专利名称：产3-羟基丙酸的转化微生物及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种产3-羟基丙酸的转化微生物 及其构建方法和应用。
二背景技术：
现有技术3-羟基丙酸(3-hydroxypropanoate, 3-HP)是一种重要的功能有机 酸。它易溶于水、乙醇、乙醚，可以通过化学工业中一系列成熟的催化技术转化 为具有重要商业价值的化学品，如通过脱水生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，与醇 酯化反应生成酯，以及经还原反应生成3-鞋基丙酸等；3-HP还具有潜在的生物应 用例如在营养工业中，可使用3-HP作为食品和饲料添加剂或防腐剂，在一些植 物体内的内生真菌中存在微量的3-HP,发现其具有杀灭寄生线虫的能力；另外， 还可作为单体原料用以合成聚3-羟基丙酸[P-(3HP)],聚3-羟基丙酸是一种新型生 物可降解高分子，它不但具有良好的生物降解性和生物相容性，而且高分子量的 [P-(3HP)]具有很高的机械强度和拉伸强度(> 400 MPa)以及较大的断裂伸长率等优 异性能。而我国在该领域的研究才刚刚起步，3-羟基丙酸的应用潜力有待开发。
目前微生物生产3-羟基丙酸主要有三种途径
1、 微生物转化非糖基原料生产3-羟基丙酸，
2、 微生物利用3-羟基丙酸循环途径微量积累3-羟基丙酸
3 、以Cargill公司和威斯康星大学等研究机构为代表的构建基因工程菌生产3-羟基丙酸，主要有两种方案
(1) 以葡萄糖为底物，在大肠杆菌中构建经乙酰-CoA的5种代谢途径
(2) 以甘油为底物，在大肠杆菌中导入甘油脱水酶基因， 3-鞋基丙酸是少凄t耐热孩i生物(C似wq/fec附awra油'acw;y)胞内羟基丙酸循环
途径固定C02过程的代谢中间物，其作为中间代谢物，通常情况难以高效率大量 积累，这是由于中间产物的积累都必将破坏微生物中C02固定循环途径的持续进 行。迄今，在自然界中尚未发现能直接利用糖质原料或甘油高效转化生产3-HPA的微生物，但3-羟基丙酸循环途径所涉及到的关键酶对于今后构建模式基因工程 菌生产3-羟基丙酸将有重大指导意义。
发明内容
技术问题本发明针对上述技术空白，提供一种产3-羟基丙酸的转化微生 物及其构建方法和应用。
技术方案 一种含有重组载体的转化微生物，其中该重组载体含有基因编码 SEQIDNO.l所示核苷酸序列表达的蛋白质。
一种制备转化微生物的方法，包括将基因编码SEQ ID NO.l所示核苷酸序列 导入到宿主。
制备转化体方法中所述宿主为肺炎克雷伯氏菌。
制备转化微生物的方法为利用PCR技术从醋酸杆菌基因组中扩增出如 SEQ ID NO.2所示含2328个碱基对的醛脱氢酶基因aldH,从质粒载体 pHY300PLK中扩增出如SEQ ID N0.3所示含1560个碱基对的四环素抗性基因 TetR,将其串联到表达载体pUC18中，得到重组质粒pUC18-aldH—TetR，重组质 粒转化筛选获得的肺炎克雷伯氏菌，得到重组肺炎克雷伯氏菌。
制备转化微生物的方法，制备步骤为
(1) 基因的克隆根据Genebank公布的醋酸杆菌中aWH基因的序列设 计合成PCR所需的引物
P1: 5'- GAATTCATGGGTAAGCTGGAACGCATTGC -31 P2: 51- TCTAGATCAGGCGTTCCCTTTTTCTTTTA -31 引物两端分别引入￡coi I ，/酶切位点，以醋酸杆菌基因组DNA为模 板完成PCR反应PCR反应条件95。C变性5min，经94。C30sec, 52。C30sec， 72。Clmin40sec 30个循环，再经过72。C延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析 确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，进行序列 测定，五coi I, ^&a/酶切重组pMD18-simple-T载体，回收其中1.56kb片段，连 接至pUC18载体，获得重组质粒pUC18-aWH;
(2) 基因Tef的克隆根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列设计 合成PCR所需的引物
P3: 51- CTGCAG ATGAAATACTGAATTTAAAA-31 P4: 5 l AAGCTT CTTAACGATTTAGAAATCCC-31 引物两端分别引入户M,历m/ III,以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反 应PCR反应条件95。C变性5min,经94 °C30 sec， 52°C30 sec, 72°C1 min20sec 30个循环，再经过72。C延伸3min,获得的PCR产物经电泳分析确认，经 PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，经Swfll，历m/III酶 切回收其中1.56kb片段，连接至pUC18-aMH载体，得到重组质粒pUC18-aWH-TetR;
(3)转化微生物的获得将重组质粒pUC18-aMH-TetR通过电击转化的方式转 化肺炎克雷伯氏菌，涂布含40吗/m L的四环素平板，挑取阳性转化子，得到重 组肺炎克雷伯氏菌。
含有重组载体的转化微生物在生产3-羟基丙酸中的应用。
转化微生物在生产3-羟基丙酸中的应用，生产工艺为种子液的培养将接 种后的培养液在31-37 。C ，摇床转速120-180 r/min的条件下培养12-24 h;所述培 养液组成为酵母膏4-5 g/L, 麦芽3.0-4.0 g/L, 蛋白胨4-5 g/L, NaCl 10 g/L，四环素浓度20-40 |ng/L;发酵培养培养条件为接种种子液的量为5-10 % (v/v)，发酵温度31-37 。C，接种6-8小时好氧发酵，加入IPTG， IPTG的最终浓 度1.0mmol/L,此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境，发酵时间30h左右； 其中培养基组成为酵母膏4-5 g/L， K2HP04'3H20 8-10 g/L， KH2P04 1.5-2.5 g/L, NH4C1 0.8-1 g/L, NaCl 0.5 g/L, MgS04'7H20 0.08-0.12 g/L, FeCl3'6H20 25-35mg/L， CoCl2'6H20 4-6mg/L, VitaminB12 5 mg/L， glycerol 30 g/L。
有益效果本发明在于提供一种转化微生物，用于发酵产3-羟基丙酸，该菌 在有氧或微氧条件下利用甘油高效发酵产3-羟基丙酸。摇瓶发酵完毕，最终3-羟 基丙酸浓度达2.6 3.3 g/L,摩尔转化率在40-68%之间，经5L罐发酵实验，最终 3-羟基丙酸浓度高达8.2 g/L,实现了在特定宿主细胞中生产3-羟基丙酸的过程， 为微生物发酵法工业化生产3-羟基丙酸奠定了良好的理论基础。与原始克雷伯氏 菌相比，产生了一种新代谢产物3-羟基丙酸。与目前文献所报道利用基因手段构 建重组微生物生产3-羟基丙酸方法相比，不仅质粒在宿主菌林中稳定性高，而且 生产菌抹较合适，产物终浓度有竟争力(目前文献所报道的利用基因工程手段改 造大肠杆菌生产3-轻基丙酸的产量在5 g/L以下)，另外还可在发酵过程中添加微 量四环素，达到抑制部分杂细菌的目的，大大减少了在工业化过程中较易发生的 染杂菌现象，发酵时间也有所缩短，为^f鼓生物发酵法工业化生产3-羟基丙酸奠定 了良好的基础。
四
图1为载体图镨示意图；图2为外源基因在宿主细胞Klebsiella pneumoniae中成功表达的SDS-PAGE图 谱；图中Lane 1:蛋白质Marker; Lane 2:经诱导的重组菌；Lane 3:未经诱导 的重组菌；Lane4:加入诱导剂的原始菌；Lane:未加入诱导剂的原始菌； 图3为色镨图，其中(a)标准混合液；(b)发酵液；图中1.甘油Glycerol, 2. 3-轻基丙酸, 3.乳酸Lactic acid, 4.甲酸Formic acid, 5. 乙酸Acetic acid。
五具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件如Joe Sambrook、 David Russell等人，《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》3rd ed ( Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 )中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1: X/eZme〃a/wewwww'ae ATCC25955-3-pUC18-a/<iH- TetR的构建 (1 )基因"WA的克隆根据Genebank公布的大肠杆菌￡.co/z' K12中flWA基因 的序列(SEQ ID No.2 )设计合成PCR所需的引物
PI (SEQIDNo.4) : 51-GAATTCATGGGTAAGCTGGAACGCATTGC-31 P2 ( SEQ ID No.5 ) : 51- TCTAGATCAGGCGTTCCCTTTTTCTTTTA -31 引物两端分别引入￡coi I , J^a /酶切位点，以醋酸杆菌基因组DNA为模板完 成PCR反应PCR反应条件95。C变性5min,经94。C30sec, 52。C30sec, 72。Clmin40sec 30个循环，再经过72。C延伸3min，获得的PCR产物经电泳分析 确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，进行序列 测定，五coTU , ^&a/酶切重组pMD18-simple-T载体，回收其中1.56kb片段，连 接至pUC 18载体，获得重组质粒pUC 18-aWH; (2)基因Tef的克隆根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列(SEQ ID No.3 )设计合成PCR所需的引物
P3 (SEQIDNo.6) : 51-CTGCAG ATGAAATACTGAATTTAAAA-31 P4 (SEQIDNo.7) : 51-AAGCTT CTTAACGATTTAGAAATCCC-31 引物两端分别引入/VI,历m/ III,以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反 应PCR反应条件95。C变性5min,经94 °C30 sec, 52°C30 sec, 72°C1 min20 sec 30个循环，再经过72。C延伸3min,获得的PCR产物经电泳分析确认，经 PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD 18-simple-T载体连接，经Smal,历m/ III酶切回收其中L56kb片段，连接至pUC18-aWH载体，得到重组质粒pUC18-aWH-TetR。
实施例2:重组质粒pUC18-a/(iH-TetK转化肺炎克雷伯氏菌K/efe/e〃a 25955 (从ATCC获得，菌种号幻eZmW/a/ 加mwow'w ATCC25955 )
利用电击穿孔^f义将重组质粒pUC 18-aMH-TetR转化肺炎克雷伯氏菌 /7朋wmom'^ 25955,电转化条件参数为电压2.5 kV，阻值200Q,脉冲时间4.5 msec。电击转化完毕，将经过电击处理过的Klebsiella pneumoniae ATCC25955涂 布于含有40 ing/mL四环素的LB培养基上，得到阳性克隆幻efc/e〃a ; "ewwom'ae ATCC25955-3-pUC18-aWH-TetR。
实施例3:工程菌《/e/w/e〃" pwewww"^e 25955-3- pUC18-"/<iH-TetR的质粒稳定性 考察
考察方法从新鲜转化平板上挑取单菌落接种至3mL不含四环素的LB培养 基中，37 。C培养种子12 h作种子，转种培养24h,即为传种20代，转种培养5 次，即为100代，将上述菌液涂布于不含抗生素的LB板上，从中挑选100个单 菌落分别点在添加和不添加四环素的平板上，37 。C培养12-16 h，比摔支在添加和 不添加四环素的平板上的菌落数即得其稳定性。
考察结果传种IOO代之后其质粒稳定性为99%。
实施例4:工程菌/ "ww朋/ae ATCC25955-3- pUC18-aWH-TetR利用甘 油在摇瓶中发酵产3-羟基丙酸
(1 ) 出发菌林X7efczW/apwrawo"/ae ATCC25955-3-pUCl8-a/c/H- TetR; (2)种子培养基酵母膏4-5 g/L, 麦芽3.0-4.0 g/L， 蛋白胨4-5 g/L, NaCl 10g/L， 四环素浓度20-40 ng/L;
种子培养250mL三角瓶，装液量35mL,培养温度31-37 °C,摇床转 速120-180 r/min，培养12-24 h。 (3 )发酵培养
培养基组成酵母膏4-5 g/L, K2HPCV3H20 8-10 g/L， KH2P04 1.5-2.5 g/L， NH4C1 0.8-1 g/L， NaCl 0.5 g/L, MgS04'7H20 0.08-0.12 g/L, FeCl3'6H20 25-35 mg/L, CoCl2'6H20 4-6 mg/L， VitaminBi2 5 mg/L, glycerol 30 g/L。培养条件接种量为占培养基体积的10 %，发酵温度31-37 °C,接种6小时 好氧发酵，加入IPTG, IPTG的最终浓度1.0 mmol/1,此后，控制氧气的通入 量，维持微氧环境(停止通入氧气即可)，发酵时间30h左右。
发酵结果30g底物甘油经转化得到2.6g/L3-羟基丙酸。
对比例1:原始菌isT/efc/e〃a ATCC25955利用甘油在摇弁瓦中发酵产3-
羟基丙酸
(1) 出发菌4朱X/eZw7'e〃a/ wei/附o"/ae ATCC25955
(2) 种子培养基酵母膏4-5 g/L，麦芽3.0-4.0 g/L, 蛋白胨4-5 g/L, NaCl 10 g/L, 四环素浓度20-40 pg/L;
种子培养250mL三角瓶，装液量35mL,培养温度31-37 。C,摇床转 速120-180 r/min,培养12-24 h。
(3) 发酵培养
培养基组成酵母膏4-5 g/L， K2HP04'3H20 8-10 g/L, KH2P04 1.5-2.5 g/L， NH4C10.8-1 g/L, NaC10.5g/L, MgS047H20 0.08-0.12 g/L， FeCl3.6H20 25-35 mg/L， CoCl2'6H20 4-6 mg/L， VitaminB12 5 mg/L, glycerol 30 g/L。
发酵培养条件250mL摇瓶，装液量100mL,接种量10 % (占培养基体 积)，发酵温度31-37 。C，接种6小时好氧发酵，加入IPTG, IPTG的最终浓度 1.0 mmol/1,此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境(停止通入氧气即可)，发 酵时间30h左右。
发酵结果30g底物甘油消耗完毕，未检测到3-幾基丙酸生成。
实施例5:工程菌K/efe&〃fl p恥wwom'ae ATCC25955-3- pUC18-aWH-TetR利用甘 油在3L发酵罐中产3-羟基丙酸
(1 ) 出发菌林A7efc/"/apwet/附omae ATCC25955-3-pUCl8-aWH- TetR; (2)种子培养基酵母膏4-5 g/L, 麦芽3.0-4.0 g/L, 蛋白胨4-5 g/L, NaCl 10 g/L ，四环素浓度20-40吗/L;
种子培养250mL三角瓶，装液量35mL,培养温度31-37 °C,摇床转 速120-180 r/min,培养12-24 h。 (3 )发酵培养
培养基组成酵母膏4-5 g/L, K2HP04'3H20 8-10 g/L， KH2P04 1.5-2.5 g/L, NH4C10.8-1 g/L, NaC10.5g/L, MgS04.7H20 0.08-0.12 g/L, FeCl3'6H20 25-35 mg/L， CoCl2.6H20 4-6 mg/L， VitaminB12 5 mg/L, glycerol 30 g/L。培养条件3 L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ)接种量10 % (v/v)， 发酵温度31-37 °C,接种6小时好氧发酵，加入IPTG, IPTG的最终浓度1.0 mmol/l，此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境(停止通入氧气即可)，发酵 时间30h左右。
发酵结果80g底物甘油经转化得到8.2g/L3-羟基丙酸。
对比例2:原始菌《/e&wW/a p朋wwom^ ATCC25955利用甘油在3 L发酵罐中产 3-轻基丙酸
(1) 出发菌林A7血/e〃a戸画o"/"e ATCC25955;
(2) 种子培养基酵母膏4-5 g/L，麦芽3.0-4.0 g/L，蛋白胨4-5 g/L, NaCl 10g/L,四环素浓度20-40昭/L;
种子培养250mL三角瓶，装液量35mL,培养温度31-37 。C,摇床转速 120-180 r/min,培养12-24 h。 (3 )发酵培养
培养基组成酵母膏4-5g/L, K2HP04'3H20 8-10 g/L, KH2P04 1.5-2.5 g/L, NH4C1 0.8-1 g/L, NaCl 0.5 g/L， MgS04'7H20 0.08-0.12 g/L, FeCl3'6H20 25-35 mg/L, CoCl2.6H20 4-6mg/L, VitaminB12 5 mg/L, glycerol 30 g/L。
培养条件3 L发酵罐(New Brunswick Scientific, NJ)接种量10 % (v/v), 发酵温度31-37 °C,接种6小时好氧发酵，加入IPTG, IPTG的最终浓度1.0 mmol/1,此后，控制氧气的通入量，维持微氧环境(停止通入氧气即可)，发酵 时间30h左右。
发酵结果80g底物甘油消耗完毕，未检测到3-幾基丙酸生成。序列表
<110>南京工业大学
<120>产3 -羟基丙酸的转化微生物及其构建方法和应用
<160>7
<210> 1
<211>2714
<212> DNA
<213>人工序列
<220〉
<221>CDS
<222> (1)…(2714)
<400〉 1
1 ATGGGTAAGC TGGAACGCAT TGCAGCCCGG CAGGATCGGG CCGCAGGCCG TGGGCCCACG
61 CGCCGCGGTT TTCTGCTTAC GGCCATGGGC TCGGCCTTTA TGTTCGGCTT TGCGCGGCAG
121 GGTAACGCTA CGCAGGTTTA TCCGCAGGCC GCAGGCAATC TGCCCGCCGG TGGTGCGTTT 181 GAACCCACAA TCTGGTGCTC CATTGCGCCA GATGGCTGGG TGAACGTAAA CGTTATTCGT 241 GCAGAAATGG GCCAGCATGT TGGCACCGCT CTTGCCCGGA TTATTGCCGA TGAAATGGAA 301 GCAGACTGGA ACAAGGTTAA GATCACCTAC GTGGATACAG ACCCCAAATG GGGCCTGATG
3 61 ATTACGGGTG GTTCCTGGTC TGTCTGGCTG ACGTGGGATC AGTTCCGCCA AGCTGGTGCG 421 GCAGCCCGCA CCGTGATGGT GGAAGAAGGT GCACGCCTGC TGGGTGTGGC ACCTTCTGCA
4 81 TGTATCGCAC GTAATGGACA GGTTATTGCG GGCAAGCGCT CCATTTCCTA CGGCGAAATT 541 GTAAGCCGTG CGCACCCCAC CCGCACCTTT ACGCCGGATG AAATGGCCAA GCTGCCGCTC 601 AAGCCTTCAT CCGAACACCG GTTGATCAGG CGTGAAGTCA AGGCGCTGGA TATTCCTTCC 661 AAAACAGATG GCACGGCCAT TTATGGCATT GATGCCAAGC TGGAAGGCAT GGTGTATGCC 721 CGCCCCAAAA TGCCGCCTAC GCGGTATGGC TCCAAAGTGG TTTCTGTTGA TGATACGGAA 7 81 GCCAAAAAGG TTAAGGGCTA TATCCGCTAC ATTGTGCTGG ATGATCCTTC CAACACAGTA 841 CCGGGCTGGG TGGCTGTTCT GGCTTCCTCC TACCCTGCTG CCATCCGCGC AACAGATGCC 901 CTGAAAGTAA CGTGGACACC GGGTAAAACC GCCAACGTGA CAGAACAGGA CATTATTGAG 961 CACGGCCGCA AGCAGATTGC CGAAAAAACC GGCGGTTCGC GCATCTTCAA TGATGCCGGA 1021 GTGGATGAGG CACTGGGTAA AGCCGATAAG GTGGTGGAAC GCACCTATAC GTGCTCTTCC 1081 GTGCTGCATT ATCAGCTGGA ACCCATGAAC GCCCTTGCCC GCCTGCATGA AGGCAAGTGG 1141 GAAGTACATT GCGGTAACCA GTGGCAGACC CTGTTCCTGC CCGTTATTGC CAAGGCGCTT 1201 CAGGTTCCTG AATCCGATGT GGTGATGCGC AGCTACCTGT TGGGTGGTGG TTTTGGCCGC 12 61 CGCCTGAACG GGGATTACGC AGTTCCCGCC GCGCTGATTT CCAAGGCACT GGGTGGCAAG 1321 CCTGTTAAAC TGGTGTTTAC CCGTTCTGAT GATGTGCTGT TTGATTCCAT CCGCTCACCG 1381 TCCATCCAGA CAGTGCGCGC TGGTGTTAAC AAGGATGGTT CCATTAACGG GTGGGAGCAT 14 41 CATGCCTCTG CCGGTTGGCC AACAGGCGTG ATGGCTGCCG CCTTTATGGA AAAAGGTGAA 1501 GACGGCAAAC CMACGATCA GTTCGCCATT GCAGGCGCTG ACCACTGGTA CGATGTCGGT 1561 CCCATTCTGG TGCGTGCACT GGATAATGAT TTGGCCGATG CCACATTCCG TCCCGGTTGG 1621 CTGCGTTCGG TCAGCTCCGG TTGGACACCT TGGGCGCATG AAAGCTTTTT GGATGAACTG 1681 GCCCATGATT ATGGGAAAGA TCCGGTTGAT TTCCGCCTTG GGCTGCTAAC ATGCAAGGGC 1741 CGTAATGCGG GCAGTGCTCC CAACTCTGTT GGTGGGGCAT CCCGTCAGGC CAATGTGCTT 1801 AAAAAGCTGG TGGAAAAGTG CGGTTACGGC AAAGTTAGCC TGCCGAAAGA TACGGCCATT 18 61 GGCATTGCCA CCACCTTTGG GCAAGAACGC AACATGCCAA CATGGACAGC AGGTGCCGCA 1921 CAAGTGCATG TTGACCGCGA AACAGGCGTT GTAACGTGCC AGAAAATCTG GCTGGTGCTG 1981 GATGCTGGCA CGATTATTGA CCCAGACGGC GCCTTGGCCC AGACCGAAGG CGGCGCACTG 2041 TGGGGCCTGA GCATGGCGCT GTTTGAAGGT ACGGAAATTG AAAACGGCAA CGTGCGTGAC 2101 CGTAACCTAA ACACCTATAC GCCCCTGCGT ATTACAGATG TGCCGGATAT GGATATTGAA 2161 TTCCTGCCCA GCACGGAAAA ACCCATGGGG CTTGGTGAAC CGGGTGTAAC CACCATTGCG 2221 CCAGCTATTG GCAACGCCAT TTTCAATGCT GTTGGCGTGC GTATGCGGCA CCTGCCCGTG 2281 CGCCCGGCTG ACMTTTGAA AGCGCTAAAA GAAAAAGGGA ACGCCTGAAT GATCAGTCCT 2341 GCTCCTCGGC CACGAAGTGC ACGCAGTTGC CGGCCGGGTC GCGCAGGGCG AACTCCCGCC 2401 CCCACGGCTG CTCGCCGATC TCGGTCATGG CCGGCCCGGA GGCGTCCCGG AAGTTCGTGG 24 61 ACACGACCTC CGACCACTCG GCGTACAGCT CGTCCAGGCC GCGCACCCAC ACCCAGGCCA2521 GGGTGTTGTC CGGCACCACC TGGTCCTGGA CCGCGCTGAT GAACAGGGTC ACGTCGTCCC
2581 GGACCACACC GGCGAAGTCG TCCTCCACGA AGTCCCGGGA GAACCCGAGC CGGTCGGTCC
2 641 AGAACTCGAC CGCTCCGGCG ACGTCGCGCG CGGTGAGCAC CGGAACGGCA CTGGTCAACT
2701 TGGCCATGGT TTAG
<210>2 <211〉2328 <212> DNA <213> aldH <400> 2
1 ATGGGTAAGC TGGAACGCAT TGCAGCCCGG CAGGATCGGG CCGCAGGCCG TGGGCCCACG
61 CGCCGCGGTT TTCTGCTTAC GGCCATGGGC TCGGCCTTTA TGTTCGGCTT TGCGCGGCAG
121 GGTAACGCTA CGCAGGTTTA TCCGCAGGCC GCAGGCAATC TGCCCGCCGG TGGTGCGTTT
181 GAACCCACAA TCTGGTGCTC CATTGCGCCA GATGGCTGGG TGAACGTAAA CGTTATTCGT
241 GCAGAAATGG GCCAGCATGT TGGCACCGCT CTTGCCCGGA TTATTGCCGA TGAAATGGAA
301 GCAGACTGGA ACAAGGTTAA GATCACCTAC GTGGATACAG ACCCCAAATG GGGCCTGATG
361 ATTACGGGTG GTTCCTGGTC TGTCTGGCTG ACGTGGGATC AGTTCCGCCA AGCTGGTGCG
421 GCAGCCCGCA CCGTGATGGT GGAAGAAGGT GCACGCCTGC TGGGTGTGGC ACCTTCTGCA
481 TGTATCGCAC GTAATGGACA GGTTATTGCG GGCAAGCGCT CCATTTCCTA CGGCGAAATT
541 GTAAGCCGTG CGCACCCCAC CCGCACCTTT ACGCCGGATG AAATGGCCAA GCTGCCGCTC
601 AAGCCTTCAT CCGAACACCG GTTGATCAGG CGTGAAGTCA AGGCGCTGGA TATTCCTTCC
661 AAAACAGATG GCACGGCCAT TTATGGCATT GATGCCAAGC TGGAAGGCAT GGTGTATGCC
721 CGCCCCAAAA TGCCGCCTAC GCGGTATGGC TCCAAAGTGG TTTCTGTTGA TGATACGGAA
7 81 GCCAAAAAGG TTAAGGGCTA TATCCGCTAC ATTGTGCTGG ATGATCCTTC CAACACAGTA
841 CCGGGCTGGG TGGCTGTTCT GGCTTCCTCC TACCCTGCTG CCATCCGCGC AACAGATGCC
901 CTGAAAGTAA CGTGGACACC GGGTAAAACC GCCAACGTGA CAGAACAGGA CATTATTGAG
961 CACGGCCGCA AGCAGATTGC CGAAAAAACC GGCGGTTCGC GCATCTTCAA TGATGCCGGA
1021 GTGGATGAGG CACTGGGTAA AGCCGATAAG GTGGTGGAAC GCACCTATAC GTGCTCTTCC
1〇81 GTGCTGCATT ATCAGCTGGA ACCCATGAAC GCCCTTGCCC GCCTGCATGA AGGCAAGTGG
1141 GAAGTACATT GCGGTAACCA GTGGCAGACC CTGTTCCTGC CCGTTATTGC CAAGGCGCTT
1201 CAGGTTCCTG AATCCGATGT GGTGATGCGC AGCTACCTGT TGGGTGGTGG TTTTGGCCGC
1261 CGCCTGAACG GGGATTACGC AGTTCCCGCC GCGCTGMTT CCAAGGCACT GGGTGGCAAG
1321 CCTGTTAAAC TGGTGTTTAC CCGTTCTGAT GATGTGCTGT TTGATTCCAT CCGCTCACCG
1381 TCCATCCAGA CAGTGCGCGC TGGTGTTAAC AAGGATGGTT CCATTAACGG GTGGGAGCAT
1441 CATGCCTCTG CCGGTTGGCC AACAGGCGTG ATGGCTGCCG CCTTTATGGA AAAAGGTGAA
1501 GACGGCAAAC CATACGATCA GTTCGCCATT GCAGGCGCTG ACCACT.GGTA CGATGTCGGT
1561 CCCATTCTGG TGCGTGCACT GGATAATGAT TTGGCCGATG CCACATTCCG TCCCGGTTGG
1621 CTGCGTTCGG TCAGCTCCGG TTGGACACCT TGGGCGCATG AAAGCTTTTT GGATGAACTG
1681 GCCCATGATT ATGGGAAAGA TCCGGTTGAT TTCCGCCTTG GGCTGCTAAC ATGCAAGGGC
1741 CGTAATGCGG GCAGTGCTCC CAACTCTGTT GGTGGGGCAT CCCGTCAGGC CAATGTGCTT
1801 AAAAAGCTGG TGGAAAAGTG CGGTTACGGC AAAGTTAGCC TGCCGAAAGA TACGGCCATT
1861 GGCATTGCCA CCACCTTTGG GCAAGAACGC AACATGCCAA CATGGACAGC AGGTGCCGCA
1921 CAAGTGCATG TTGACCGCGA AACAGGCGTT GTAACGTGCC AGAAAATCTG GCTGGTGCTG
1981 GATGCTGGCA CGATTATTGA CCCAGACGGC GCCTTGGCCC AGACCGAAGG CGGCGCACTG
2041 TGGGGCCTGA GCATGGCGCT GTTTGAAGGT ACGGAAATTG AAAACGGCAA CGTGCGTGAC
2101 CGTAACCTAA ACACCTATAC GCCCCTGCGT ATTACAGATG TGCCGGATAT GGATATTGAA
2161 TTCCTGCCCA GCACGGAAAA ACCCATGGGG CTTGGTGAAC CGGGTGTAAC CACCATTGCG
2221 CCAGCTATTG GCAACGCCAT TTTCAATGCT GTTGGCGTGC GTATGCGGCA CCTGCCCGTG
2281 CGCCCGGCTG ACMTTTGAA AGCGCTAAAA GAAAAAGGGA ACGCCTGA
<210>3 <211>386 <212>DNA <213> Zeocin <400〉 3
1 ATGATCAGTC CTGCTCCTCG GCCACGAAGT GCACGCAGTT GCCGGCCGGG TCGCGCAGGG61
121
181
241
301
361
CGAACTCCCG GGAAGTTCGT ACACCCAGGC TCACGTCGTC GCCGGTCGGT CACTGGTCAA
CCCCCACGGC GGACACGACC CAGGGTGTTG CCGGACCACA CCAGAACTCG CTTGGCCATG
TGCTCGCCGA TCCGACCACT TCCGGCACCA CCGGCGAAGT ACCGCTCCGG GTTTAG
TCTCGGTCAT CGGCGTACAG CCTGGTCCTG CGTCCTCCAC CGACGTCGCG
GGCCGGCCCG CTCGTCCAGG GACCGCGCTG GAAGTCCCGG CGCGGTGAGC
GAGGCGTCCC CCGCGCACCC ATGAACAGGG GAGAACCCGA ACCGGAACGG
<210>4 <211>29 <212〉 DNA <213>合成引物 <400> 4
1 GAATTCATGG GTAAGCTGGA ACGCATTGC
<210> 5 <211>29 <212> DNA <213>合成引物 <400> 5
1 TCTAGATCAG GCGTTCCCTT TTTCTTTTA
<210>6 <211>26 <212>DNA <213>合成引物 <400> 6
1 CTGCAGATGA AATACTGAAT TTAAAA
<210>7 <211>26 <212> DNA <213>合成引物 <400> 7
1 AAGCTTCTTA ACGATTTAGA AATCCC
权利要求
1. 一种含有重组载体的转化微生物，其中该重组载体含有基因编码SEQ IDNO.1所示核苷酸序列表达的蛋白质。
2. —种制备转化微生物的方法，包括将基因编码SEQ ID NO.l所示核苷酸序列导入到宿主。
3. 根据权利要求2所述的制备转化体的方法，其特征在于所述宿主为肺炎克雷伯氏菌。
4. 根据权利要求3所述的制备转化微生物的方法，其特征在于制备步骤为利用PCR技术从醋酸杆菌基因组中扩增出如SEQ ID N0.2所示含2328个碱基对的醛脱氢酶基因aldH，从质粒载体pHY300PLK中扩增出如SEQ ID N0.3所示含1560个碱基对的四环素抗性基因TetR,将其串联到表达载体pUC18中，得到重组质粒pUC18-aldH-TetR，重组质粒转化筛选获得的肺炎克雷伯氏菌，得到重组肺炎克雷伯氏菌。
5. 根据权利要求4所述的制备转化微生物的方法，其特征在于制备步骤为(l)基因aWH的克隆根据Genebank公布的醋酸杆菌中aWH基因的序列设计合成PCR所需的引物PI: 51- GAATTCATGGGTAAGCTGGAACGCATTGC -31P2: 51- TCTAGATCAGGCGTTCCCTTTTTCTTTTA -31引物两端分别引入五coi I ， JKw /酶切位点，以醋酸杆菌基因组DNA为模板完成PCR反应PCR反应条件95。C变性5min,经94。C30sec,52。C30sec, 72。Clmin40sec 30个循环，再经过72。C延伸3min,获得的PCR产物经电泳分析确:〖人，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，进行序列测定，Z&a/酶切重组pMD18-simple-T载体，回收其中1.56kb片段，连接至pUC18载体，获得重组质粒pUC18-aWH;(2)基因TetR的克隆根据质粒载体中pHY300PLK四环素抗性基因序列设计合成PCR所需的引物P3: 5 L CTGCAG ATGAAATACTGAATTTAAAA-31P4: 5 L AAGCTT CTTAACGATTTAGAAATCCC-31引物两端分别引入尸M,历"d III,以质粒pHY300PLK为模板完成PCR反应PCR反应条件95。C变性5min，经94 °C30 sec, 52°C30 sec, 72°C1min20 sec 30个循环，再经过72。C延伸3min,获得的PCR产物经电泳分析确认，经PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18-simple-T载体连接，经历m/in酶切回收其中1.56kb片段，连接至pUC18-fl^H载体，得到重组质粒pUC18-a/JH-TetR;(3)转化微生物的获得将重组质粒pUC18-aMH-TetR通过电击转化的方式转化肺炎克雷伯氏菌，涂布含40吗/m L的四环素平板，挑取阳性转化子，得到重组肺炎克雷伯氏菌。
6. 权利要求1所述含有重组载体的转化微生物在生产3-羟基丙酸中的应用。
7. 根据权利要求6所述的转化微生物在生产3-羟基丙酸中的应用，其特征在于生产工艺为(1 )种子液的培养将接种后的培养液在31-37 °C,摇床转速120-180r/min的条件下培养12-24 h;所述培养液组成为酵母膏4-5g/L， 麦芽3.0-4.0 g/L, 蛋白胨4-5 g/L, NaCl 10 g/L,四环素浓度20-40 pg/L;(2)发酵培养培养条件为接种种子液的量为占培养基体积5-10 %,发酵温度31-37 。C，接种6-8小时好氧发酵，加入IPTG， IPTG的最终浓度1.0 mmol/L,此后，控制氧气的通入量，维持孩i氧环境，发酵时间30 h左右；其中培养基组成为酵母膏4-5 g/L，K2HP04'3H20 8-10 g/L， KH2P04 1.5-2.5 g/L， NH4C1 0.8-1 g/L,NaCl 0.5 g/L, MgS04'7H20 0.08-0.12 g/L, FeCl3'6H20 25-35mg/L, CoCl2'6H20 4-6 mg/L, VitaminB12 5 mg/L, glycerol 30g/L。
全文摘要
一种含有重组载体的转化微生物，其中该重组载体含有基因编码SEQ IDNO.1所示核苷酸序列表达的蛋白质。一种制备转化微生物的方法，包括将基因编码SEQ ID NO.1所示核苷酸序列导入到宿主。所述含有重组载体的转化微生物在生产3-羟基丙酸中的应用。质粒在宿主菌株中稳定性高，而且生产菌株较合适，产物终浓度有竞争力，另外还可在发酵过程中添加微量四环素，达到抑制部分杂细菌的目的，大大减少了在工业化过程中较易发生的染杂菌现象，发酵时间也有所缩短，为微生物发酵法工业化生产3-羟基丙酸奠定了良好的基础。
文档编号C12N1/00GK101519635SQ200910029279
公开日2009年9月2日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日 公开号200910029279.发明者丁月月, 朱建国, 霜 李, 军 杜, 纪晓俊, 和 黄 申请人:南京工业大学 被以下专利引用 (1),