一种低温诱导型启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明一种低温诱导型启动子及其应用属于基因工程领域，具体涉及DNA重组技术中一种调节基因表达的非编码核酸。本发明提供的启动子，该启动子的核苷酸序列为SEQIDNO:1。本发明所述的启动子能够为植物生物反应器的研发提供实验和技术支撑。利用所述的低温诱导型启动子，以植物作为生物反应器，表达疫苗、抗体及其他药用蛋白等，可突破传统农业范畴，延伸到医学领域。
【专利说明】一种低温诱导型启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及DNA重组技术中一种调节基因表达的非编码 核酸。
【背景技术】
[0002] 在植物基因工程研究中，使外源目的基因在受体中表达，以提高作物对干旱、低 温、盐碱以及病虫害等逆境胁迫的抗性，或提高作物品质及改良作物农艺性状等，已成为目 前作物育种的一种重要手段。真核生物的基因表达调控包括转录前调控、转录调控、转录后 调控、翻译调控和翻译后调控。其中，转录水平的调控受顺式作用元件和转录因子协调作 用，是表达调控的关键环节。因此，有关启动子的分离和研究成为国内外研究的热点之一。
[0003] 使用组成型启动子驱使外源基因表达，不仅造成资源浪费，还直接影响植株的生 长发育及正常的生理代谢，而使用诱导型启动子，不仅不会造成各种资源的浪费，又能增强 植物体对外界的抗性，减少对植物生长发育及其他代谢途径的影响。因此，如何控制外源基 因定时定量地高效表达，是基因工程技术在作物遗传改良方面有效应用的关键所在。除了 寻找有效的目的基因之外，发现有效控制外源基因表达的启动子成为基因工程改良中需要 解决的重要问题。启动子根据其功能和作用方式大致分为组成型启动子、组织特异性启动 子和诱导型启动子三种。组成型启动子调控的基因表达不受外界环境条件的影响，几乎在 所有植物不同组织中都能表达。典型的是花椰菜花叶病毒（cauli-flower mosaic virus, CaMV) 35S启动子，被广泛应用于双子叶植物转基因工程（Benfey等，1990, Science 250， 959-966)。其它单子叶有玉米泛素 Ubiquitin 启动子（Streatfield 等，2004, Transgenic Res 13,299-312)和水稻肌动蛋白（Actin)启动子。该类启动子活性较高，但由于其导 致外源基因在转基因植物整个生长时期的不同部位表达，影响植物的生长发育和正常生 理代谢，有些产物可能造成毒害作用，不利于品质和产量的提高，甚至会导致植物的死亡。 Kasuga等利用诱导型rd29A启动子代替CaMV35S启动子转化拟南芥，提高了转基因拟 南芥的抗旱性，同时减少了组成型过表达造成的植株生长停滞或矮化现象的发生（Kasuga， 2004, Plant and Cell Physiology 45，346-350)。因此，为了更好地调控植物基因的表 达，组织特异型启动子和诱导型启动子的研究和应用越来越受到人们重视。
[0004] 组织特异型启动子是调控目的基因只在特定器官或组织中表达。该类启动子一般 存在一些与组织特异性相关的特异基序。Nitz等从拟南芥中分离得到编码在根和下胚轴 中特异表达的黑芥子酶基因 PyklO启动子序列，该启动子能调控目的基因在转基因拟南 芥根部高水平特异表达（Nitz等，2001，Plant Science, 161,337-346)。Bate等通过缺失 突变分析马铃薯花特异表达基因 LAT25的启动子发现，调控花粉特异表达元件位于该基 因启动子-492到-52区段（Bate等，1998, 37,859-869)。玉米叶片特异性PPCA1启动子 (Gowik 等，2004, Plant Cell 16,1077-1090)、草莓果实特异性 GalUR 启动子（Agius 等， 2005，J Exp Bot 56,37-46)等。对该类启动子的深入研究有助于阐明植物生长发育和 生理代谢的基础理论，而且具有广泛的应用价值。诱导型启动子是指正常状态下不表达或 低表达，受到某些物理或化学信号的刺激，可以大幅度地提高基因的表达水平一类启动子。 根据诱导因素，诱导型启动子可分为光诱导型启动子、温度诱导型启动子、损伤诱导型启动 子、激素诱导型启动子和真菌诱导型启动子等。其特点是：受到物理或化学因素的诱导；含 有多种功能元件，协同增强或降低启动子的活性；部分诱导型启动子同时具有组织特异性 启动子的特点。其他诱导型启动子如水稻质膜CaATPase启动子受干旱、寒冷、茉莉酸甲酯 以及脱落酸的诱导（Huda等，2013，PLoS One 8)。拟南芥RBCS-1A启动子是光诱导型启 动子，同时具有组织特异性（习雨琳等，2012，作物学报38，1561-1569);对于诱导型启 动子，目的基因只有在接受诱导信号后才会表达，不仅不会造成各种资源的浪费，又能增强 植物体对外界的抗性，减少对植物生长发育及其他代谢途径的影响。因此，研究和利用诱导 型启动子，对于研究植物响应各种胁迫的生理机理以及研究农作物的抗逆基因工程都有重 要的意义，在基础研究和植物生物技术方面也有着广阔的应用前景。然而到目前为止，能应 用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的抗逆相关启动子的克隆、顺式 作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研 究仍然是今后启动子研究的重点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种能在低温诱导时启动目的基因表达的启动子及其应用。 本发明一方面提供了一种启动子，该启动子的核苷酸序列为SEQ ID N0:1。
[0006] 本发明还提供了含有上述启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌。
[0007] 所述的重组载体是在载体的多克隆位点处插入所述的启动子后得到的重组质粒。
[0008] 所述表达盒由所述的启动子，该启动子表达的目的基因，以及转录终止序列组成； 所述的启动子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连 接。
[0009] 本发明有一个方面是提供了所述的启动子在启动目的基因于植物表达中的应用。 优选是在温度诱导时，特别优选是在低温诱导时。
[0010] 所述的低温诱导，是指一些植物基因在低温环境条件(一般指大于〇°C，低于 15°C)下，启动表达的方式。
[0011] 本发明还有一个方面是提供了一种利用所述的启动子培育转基因植物的方法，包 括如下步骤： 1) 构建目的基因重组表达载体：将目的基因插入到含有所述启动子的重组载体中，低 温诱导使所述的启动子启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体； 2) 将步骤1)构建的目的基因重组表达载体导入目的植物中，低温诱导使所述的启动子 启动所述目的基因表达，得到表达所述目的基因的转基因植物。
[0012] 本发明还有一个方面是提供了一种使植物在低温诱导时表达目的基因的方法，其 是将目的基因插入到含有所述启动子的重组载体中，并将该重组载体导入目的植物中，然 后低温诱导目的基因在植物中进行表达。
[0013] 本发明所述的启动子能够为植物生物反应器的研发提供实验和技术支撑。利用所 述的低温诱导型启动子，以植物作为生物反应器，表达疫苗、抗体及其他药用蛋白等，可突 破传统农业范畴，延伸到医学领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1 :本发明启动子/7仰2构建PCR电泳图。
[0015] 图2 :本发明的启动子/7Ω77Τ载体质粒酶切鉴定电泳图。
[0016] 图3 :本发明的启动子/7仰7连接pC0390⑶S酶切鉴定电泳图。
[0017] 图4 :低温诱导条件下，启动子/7仰7转化烟草叶片的⑶S基因组织化学染色。
[0018] 图5 :低温诱导条件下，启动子/7仰7与对照的⑶S活性比较。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图对本发明的方法进行详细的描述，但是以下描述的目的是示例性 的，而不是限制本发明的范围。
[0020] 实施例1 :本发明所述低温诱导型启动子/7仰7的分离 1. 1甜荞基因组DNA的制备 将带培养基质的甜荞苗在光照条件为8000LUX，温度为25°C条件下生长3周。然后转 入光照条件为8000LUX，接着采用北京艾德莱生物科技有限公司的新型植物基因组DNA快 速提取试剂盒（目录号DN15)提取DNA。
[0021] 1. 2启动子/7^97的克隆和序列分析 以上面提取的DNA为模板，用PCR方法扩增FeDREBl基因上游启动子序列。其扩增引 物如下，其上游引物中引入Hind III酶切位点，下游引物中引入Bamh I酶切位点： 上游引物：5'_ CCCAAGCTTATAGACCTAGTCAGGATCA -3' 下游引物：5'_ GCGGATCCGATCGATCCTGAATATAT -3' PCR反应体系
【权利要求】
1. 一种启动子，其特征在于该启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。
2. 含有如权利要求1所述启动子的重组载体、表达盒、转基因细胞或重组菌。
3. 如权利要求1所述的启动子在启动目的基因于植物表达中的应用。
4. 如权利要求3所述的启动子在温度诱导时启动目的基因于植物表达中的应用。
5. 如权利要求4所述的启动子在低温诱导时启动目的基因于植物表达中的应用。
6. 利用权利要求1所述的启动子培育转基因植物的方法，包括如下步骤： 构建目的基因重组表达载体：将目的基因插入到含有所述启动子的重组载体中，低温 诱导使所述的启动子启动所述目的基因表达，得到目的基因重组表达载体； 将步骤1)构建的目的基因重组表达载体导入目的植物中，低温诱导使所述的启动子启 动所述目的基因表达，得到表达所述目的基因的转基因植物。
7. -种使植物在低温诱导时表达目的基因的方法，其特征在于该方法是将目的基因插 入到含有如权利要求1所述启动子的重组载体中，并将该重组载体导入目的植物中，然后 低温诱导目的基因在植物中进行表达。
【文档编号】A01H5/00GK104195138SQ201410442189
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月2日 优先权日:2014年9月2日
【发明者】方正武, 刘志雄, 王彩丽, 李晓方 申请人:长江大学