专利名称：：深山草莓花瓣诱导变异植株品种培育方法
技术领域：
：本发明涉及植物培育技术，即深山草莓花瓣诱导变异植株品种培育方法。
背景技术：
：在现有技术中，深山草莓Fragariaorientatesvar.concolor(Kitag.)另lj名绿口十东方草莓。是蔷薇科草莓属多年生草本植物，为长白山野生种草莓。其聚合果肉质、膨大较小、味酸甜、有香气、果形为球形或卵形、产量极低，成熟后紫红色。仅呈小群落分布于长白山海拔800-1200m的草地和林下，是草莓育种的优良野生种质资源。草莓一般采用匍匍茎繁殖，其后代性状易退化，造成产量下降。草莓在组织培养过程中，受培养基和环境条件的影响有可能发生变异。组织培养苗发生变异可能与培养材料、培养温度、继代次数、激素以及浓度配比等有关。深山草莓是长白山野生植物资源，关于利用野生草莓花瓣诱导变异植株和在变异植株中筛选优良性状品种的报道国内外尚未见。
发明内容本发明的目的是针对上述不足而提供一种以深山草莓花瓣为培养材料，培育草莓优良品种的深山草莓花瓣诱导变异植株品种培育方法。本发明的技术解决方案是深山草莓花瓣诱导变异植株品种培育方法包括将深山草莓未开放花蕾剪下消毒、插入LS培养基中待花蕾开放后取花瓣进行诱导愈伤组织、愈伤组织再分化芽苗、生根培养、移栽。诱导深山草莓花瓣产生愈伤组织的适宜培养基为LS+TDZ2.06mgL—1+2，4-DO.60mg.L—、其中TDZ为N-苯基N1-1，2，3-噻二唑-5-脲，2，4-D为2，4-二氯苯氧乙酸。mgL一工也可以表示为mg/L。所述的愈伤组织再分化芽苗和变异植株发生培养基为1/2LS+TDZ2.30mglT1+NAA0.10mgL—1+KT1.30mgL—、其中NAA为a-萘乙酸，KT为6-糠氨基嘌呤。所述的消毒是指将深山草莓未开放花蕾剪下，在超净工作台上用70%酒精涮洗30s，再用0.5%次氯酸钠溶液浸泡10min，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干表面的水分。所述的生根培养基为1/2LS+IAA0.05mg'L—、其中IAA为吲哚乙酸。LS为常规培养基，具体为Linsmaier和Skoog于1965年发明的培养基，其成分包括硝酸铵165QmgL—、硝酸钾1900mgL—、二水氯化钙400mgL—、七水硫酸镁370mgL一1，磷酸二氢钾170mg.L—、螯合钠37.3mg.L—、七水硫酸亚铁27.8mgL—、四水硫酸锰22.3mgL—、七水硫酸锌8.6mgL—、硼酸6.2mgL—、碘化钾O.83mgL一1，二水钼酸钠O.25mgL—、五水硫酸铜O.025mgL—、六水氯化钴O.025mgL—、盐酸硫胺素O.4mgL—、肌醇IOOmgL—、蔗糖30000mgL一1。我们发现在正常情况下，用茎尖作培养材料，几乎不发生变异或变异率较低，而用花瓣诱导出愈伤组织，再诱导愈伤组再分化芽苗的方法，其变异率较高。本研究证明，深山草莓花瓣在适当配比的激素诱导下可产生变异植株，并能趋向优良性状变异，达到了预期目的。通过上述方法，可以培养出具有丰产、优质等优良性状的新品种草莓，该品种生长健壮，植株大，多级花序，每支花序有4-5朵花，花器大，花粉量多。果实酸甜适中，香味浓郁，果皮硬度极大。初步测定含糖9.7-11.3%，可溶性固形物10.6-14.3%，维生素C129.40mg/100g，一级序平均单果重62.4g，最大果重90g以上。丰产抗病力好，大果、商品果比例高。目前，该品种已进行放大栽培试验和多地区试验阶段。本发明的优点是1、通过深山草莓花瓣诱导再生植株和变异植株的试验，获得具有优良性状的变种。2、本发明采用均匀设计法对影响深山草莓花瓣愈伤组织、愈伤组织再分化芽苗及变异植株发生的激素浓度配比进行优化组合筛选，避免了全面试验的繁琐和不可操作性，并縮短了试验的周期。3、结果表明，诱导深山草莓花瓣产生愈伤组织的适宜培养基为:LS+TDZ2.06mgL—1+2，4-DO.60mgL—、诱导率为98%;愈伤组织再分化芽苗的适宜培养基为1/2LS+TDZ2.30mgL—、NAA0.10mgL—、KT1.30mgL—、分化率为96.3%。经田间栽培观察变异率达1.98%。生根培养基为1/2LS+IAA0.05mgL—、4、本发明为深山草莓的开发利用和草莓的育种提供种质资源和奠定实践基础，对其它野生种草莓的花瓣诱导变异植株和筛选优良品种有一定的参考意义。下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。具体实施例方式深山草莓花瓣诱导变异植株品种培育方法1、材料与方法1.1试材深山草莓花瓣。1.2方法1.2.l材料处理将深山草莓未开放花蕾(带3cm花柄)剪下，在超净工作台上用70%酒精涮洗30s，再用次氯酸钠(质量比为O.5%)溶液浸泡IOmin，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干表面的水分，切除损害花柄留2cm。将花蕾(花柄朝下)插入LS培养基中，待花蕾开放后以便取花瓣进行诱导愈伤组织。1.2.2深山草莓花瓣愈伤组织诱导培养基的筛选以LS为基本培养基，内含蔗糖20g'L—、琼脂粉7.5g*L—、再附加不同质量浓度的细胞分裂素TDZ(由预试验确定为1.402.40mgL—^和生长素2，4-D(由预试验确定为O.10—0.60mgL—^，调节pH为5.6，外植体在温度(23士2)。C、光照强度25ymol'm—2s—、光照周期IOhd—工条件下培养，为了提高深山草莓花瓣愈伤组织的诱导速度和诱导率，采用均匀设计法，每个处理接种花瓣数为10，重复3次，选用Un(ll勺均匀表(表l)，考察6-BA和2，4-D不同质量浓度交叉配比对诱导率的影响。花瓣培养45d统计愈伤组织诱导率，筛选最适合诱导深山草莓花瓣产生愈伤组织的i昔养基。表1深山草莓花瓣愈伤组织诱导培养基的Un(ll勺因素及水平设计<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>1.2.3深山草莓花瓣愈伤组织再分化芽苗和变异植株发生培养基的筛选以1/2LS为培养基，加入蔗糖30g*L—、琼脂7.5gL—、并附加不同浓度的TDZ(由预试验确定为2.30—3.20mg'L—4、NAA(由预试验确定为O.10—0.30mgL—^和KT(由预试验确定为O.80—1.30mg*L—^，调节pH为5.6，将花瓣诱导产生的愈伤组织切割成小块，愈伤组织的小块在温度(23士2)。C、光照强度20ymol'm—、s—1、光照周期8hd—i条件下培养。为了提高深山草莓花瓣愈伤组织的芽苗分化速度和分化率，采用均匀设计法，每个处理接种茎段数为IO，重复3次，选用1]1()(103)均匀表(表2)，考察生长素TDZ、NAA和KT不同质量浓度交叉配比对分化率的影响(表4)。愈伤组织培养40d统计分化率，筛选最适合深山草莓花瓣愈伤组织芽苗分化的培养基。花瓣愈伤组织分化的芽苗继代3次后，待苗长至1.50—2.00cm时，将芽苗从愈伤组织上切下，接种到生根培养基上进行生根培养，生根后进行分组炼苗移栽，观察苗的形态、花、果等特征，统计变异植株的发生率，即变异率(变异标准以随机1000株苗中，与深山草莓母本性状表现差异显著，变异率为3次抽样的平均值)。从变异植株中筛选优良性状草莓品种，进行匍匍茎尖培养，区试、大面积栽培观察和检测其遗传稳定性。表2深山草莓花瓣愈伤组织再分化芽苗和变异植株诱导培养基的Un)(10勺因素及水平<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1.3数据处理与分析采用均匀设计法进行初步规律设计性试验，数据分析处理应用均匀设计软件(UniformDesign3.OV)。2结果与分析2.1TDZ和2，4-D浓度配比对深山草莓花瓣愈伤组织诱导的影响由表3试验结果可得回归方程￥=40.0+16.5Xi+24.0X2，样本容量N41，显著性水平a=0.01，经计算，复相关系数R=0.8979，剩余标准差3=3.13，检验值Ft二16.64，临界值F(o.oi，2，8)=8.649，Ft〉F(o.(u，2，8)，表明回归方程有意义。对各方程项进行显著性检验可知各方程项对Y影响均显著。根据回归方程求出Y的最优组合为X1=2.40，X2=0.60，在此组合基础上求得最优解y=93.9，此解为回归方程的解析解，需按公式y士Ua"S(其中Ua为正态分布的双侧分位数，s为剩余标准差)计算出优化值区间估计为Y二93.9±0.5，g口83.4%—103.4%。通过表3试验结果和回归方程及愈伤组织诱导情况可知，TDZ超过2.00mgL—4寸花瓣愈伤组织诱导率下降，TDZ和2，4-D均与诱导率呈正相关，计算各方程项对回归的贡献值可知，U(1)=271，U(2)=148，g口TDZ和2，4-D对回归的贡献率为Ua)/U二82.9%，U(2)/U=45.2%，说明TDZ大于2，4-D对深山草莓花瓣愈伤组织诱导的贡献。以免TDZ在2.00—2.10mgL^之间有较高诱导率的峰值，又以TDZ为2.00、2.01、2.02、2.03、2.04、2.05、2.06、2.07、2.08、2.09和2.10mg.L一、2，4-D0.60mgL—"故了1l个处理的试验，发现TDZ在2.06mgL—4寸花瓣愈伤组织诱导率最高。因此，将深山草莓花瓣接种到附加TDZ2.06mgL—^口2，4-D0.60mg1T^勺LS培养基上进行花瓣愈伤组织诱导的验证试验，重复3次。培养18d，花瓣逐渐增厚变形；继续培养至45d，花瓣完全脱分化为黄白色愈伤组织，愈伤组织诱导率达98%以上，在估计区间内，且比表3中11个处理的诱导率均高。因此，深山草莓花瓣愈伤组织诱导的最佳培养基为LS+TDZ2.06mgL—、2，4-D0.60mgL一1。表3深山草莓花瓣愈伤组织诱导培养基的Un(ll勺均匀设计试验安排与结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.2TDZ、IAA和KT浓度配比对深山草莓花瓣愈伤组织再分化芽苗及变异植株发生的影响根据表4试验结果可得回归方程Yf52.8-27.9X广130X2+96.6X3，样本容量N40，显著性水平(1=0.01，经计算，复相关系数R4.9982，剩余标准差3=1.18，检验值Ft二565.1，临界值F(o.(n，3，6)二9.780，Ft〉F(o.(u，3，6)，显著，说明回归方程有意义。对各方程项进行显著性检验可知，各方程项对Y工影响均显著。根据回归方程求出Y的最优组合为X1=2.30，X2=0.10，X3=1.30，在此组合基础上求得最优解y=101.0，此解为回归方程的解析解，同理，按公式Y二y士u。s计算出优化值区间估计为Y^01士4.37，即96.63%105.37%。通过表4试验结果和回归分析结果可知，各方程项对回归的贡献值和回归贡献率(按偏回归平方和降序排列)分别为U(3)=2.30e+3，U(3)/U=97.6%;U(2)=25.6，U(2)/U=l.09%;U(1)=19.3，U(1)/U=0.822%，即KT对分化率Y!的贡献远远大于TDZ和NAA，由预试验可知KT超过l.30mg"L一4寸花瓣愈伤组织芽苗分化率仅12.8。/。，猜测KT浓度为1.30mgL—4寸已过量，并对芽苗分化起抑制作用。为此，又以KT质量浓度为1.20、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29和1.30mgL—、并附加TDZ2.30mgL—^口NAA0.10mgL—"故了11个处理的试验，发现KT质量浓度为1.30mgL—4寸愈伤组织分化率最高且分化速度快。因此，将花瓣愈伤组织小块接种到附加TDZ2.30mgL—、NAA0.10mgL—工和KT1.30mgL—^勺1/2LS培养基进行再次验证试验，接种数为30，每瓶接种3块，重复3次。培养18d时，发现愈伤组织表面有球形颗粒出现，继续培养至25d，颗粒由球形逐渐转变为锥状，培养至35d，锥状体逐渐生长伸长为带有2—3个小叶片的芽苗，45d后苗高可达1.50cm以上，分化率达96.3%以上。在估计区间内，且比表4所列10个处理的分化率均高。可见，深山草莓花瓣愈伤组织芽苗分化的最佳培养基为1/2LS+TDZ2.30mgL一工+NAA0.10mgL一工+KT1.30mg.L-1。待花瓣愈伤组织分化的芽苗长至1.50—2.00cm时，将芽苗从愈伤组织上切下，接种到1/2LS+IAA0.05mgL—i培养基上进行生根培养，待根长至l.00cm，苗高达2.50cm以上时，将生根苗从培养瓶中取出，在含有5mg*L—工高锰酸钾溶液中洗去肉质根上残留的琼脂，然后按处理号分成10组分别植入经100倍杀毒矾消毒过的田园土和河砂(3:1)混合的基质中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在75%，温度控制在(18士2)°C，每天自然光照9h，每天通风换气一次，7d后可揭去薄膜，每天傍晚喷洒清水l次。成活率达97%以上。2.3TDZ、IAA和KT浓度配比对深山草莓花瓣愈伤组织再分化变异植株的影响炼苗结束后，苗长至IO.OOcm时，将10组苗分别双行定植在宽80cm的畦上，给与合理水肥，待匍匍茎苗长出且花芽分化后，选壮苗定植温室用于生产的畦上。观察各组苗的形态、花、果等特征，统计植株的变异率，结果见表4。对变异率的统计结果进行回归分析，结果如下。根据表4试验结果可得回归方程<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>，样本容量N40，显著性水平a=0.01，经计算，复相关系数R4.9523，剩余标准差3=0.250，检验值Ft二34.07，临界值F(o.oi，2，7)=9.547，Ft〉F(o.(u，2，7)，显著，说明回归方程有意义。同时，说明深山草莓花瓣愈伤组织诱导变异植株与NAA不相关或相关性极小，不显著，通过优化组合进行的验证试验也证明了这一点。对x^nx3方程项进行显著性检验可知，x^nx3方程项对Y2影响均显著。各方程项对回归的贡献值和贡献率(按偏回归平方和降序排列)为U(1)=3.13，U(1)/U=73.3%;U(3)=0.789，U(3)/U=18.5%。说明TDZ对深山草莓花瓣愈伤组织诱导变异植株的贡献大于KT，起主导作用，但须配以适当浓度的KT辅助才能诱导成功。表4深山草莓愈伤组织再分化芽苗和变异植株诱导培养基的111()(103)均匀设计试验安排与结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在整个诱导和田间试验中，共发现8个遗传稳定的变异种(每个处理对变异植株性状的描述均以该组合分化出的变异植株中性状表现较好，有推广应用和可作为育种种质资源价值)，其品种特性简介如下各处理中选出的优良性状品种表现为，处理l:植株大，生长较健壮，多级花序，每支花序4-5朵花，花瓣较易落，果形长锥形，果皮较硬。有香气，偏酸。一级序平均单果重47.9g，最大果重70.0g。花芽分化和形成比其他现有品种晚，断根处理能促进花芽分化。花器大，花粉量多，在低温条件下畸形果比例较少，大果、商品果比例高；处理2:植株较大，生长健壮，多级花序，每支花序4-5朵花，花瓣易落，果形圆锥形，果皮硬。有香气，偏酸。一级序平均单果重50.5g，最大果重78.lg。花芽分化和形成比其他现有品种晚，断根处理能促进花芽分化。花器大，花粉量较多，在低温条件下畸形果比例多，大果、商品果比例较高；处理3:植株较大，生长较健壮，多级花序，每支花序5-7朵花，花瓣较易落，果形长锥形，果皮较硬。有香气，偏酸。一级序平均单果重43.2g，最大果重72.7g。花芽分化和形成比其他现有品种晚，断根处理能促进花芽分化。花器较大，花粉量多，在低温条件下畸形果比例少，大果、商品果比例高；处理4:植株较大，生长较健壮，多级花序，每支花序6-8朵花，花瓣较易落，果形长锥形，果皮较硬。有香气，偏酸。一级序平均单果重39.6g，最大果重47.4g。花芽分化和形成比其他现有品种晚，断根处理能促进花芽分化。花器较大，花粉量多，在低温条件下畸形果比例少，大果、商品果比例高；处理5:植株大，生长健壮，多级花序，每支花序4-5朵花，花瓣易落，果形圆锥近心形。酸甜适中，香味浓郁。果皮红色，富有光泽，韧性强，果皮硬度极大，含糖9.7-11.3%，可溶性固形物IO.6-14.3%，Vcl29.4mg/100g，一级序平均单果重62.4g，最大果重90g。花芽分化和形成比其他现有品种早，断根处理能促进花芽分化。花器大，花粉量多，在低温条件下畸形果比例少，大果、商品果比例极高；处理6:植株大，生长健壮，多级花序，每支花序3-5朵花，花瓣易落，果形圆锥形，果皮硬度大。有香气，酸甜适中。一级序平均单果重42.6g，最大果重63.2g。花芽分化和形成比其他现有品种较早，断根处理能促进花芽分化。花器较大，花粉量较多，在低温条件下畸形果比例多，大果、商品果比例较高；处理7:植株较大，生长健壮，多级花序，每支花序3-5朵花，花瓣易落，果形圆锥形，果皮软。稍有香气，酸甜适中。一级序平均单果重32.9g，最大果重48.5g。花芽分化和形成比其他现有品种晚，断根处理能促进花芽分化。花器较大，花粉量较多，在低温条件下畸形果比例少，大果、商品果比例较高；处理9:植株较大，生长较健壮，多级花序，每支花序7-10朵花，花瓣易落，果形圆锥形，果皮软，一级序平均单果重22.8g，最大果重31.7g。花芽分化和形成比其他现有品种晚，断根处理能促进花芽分化。花器小，花粉量较多，在低温条件下畸形果比例少，大果、商品果比例高经对各处理的变异株各性状初步对比，经过7年的区试栽培试验，在8个遗传稳定的变异种中，于第5个处理组中筛选出丰产、优质新品种草莓，其品种特性如下植物学性状该品种生长健壮，生长势强，植株高(35cm)，株径较大，分生新茎能力较强。叶片极大，较厚，椭圆形色深绿，边缘锯齿粗且较深，叶面革质平滑，有光泽。叶柄绿色，基部叶鞘略呈红色。匍匍茎粗，抽生能力中等。花序梗粗，绒毛较少，分枝处着生一大一小两不完全叶。多级花序，每支花序有4-5朵花，不需疏花疏果，花瓣易落，不污染果实，花器大，花粉量多，雌雄蕊较其母本深山草莓均大；果实性状果实圆锥形，种子黄绿色，凹入果面。果肉深红色，质密多汁，果形圆锥形。酸甜适中，香味浓郁。果皮红色，富有光泽，韧性强，果皮硬度极大，耐储运。初步测定含糖9.7-11.3%，可溶性固形物10.6-14.3%，维生素C129.40mg/100g，一级序平均单果重62.4g，最大果重90g以上，果实各项指标均优于深山草莓；休眠性该品种休眠浅，打破休眠所需的温度为5'C以下，低温积累100-120小时即可，促成栽培不用赤霉素处理；花芽形成花芽分化和形成比其他现有栽培品种早，断根处理能促进花芽分化。在低温条件下畸形果比例小，大果、商品果比例高；丰产性连续结果达6个多月。每亩可定植8000株，初步计算产量累积达3000kg以上；抗病性该品种生长健壮，综合抗病能力较强，但对白粉病、细菌性叶斑病中抗。3结论本试验结果表明，培养基LS+TDZ2.06mgL—、2，4-D0.60mgL—4寸深山草莓花瓣愈伤组织的诱导效果较好。当2，4-D质量浓度低于0.10mgL—4寸花瓣不产生愈伤组织且很快褐变死亡，超过0.60mgL—4寸花瓣愈伤组织形成疏松的愈伤组织，分化能力极低，诱导率仅在3.7-9.2%之间，过高的TDZ浓度对花瓣愈伤组织形成的速度极快，这可能是导致愈伤组织疏松的另一个因素；TDZ质量浓度低于1.40mgL—i时花瓣愈伤组织的形成很慢，愈伤程度不完全；培养基1/2LS+TDZ2.30mgL—、NAA0.10mgL—、KT1.30mgL—工适合花瓣愈伤组织的芽苗分化，超过3.20mgL—4寸愈伤组织分化率极低，均在18%以下，可能是过高的TDZ浓度对芽苗分化起抑制作用。低于2.30mgL—4寸愈伤组织不分化。通过对变异的回归分析可知，深山草莓花瓣愈伤组织诱导变异植株与NAA不相关或相关性极小，不显著。TDZ和KT对回归的贡献值和贡献率说明TDZ对深山草莓花瓣愈伤组织诱导变异植株的贡献大于KT，起主导作用，但须配以适当浓度的KT辅助才能诱导出变异植株，通过验证试验证明了这一结论。对各处理的变异株各性状栽培对比，经过区试栽培试验，在8个遗传稳定的变异种中，又进一步筛选出具有丰产、优质等优良性状的新品种草莓，该品种生长健壮，植株大，多级花序，每支花序有4-5朵花，花器大，花粉量多。果实酸甜适中，香味浓郁，果皮硬度极大。初步测定含糖9.7-11.3%，可溶性固形物10.6-14.3%，维生素C129.40mg/100g，一级序平均单果重62.4g，最大果重90g以上。丰产抗病力好，大果、商品果比例高。目前，该品种已进行放大栽培试验和多地区试验阶段。权利要求1.深山草莓花瓣诱导变异植株品种培育方法，其特征在于包括将深山草莓未开放花蕾剪下消毒、插入LS培养基中待花蕾开放后取花瓣进行诱导愈伤组织、愈伤组织再分化芽苗、生根培养、移栽。2.按照权利要求l所述的深山草莓花瓣诱导变异植株品种培育方法，其特征在于所述的诱导愈伤组织的适宜培养基为LS+TDZ2.06mg/L+2，4-D0.60mg/L。3.按照权利要求1或2所述的深山草莓花瓣诱导变异植株品种培育方法，其特征在于所述的愈伤组织再分化芽苗培养基为1/2LS+TDZ2.30mg/L+NAA0.10mg/L+KT1.30mg/L。4.按照权利要求3所述的深山草莓花瓣诱导变异植株品种培育方法，其特征在于所述的消毒是指将深山草莓未开放花蕾剪下，在超净工作台上用70%酒精涮洗30s，再用O.5%次氯酸钠溶液浸泡10min，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干表面的水分。5.按照权利要求4所述的深山草莓花瓣诱导变异植株品种培育方法，其特征在于所述的生根培养基为1/2LS+IAA0.05mg/L。全文摘要本发明涉及植物培育技术，即深山草莓花瓣诱导变异植株品种培育方法。包括将深山草莓未开放花蕾剪下消毒、插入LS培养基中待花蕾开放后取花瓣进行诱导愈伤组织、愈伤组织再分化芽苗、生根培养、移栽。诱导深山草莓花瓣产生愈伤组织的适宜培养基为LS+TDZ2.06mg·L<sup>-1</sup>+2，4-D0.60mg·L<sup>-1</sup>。愈伤组织再分化芽苗和变异植株发生培养基为1/2LS+TDZ2.30mg·L<sup>-1</sup>+NAA0.10mg·L<sup>-1</sup>+KT1.30mg·L<sup>-1</sup>。生根培养基为1/2LS+IAA0.05mg·L<sup>-1</sup>。可获得具有优良性状的变种，为深山草莓的开发利用和草莓的育种提供种质资源和奠定实践基础。文档编号A01H4/00GK101606489SQ200910304829公开日2009年12月23日申请日期2009年7月25日优先权日2009年7月25日发明者颖冯,刘秀岩,姜云天,朱俊义,李玉梅,宇梁,顾地周申请人:通化师范学院