中的两种影响核因子结
I=I O对来自患有纤维样变性的个体的各种核酸样品进行了特殊分析过1)。最后，对22 个SNP或遗传变异进行基因分型，用于进一步分析。将这22个加入到在前期步骤中测试的三个SNP中。在CTGF基因座的这些25个SNP或遗传变异Q2+3)中，8个遗传变异被鉴定为在人类对象中与肝纤维样变性相关(rsl2527705、rsl2526196, rs9399005、rs6918698、 rs3037970、1931002、rs2151532和rs9402373)。因此，本发明的具体目的在于检测纤维样变性的易感性和/或对纤维样变性进行预后的方法，所述方法包含检测一个或几个选自 rsl2527705、rsl2526196、rs9399005、rs6918698、rs3037970、1931002、rs2151532 和rs9402373的SNP和变异的存在。在这些SNP中，rs9402373的C等位基因或rsl2526196的T等位基因特异性结合核因子 SRY、Lyf-I、CdxA、CP2、Ik_2 或 Nkx_2。在HCV感染的对象中，SNP rs6918698和rs9402373被显示为与肝纤维样变性相关。具体来说，rs9402373的C等位基因被显示为有害，即它与严重肝纤维样变性强烈相关。尽管取决于所测试的群体，由本发明人收集的实验数据不允许验证某些等位基因的相关性，但本发明不限于在所有被测试群体中发现的与纤维样变性显著相关的具体SNP。 事实上，几个原因能够解释在某些群体中验证显著关联性的失败，包括组群不足、混杂变量的评估不完全、所述群体中SNP的低频率等。^JL在本发明的上下文中，“纤维样变性”是指在所有人类纤维样变性疾病例如肝脏疾病、肝硬化、皮肤瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、硬皮病、肥胖症和任何纤维样变性疾病中发生的所有类型的人类纤维样变性。在本发明的上下文中，“肝纤维样变性”或“HF”是指在肝脏、其组织或其组织的任何部分中发生的所有类型的纤维样变性。肝纤维样变性尤其在对损伤做出响应时发生。 肝纤维样变性可以是对慢性肝损伤的共同响应，最终导致肝硬化及其并发症、门静脉高血压、肝功能衰竭和肝细胞癌。肝纤维样变性是过度旺盛的伤口愈合，其中过量结缔组织堆积在肝脏中。细胞外基质被过量产生、降解不足或二者同时发生。触发物是慢性损伤，特别是如果存在炎性组分的话。各种类型的慢性肝损伤能够引起纤维样变性，例如化学性纤维样变性(CCl4)、细菌性(即布鲁氏杆菌病)、寄生虫性(即裂体吸虫病/由血吸虫属 (Schistosoma)物种引起的血吸虫病；或棘球蚴病感染)或病毒性(即由甲肝病毒(HAV)、 乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染引起的肝炎)。在本发明的上下文中，“皮肤瘢痕疙瘩”是瘢痕组织在皮肤上的过度生长。更具体来说，瘢痕疙瘩和增生性瘢痕(HSc)是人类独有的在创伤、炎症、手术、烧伤后以及有时自发发生的皮肤纤维增殖性障碍。它们的特征为胶原蛋白在真皮和皮下组织中的过量沉积。 与正常伤口修复的细纹瘢痕特征相反，瘢痕疙瘩和HSc的旺盛瘢痕形成典型地引起毁容、 挛缩、瘙痒和疼痛。在黑人、西班牙人和东方人中，瘢痕疙瘩发生在具有家族性沉积症的个体中。与IBc不同，瘢痕疙瘩的瘢痕扩大并伸展到原始伤口的边界之外，并很少退回。这些障碍代表了伤口愈合基本过程的畸变，其包括细胞迁移和增殖、炎症、细胞因子和细胞外基质(ECM)蛋白的合成和分泌增加以及新合成基质的重塑。在生物学上，瘢痕疙瘩是纤维样变性组织，其特征为过量沉积有细胞外基质组分特别是胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖的非典型成纤维细胞的集合。一般来说，瘢痕疙瘩含有相对无细胞的中心和在病损深层皮肤部分中形成结节的浓密、丰富的胶原蛋白束。在愈合的炎性阶段中生长因子的释放和激活是瘢痕形成过程的先决条件，所述瘢痕形成过程包括血管发生、上皮再形成、成纤维细胞的募集和增殖以及基质沉积。然后，调控性细胞因子包括CTGF活性的异常产生可能造成瘢痕疙瘩的发生。在本发明的上下文中，“CTGF基因座”(结缔组织生长因子)、也称为CCN2基因座， 是指细胞或生物体中所有的序列或产物，包括CTGF编码序列、CTGF非编码序列(例如内含子)、控制转录和/或翻译的CTGF调控序列(例如启动子、增强子、终止子等)、所有对应的表达产物例如CTGF RNA (例如mRNA)和CTGF多肽(例如蛋白前体和成熟蛋白)，以及CTGF 基因起始密码子上游201Λ区域、优选为15. 31Λ区域以及非翻译区(3’UTR)下游201Λ区域、 优选为14. Ikb区域的周围序列。例如，CTGF基因座包含含有由测序鉴定的61个SNP(图 1)、特别是表1的8个SNP的周围序列。然而，在具体实施方案中，大多数变异不在启动子序列中。在本发明的上下文中，术语“预后”包括在成人、儿童和胎儿中，在各种不同阶段、 包括早期无症状阶段和晚期阶段时检测、监测、服药(dosing)、比较等。预后典型地包括纤维样变性进展的评估(预测)和对象的定性以确定最适合的治疗(药学-遗传学)等。本发明提供了确定由CTGF基因座中的突变或多态性引起的纤维样变性或相关障碍的进展速度的预后方法。分析和预测对治疗或药物的响应或对治疗和药物的副作用的预后，旨在确定个体是否应该用特定治疗药物治疗。例如，如果预后指示个体将对特定药物的治疗做出阳性响应的可能性，可以向个体给药药物。相反，如果预后指示个体可能对特定药物的治疗做出阴性响应，那么可以提供可选治疗过程。阴性响应可以被定义为不存在有效响应或存在有毒副作用。临床药物试验代表了 CTGF基因座SNP的另一种应用。一个或多个表明了对药物或对药物副作用的响应的CTGF SNP，可以使用上面描述的方法来鉴定。然后，可以对这种药剂临床试验的潜在参与者进行筛选，以鉴定更可能对药物做出有利响应的个体，并排除可能经历副作用的个体。通过这种方式，可以在对药物做出阳性响应的个体中测量药物治疗的有效性，而不会由于包含了不太可能在研究中做出阳性响应的个体引起测量值的降低，并且没有不想要的安全性问题的风险。变异变异可以在CTGF DNA、RNA或多肽水平上确定。任选地，通过对CTGF基因座的全部或一部分进行测序，或通过对CTGF基因座的全部或一部分进行选择性杂交或扩增来进行检测。更优选情况下，在变异鉴定步骤之前进行CTGF基因座特异性扩增。CTGF基因座中的变异可以是单独或各种不同组合的基因座的编码和/或非编码区中的任何形式的突变、缺失、重排和/或插入。更具体来说，突变包括点突变。缺失可以涵盖基因座的编码或非编码部分中任何两个或多个残基的区域，例如从两个残基多至整个基因或基因座。典型的缺失影响较小的区域，例如结构域(内含子)或重复序列或少于约50个连续碱基对的片段，尽管较大的缺失也可能发生。插入可以涵盖基因座的编码或非编码部分中一个或几个残基的添加。插入典型地可以包含在基因座中添加1至50个碱基对。重排包括序列的倒置。CTGF基因座变异可以导致产生终止密码子、移码突变、氨基酸取代、特定RNA剪接或加工、产物不稳定性、截短的多肽产生等。变异可能导致具有改变的功能、稳定性、定向或结构的CTGF多肽的产生。变异也可以引起蛋白表达的降低或可选地所述生产的增加。在优选实施方案中，所述变异是一个或多个碱基的突变、插入或缺失。在本发明的方法的具体实施方案中，CTGF基因座中的变异选自CTGF基因或相应表达产物中的点突变、 缺失和插入，更优选为点突变和缺失。变异可以在CTGF DNA、RNA或多肽水平上确定。本发明的具体目的是检测对纤维样变性的易感性和/或纤维样变性的预后的方法，所述方法包含检测一个或几个选自下列的变异或SNP的存在rs9402373、rsl931002、 rsl2526196、rsl257379、rsl2527705、rs9399005、rs6918698、rs3037970、rs2151532、 rs9321314、rs9321315、rs6910279、rs6940184、rsl2523697、rs9493149、rsl2529636、rs6917644、rs9493150、rs928501、rsll966728、rs7747601、rsl2198610、132319925D/I、 rs9483364、rs2095252、rs6926879、rs34118837、rsl931003、rsl2191459、rsl2206863、 rs7768619、rsl0872386 和 rs2327184。132319925D/I (缺失/插入)多态性是以前从未描述过的新的多态性。为了能够鉴定该多态性，发明人按照坐标系统的位置给出名称，并且D/I表示该多态性诱导了缺失或插入。该多态性也可以写成132319925-/GAAA。优选情况下，所述与纤维样变性相关的变异或SNP选自rsl2527705、rsl25^196、 rs9399005、rs6918698、rs3037970、rsl931002、rs2151532 和 rs9402373。更优选情况下， 所述rs9402373C和rsl25^196T等位基因优选结合核因子。这些变异/SNP报告在下面的表1中。表1 :CTGF基因座中的纤维样变性相关变异
权利要求
1.一种检测对象中发生纤维样变性的易感性或对纤维样变性进行诊断和/或预后的体外方法，所述方法包含在所述对象的生物样品中检测CTGF基因座中是否存在变异。
2.权利要求1的方法，其用于评估纤维样变性的进展。
3.权利要求1或2的方法，其中所述变异位于CTGF基因的起始密码子上游201Λ和 CTGF基因的3，UTR下游20kb之内。
4.权利要求3的方法，其中所述变异位于从CTGF基因的起始密码子上游15.31Λ至 CTGF基因的3，UTR下游14. Ikb的区域内。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中所述变异是一个或多个碱基的突变、插入或缺失。
6.权利要求5的方法，其中所述变异是一个或几个单核苷酸多态性(SNP)。
7.权利要求6的方法，其中所述SNP选自rsl2527705、rsl2526196,rs9399005、 rs6918698、rsl931002、rs2151532 和 rs9402373。
8.权利要求5的方法，其中变异是被鉴定为rs3037970的碱基缺失或插入。
9.权利要求1至8任一项的方法，其中所述纤维样变性发生在选自肝纤维样变性、肝硬化、皮肤瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、硬皮病和肥胖症的人类纤维样变性疾病中。
10.权利要求9的方法，其中所述肝纤维样变性由甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)或曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)感染弓丨起。
11.权利要求1的方法，其包含在感染HCV的对象的生物样品中检测CTGF基因座中是否存在SNP rs9402373和/或rs6918698，其中在rs9402373位置处存在等位基因C和/或在rs6918698位置处存在等位基因G，指示对象中发展肝纤维样变性的风险或指示肝纤维样变性的发展或指示肝纤维样变性的不良预后。
12.前述权利要求任一项的方法，其中CTGF基因座中变异的存在通过测序、选择性杂交和/或选择性扩增来检测。
13.前述权利要求任一项的方法，其中SNP的存在通过限制性酶消化来检测，至少一个所述SNP的检测指示纤维样变性。
14.一种为患有纤维样变性或对发展纤维样变性易感的对象选择治疗化合物的方法， 所述方法包含将测试化合物与CTGF多肽或基因或其片段相接触，并确定所述测试化合物增强或降低与CTGF基因座相关的途径的生物活性或功能的能力。
全文摘要
本发明公开了纤维样变性易感基因座——CTGF基因座的鉴定，其可用于检测纤维样变性的易感性、纤维样变性的诊断和预后以及治疗活性药物的筛选。具体来说，本发明涉及的方法包含在来自对象的样品中检测CTGF基因座中是否存在变异，所述变异的存在表明纤维样变性的存在或易感性。
文档编号C12Q1/68GK102325904SQ201080008683
公开日2012年1月18日 申请日期2010年2月18日 优先权日2009年2月19日
发明者克里斯托弗·切维拉尔德, 维奥莱尼·阿努德, 阿莱恩·德赛因 申请人:地中海大学, 法国国家卫生及研究医学协会