专利名称：重离子辐射诱导染色体断裂计算方法
技术领域：
本发明主要涉及重离子辐射诱导染色体断裂计算方法，尤其涉及细胞接受重离子照 射后发生染色体断裂的细胞的数目的计算方法。
背景技术：
-重离子是目前放射治疗领域内公认的最有效的粒子，这是因为它具有显著优于其它 普通射线如X射线的生物物理学特性(Kraft G Tumor therapy with heavy chafed particles. Progress in particle and nuclear physics, 2000，45:s473-544)。如高的相对生物学效应、低的 氧增比、低的修复效应、低侧向散射等。 一般认为，生物材料对不同射线的辐射敏感性 决定了辐射导致生物学终点的差异。国外曾报道应用早熟染色体凝集技术来研究细胞在接受射线照射后染色体损伤状 况，这是一种快速而精确的研究方法。但是这种方法仅仅应用于研究辐射诱导的染色体 损伤，没有明确提出染色体损伤和细胞辐射敏感性之间的必然关系，更没有理论计算方 法的报道
发明内容
-本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种重离子辐射诱导染色体断 裂计算方法。通过计算，得到了 UC^离子照射人正常肝细胞L02后不同吸收剂量点的染 色体断裂产额，与应用早熟染色体凝集技术实验中实际获得的染色体断裂产额基本吻合。 本发明可以快速精确地计算不同种类的肿瘤细胞在接受重离子射线照射后细胞内发生染 色体断裂的数目，为重离子治疗癌症的治疗计划制定过程中细胞辐射敏感性预测提供依 据。本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现 一种重离子辐射诱导染色体断裂 计算方法，其特征包括有A.培养受试细胞，待其处于指数生长期进行下面的操作；B. 测定该细胞在培养瓶内平铺状态时的表面积；C.应用流式细胞仪测定G2期细胞的含量；D.测定照射该细胞时采用的射线的平均LET; E.测定受照射细胞的数目N; F.测定细胞培 养瓶的内底面积；G.将上述测定值代入以下方程式求解Fx- r7V =-(3)5xl06x2式中N为测定受照射细胞的数目；F为离子通量。12<:6+离子与染色体相互作用诱发染色体断裂是12^离子在染色体中发生能量阻止，将其能量传递给染色体的过程。因此染色体断裂的产额与单位细胞内注入的离子数相关， 也就是说，与单位面积上的离子通量相关。剂量与离子通量之间的关系可以用下面的公 式表不(Kraft G Tumor therapy with heavy chained particles. Progress in particle and nuclear physics, 2000,45 :s473-544)D = 1.602xl0—9xFxZ五rx^" (1)P材料式中D为细胞吸收剂量，F为离子通量，LET为。C^离子到达细胞时的线性传能密 度，P材料是被照射靶的密度，细胞是照射的靶，我们将其密度近似为水的密度，即 lg/cm3。那么对应于不同的剂量，实时离子通量可以表示为-1.602x10—9 x丄五r假设每一个120^离子可以有效地击中染色体并产生一个断裂，那么在接种4> 35mm培养 皿内的L02细胞接受照射后平均每细胞内染色体断裂的细胞的数目可以表示为W =--#~ (3)5xl06x2(3)式为理论计算公式。在治疗计划的制定过程中，细胞的数目受射线均匀度、细胞覆盖率及染色体密度因 素的影响，如果忽略了这些因素，那么细胞辐射敏感性测定结果在临床上应用的可信度 就会大大降低，所以，我们建立计算模型的重点就在于对上述三个影响因素的修正。我们把这些因素的修正过程分别称为射线均匀度调制K,、细胞覆盖率测定Ks和染色体密 度近似K3，那么现在可以把细胞接受射线照射后染色体发生断裂的细胞的数目表示为<formula>formula see original document page 5</formula>其中，^// &/^&为培养皿内待照射细胞的数目。K,是射线LET的修正因子， 因为对于任何一种辐射，其LET都不是一个恒定值，必然存在着波动，可以将不同 时段的LET实测值求均值来计算K1:<formula>formula see original document page 5</formula>其中，力tfe/血为多次实时测定的LET值之和，"是测定次数，^'/血'是由监测，数据计算得到的该射线的单次LET值。K2是细胞覆盖率，生长中的细胞不是完全紧靠在一起的，对于不同的细胞，可 以计算出它们平铺时的面积，那么，在细胞辐射敏感性的测定中K2可以表示为2 — 祁2 /4 S^是单个细胞的平铺面积，；r一/4是培养皿的内底面积。细胞周期的不同时相，细胞内染色质的凝聚状态和含量各不相同，虽然这种状 态对细胞物理密度的影响不是很大，但是其凝聚状态和含量与射线和细胞作用的截 面却密切相关，在计算染色体断裂时，G2期细胞染色体形态易于分辨，因此染色体 密度近似K3可以表示为<formula>formula see original document page 5</formula>其中，GO, Gl， G2， S， M表示细胞在该周期时相的含量。K3的值等于G2期细胞的百分含量。本发明的有益效果是，这一属于生物技术领域的肿瘤细胞接受重离子照射后细胞内 发生染色体断裂理论计算模型的建立可以解决重离子临床放射治疗计划制定时肿瘤细胞 辐射敏感性预测的瓶颈。该模型的应用可以在非在线的情况下快速精确地测定肿瘤细胞 对重离子射线的辐射敏感性。
；图1为理论计算得到的细胞染色体断裂细胞的数目与吸收剂量之间的关系。图2为L02细胞在接受不同剂量的UC"离子照射后细胞不同程度的染色体断裂。 图3为理论计算的染色体断裂细胞的数目与实验值与吸收剂量都呈线性正相关关具体实施方式
-实施例l: 一种重离子辐射诱导染色体断裂计算方法，包括有步骤l:培养受试细胞，待其处于指数生长期进行下面的操作；人正常肝细胞系L02 (购自CCTCC)用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液在37'C， 5% C02的恒温培养箱内培养，培养基内另加入胰岛素0.25U/ml。细胞浓度为5xl0Vml。步骤2:测定该细胞在培养瓶内平铺状态时的表面积 将充分混匀的2ml L02细胞悬液接种在(b35mm的一次性培养皿中。 歩骤3:应用流式细胞仪测定G2期细胞的含量； 在其发生一次倍增时进行照射。歩骤4:测定照射该细胞是采用的射线的平均LET;采用兰州重离子加速器装置产生的单核能为肌55MeV/u的12(^离子，经13.58mm Lucite(P-1.2g/cm"降能，最后达到细胞表面的总能量为240MeV，在水中射程1.41mm， LET为96.05keV/u m。辐照装置终端引出束流的照射样品直径4^35mm，均匀度为71%。实验照射剂量为0， 0.5， 1， 2， 4， 6， 8Gy，被照射样品处在束流Bragg布喇格峰区。步骤5:测定受照射细胞的数目； 步骤6:测定细胞培养瓶的内底面积；步骤7:将上述测定值代入以下方程式求解断裂细胞的数目N:<formula>formula see original document page 6</formula>(3)5xl0"x2其中F=65022880计算结果理论断裂细胞的数目N为见图1。
图1为理论计算得到的细胞染色体断裂细胞的数目与吸收剂量之间的关系。通过理论计算，得出了染色体断裂产额与离子通量之间具有正相关的线性增长趋势。 理论模拟值在N-1时比实验中的实测值小，当N-3时理论值和实验值之间的一致性良 好。从理论上推算，实验中每一个^C^照射细胞可产生大约三个染色体断裂，三个染色 体断裂的类型分布可能是1染色单体断裂+1等点染色单体断裂。随着剂量的增加，也 即离子通量增大，两种类型染色体断裂的比例分布差距逐步增加。实验值和理论值之间存在差距的原因可能在于以下几个方面理论计算值限定的条件是离子束的均匀度应大于95%，而这次束流的均匀度只达到了 71%,有证据表明[l], 束流均匀度的大小与生物效应密切相关，高的均匀度可以产生高的生物学效应。在理论 计算的预设条件中定义一个离子只产生一个染色体断裂。实施例2: —种重离子辐射诱导染色体断裂计算方法，实际断裂细胞的数目计算为-<formula>formula see original document page 7</formula>此次实验，我们获得的以下参数的值分别为F=65022880; —0.06m; Numberceu^30000; K!^0.99; K2=0.05; K3=0.2; N，=23.78 (在 剂量为10Gy时,与实验值很接近)上述结果用熟凝集染色体制备方法和染色体断裂断裂细胞的数目实验值进行验证 (本验证方法见同日申报的应用早熟染色体凝集预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法)熟凝集染色体制备方法和染色体断裂断裂细胞的数目实验值Calyculin-A花萼海绵素(购自美国BIOMOL公司)是一种良好的PCC诱导剂[Gotoh E， Kawata T and Durante M. Chromatid break rejoining and exchange aberration formation following y-ray exposure: analysis in G2 human fibroblasts by chemical-induced prematurechromosome condensation. Int J Radial Biol， 1999,75(6): 1129-1135]、 [Kawata T, Gotoh E, Durante M， et al. High-LET radiation-induced aberrations in prematurely condensed G2 chromosome of human fibroblasts. Int J Radiat Biol， 2000，76(5):929-938〗，将其溶于100% 的乙醇里制成lmmol/L的储存液。照射前将其加入需照射细胞的培养液内，终浓度为 50nmol/L。细胞经照射后在37"C， 5%C02的恒温培养箱内继续培养30分钟。收集细胞， 75mmol/LKCl低渗处理20min，卡诺氏液固定，最后以少量固定液悬浮细胞，滴片，在 热蒸汽上烘干，5n/。Giemsa染色。按照 Savage 塞维杰[Savage JR. Classification and relationships of induced chromosomal structural changes. J Med Genet, 1976,13(1):103-122]报道的标准，每个剂量点 观察不少于40个的G2期细胞，求出这些细胞内染色单体和等点染色单体的平均断裂数， 即为该剂量点的染色单体和等点染色单体断裂数，每个等点染色单体断裂被计为两个断 裂。统计处理数据采用SPSS社会科学统计软件包进行统计分析，结果以M±SD表示。 假设每一个。C^离子击中细胞可产生一个染色体断裂。图1为是理论计算得到的细胞染色体断裂细胞的数目与吸收剂量之间的关系。从图中可以看出，染色体断裂的细胞的数目与剂量之间呈线性正相关关系，由算式(1)可知离子通量与剂量之间也是正相关的，所以，染色体断裂的细胞的数目正相关于离子通量。图2为L02细胞在接受不同剂量的120^离子照射后，应用早熟染色体凝集技术观测到了细胞内发生了不同程度的染色体断裂。染色体断裂的形式有染色单体断裂 (chromatid break)和等点染色单体断裂(isochromatidbreak)两种，可以看到，随着剂量的增加，两种形式的染色体断裂细胞的数目都相应增加。在每一个剂量点，等点染色单体断裂的细胞的数目都显著地高于染色单体断裂。每一个等点染色单体断裂可以计数为两个染色体断裂，那么实验领機的染色体断裂 总细胞的数目等于染色单体断裂细胞的数目和两倍的等点染色单体断裂细胞的数目之 和。从图3可以看出，理论计算的染色体断裂细胞的数目与实验值与吸收剂量都呈线性 正相关关系。假设每一个^C^离子照射细胞只产生一个染色体断裂(N=l)，那么理论 值和实验值之间存在很大差距，当每一个UC^离子照射细胞产生三个染色体断裂(N=3) 时，理论值和实验值之间符合良好。实际断裂细胞的数目计算值N'和实验值之间符合 良好。图3为理论计算的染色体断裂细胞的数目与实验值与吸收剂量都呈线性正相关关系。和普通射线，如X射线相比，重离子具有特有的生物物理性质，如高相对生物学效 应、低氧增比、低修复效应、低侧向散射等，这使得重离子成为目前肿瘤放射治疗手段 中最优化的放射束。高的相对生物学效应直接决定了重离子的肿瘤杀伤效率，即用等同 于普通射线的剂量可以达到数倍于普通射线的治疗效果。由于细胞内生物酶系统的应激启动不是即时的，所以染色体损伤的修复要在细胞损伤后2-12小时内进行。可见，重离 子辐照细胞后产生的原初染色体断裂是完全物理作用的结果，和普通射线相比，普通射 线照射细胞，产生的染色体断裂多为染色单体断裂，而重离子射线由于具有的高的线性 传能密度，在单位体积的靶物质内损失的能量远高于普通射线，对染色体而言，单个的 重离子轰击可能会产生多个染色体断裂，这是重离子具有高RBE的很重要的因素。综合看来，如果充分考虑到各种随机因素和客观偏差，重离子辐照L02细胞导致染 色体断裂的产额理论值和实验值的一致性是良好的。提示在应用重离子束放射治疗恶性 肿瘤的临床治疗计划中，可以通过理论计算预测该束流对于特定肿瘤细胞的相对生物学 效应，这样不仅可以较为精确地设定并优化辐射总剂量，而且避免了在线测试。大大降 低了辐射风险。
权利要求
1.一种重离子辐射诱导染色体断裂计算方法，其特征包括有A.培养受试细胞，待其处于指数生长期开始进行操作；B.测定该细胞在培养瓶内平铺状态时的表面积；C.应用流式细胞仪测定G2期细胞的含量；D.测定照射该细胞时采用的射线的平均线性能量转移LET；E.测定受照射细胞的数目N；F.测定细胞培养瓶的内底面积；G将上述测定值代入以下方程式求解细胞的数目
2. 如权利要求1所述的重离子辐射诱导染色体断裂计算方、法，其特征还包括有细胞的数 目为<formula>formula see original document page 2</formula> (4)
3.如权利要求2所述的重离子辐射诱导染色体断裂计算方法，其特征还包括有:<formula>formula see original document page 2</formula>(5)
4. 如权利要求2所述的重离子辐射诱导染色体断裂计算方法，其特征还包括有<formula>formula see original document page 2</formula>(6)
5. 如权利要求2所述的重离子辐射诱导染色体断裂计算方法，其特征还包括有-<formula>formula see original document page 2</formula> (7)
全文摘要
本发明主要涉及重离子辐射诱导染色体断裂计算方法，尤其涉及细胞接受重离子照射后发生染色体断裂的细胞的数目的计算方法。一种重离子辐射诱导染色体断裂计算方法，其主要特点包括有A.培养受试细胞，待其处于指数生长期进行下面的操作；B.测定该细胞在培养瓶内平铺状态时的表面积；C.应用流式细胞仪测定G<sub>2</sub>期细胞的含量；D.测定照射该细胞时采用的射线的平均LET；E.测定受照射细胞的数目N；F.测定细胞培养瓶的内底面积；G.将上述测定值代入方程式求解。本发明的优点是，这一属于生物技术领域的肿瘤细胞接受重离子照射后细胞内发生染色体断裂理论计算模型的建立可以解决重离子临床放射治疗计划制定时肿瘤细胞辐射敏感性预测的瓶颈。该模型的应用可以在非在线的情况下快速精确地测定肿瘤细胞对重离子射线的辐射敏感性。
文档编号G06F19/00GK101126697SQ20061010503
公开日2008年2月20日 申请日期2006年8月15日 优先权日2006年8月15日
发明者李文建, 杨建设 申请人:中国科学院近代物理研究所