鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及测序方法和专用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种鸡mtDNA Cytb基因全序列扩增及 其测序方法。
【背景技术】
[0002] 动物遗传资源多样性能够为品种改良提供素材，并且能够很好适应环境的变化。 我国有丰富家禽地方品种资源，研宄和评估我国家禽地方品种的遗传多样性，制定合理的 利用和保护措施对我国畜牧业的可持续发展具有重要意义。研宄动物遗传多样性的方法主 要有微卫星和线粒体DNA等，两种方法各有优缺点，线粒体DNA更容易操作。畜（禽）品种 大都受到外来公畜（禽）杂交改良的影响，群体数量减少甚至消失，给研宄品种起源和多样 性带来很大困难。线粒体DNA在遗传过程中，遗传物质通过卵细胞质传递，较少发生DNA重 组，其野生祖先的线粒体DNA类型一般能得以保持。这种遗传方式，一个个体就能代表一个 母性集团，因此只需少量个体样本便能反映一个群体的遗传结构。研宄者可以从复杂的遗 传背景中分辨不连续的母系血统，即使经过几千年的杂交繁育，系统关系依然明晰。
[0003] 鸡线粒体基因组一般在16785bp左右，为闭合环状双链结构，能够自主复制和转 录。包括37个基因的编码编码区（13个蛋白质编码基因、2个核糖体RNA基因、22个转运 RNA基因）和1个控制区。细胞色素 b (Cyt b)基因是mt DNA 13个蛋白质编码基因中结构 和功能了解的最为清楚的一个，也是编码蛋白质唯一位于线粒体基区的。细胞色素 MCyt b)基因进化速率适中，从科间到种间，乃至种内具有丰富的多态性，是研宄种间和种内遗传 分化程度及系统进化的理想的分子标记。Cyt b基因部分或者全部序列已经广泛地应用于 动物类群的遗传多样和系统进化研宄中，全序列包含的遗传信息更为丰富。由于Cyt b基 因下游为tRNA-Thr基因（69bp)、tRNA-Pro基因（70bp)，折叠成三叶草形的短链，较正常的 核苷酸结构测序困难，一般反向测序都难以成功。目前还没有运用Cyt b基因全序列对我 国家禽地方品种进行系统的研宄，因此建立Cyt b基因全序列扩增和测序方法是十分必要 的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提出一种鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及测序方法和专用 引物，本发明速度快、成本低、易于掌握，能够有效检测出鸡的mtDNA Cytb基因全序列。
[0005] 本发明提供了一种鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及测序用引物，包括PCR引物 和测序引物，所述PCR引物的上游引物为：5' -TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3'，PCR引物的下游引 *S:5'-ITTAGTGGAGTTGCGGTGT-3' ；
[0006] 所述测序引物为 Walking primer :5' -CGCCTTTGTGGGCTATGTT-3'。
[0007] 本发明还提供了一种鸡mtDNA Cytb基因全序列扩增及其测序方法，包括以下步 骤：
[0008] (1)提取鸡羽毛中的DNA，并检测质量；
[0009] (2)根据红色原鸡mtDNA Cytb基因在mtDNA全基因组序列上的相对位置，在mtDNA Cytb基因上下游保守区域设计一对PCR引物，引物序列为：
[0010] Forward prime(SEQ ID NO. 1):5'-TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3'
[0011] Reverse primer(SEQ ID NO. 2):5'-TTTAGTGGAGTTGCGGTGT-3'
[0012] (3) PCR产物测序与序列拼接
[0013] 通过PCR反应，获得目的片段，纯化后送测序公司测序，由于mtDNA Cytb基因下游 结构复杂，反向引物无法测出，根据正向引物已测出的mtDNA Cytb基因序列设计一条测序 引物，进行引物步移（Primer walking)测序，让后将正向引物和步移引物测得两条序列进 行拼接，获得mtDNA Cytb基因全序列。
[0014] Walking primer(SEQ ID NO. 3)5,-CGCCTTTGTGGGCTATGTT-3'
[0015] 步骤1中鸡羽毛中DNA的提取步骤为：羽毛样采集雏鸡或者成鸡换羽后刚长出的 羽毛，一般为2-3根，用剪刀剪掉羽根上部的绒羽，在干净的PE手套上剪碎后，放入2mL离 心管中，每个样品加入裂解液1000 yL及蛋白酶K 40 yL摇匀，放摇床内59°C水浴消化。消 化充分后，加700-800uL饱和酚，摇匀IOmin后以转速IOOOOrpm离心5min。吸取上清液放 入2mL离心管中，加 IOOOuL饱和酚，摇匀5min后以转速IOOOOrpm离心5min。吸取上清液 放入2mL离心管中，加氯仿1000uL，摇勾5min后以转速IOOOOrpm离心5min。吸取上清液放 入2mL离心管中，加无水乙醇沉淀出DNA团块，留下DNA倒掉乙醇，再把DNA团块用70%的 酒精洗一遍，以转速IOOOOrpm离心10min。倒掉乙醇，留下DNA，凉干（Ih)，加灭菌水IOOuL 溶解，放_20°C冰箱保存。
[0016] 步骤 3 中 PCR 反应体系为：PCR Mix 25 μ L，10 μ mol/L 引物各 1.5 μ L，模板 2 μ L， 灭菌水20 μ L。
[0017] 步骤 3 中 PCR 反应程序为：95°C 5min，（95°C 30s，56°C 30s，72°C 60s)30 循环， 72°C 4min〇
[0018] 步骤3中所述mtDNA Cytb拼接方法为：测序获得序列用DNAStar 5. 02软件的 SeqMan程序拼接，将拼接序列与GenBank中红色原鸡参考序列NC_007235进行比对，剪掉引 物及多余的序列。
[0019] 上述的方法，所述PCR扩增特异性条带为1490bp，包含mtDNA Cytb基因全序列及 上下游部分序列，其核苷酸序列为：（小写字母表示Cytb基因全长序列，大写字母表示上游 和下游序列，黑色下划线表示上下游引物位置，阴影部分表示步移引物位置）：
[0020] TCTTACCTGG GTTCTTTCGC CCTCACAATC CTTACAACGA TCCTACTTAT CCAAAAATAA 60
[0021] ACTAatggca cccaacattc gaaaatccca ccccctacta aaaataatta acaactccct 120
[0022] aatcgacctc ccagccccat ccaacatctc tgcttgatga aatttcggct ccctattagc 180
[0023] agtctgcctc atgacccaaa tcctcaccgg cctactacta gccatgcact acacagcaga 240
[0024] cacatcccta gccttctcct ccgtagccca cacttgccgg aacgtacaat acggctgact 300
[0025] catccggaat ctccacgcaa acggcgcctc attcttcttc atctgtatct tccttcacat 360
[0026] cggacgaggc ctatactacg gctcctacct ctacaaagaa acctgaaaca caggagtaat 420
[0027] cctcctcctc acactcatag ccac ：cgccn tgigggcuu gtu ctcccat ggggccaaat 480
[0028] atcattctga ggggccaccg ttatcacaaa cctattctca gcaattccct acattggaca 540
[0029] caccctagta gagtgagcct gaggaggatt ctcagtcgac aacccaaccc ttacccgatt 600
[0030] cttcgcctta cacttcctcc tcccctttgc aatcgcaggt attactatca tccacctcac 660
[0031] cttcctacac gaatcaggct caaacaaccc cctaggcatc tcatccgact ctgacaaaat 720
[0032] tccatttcac ccatactact ccttcaaaga cattctgggc ttaactctca tactcacccc 780
[0033] attcctaaca ctagccctat tctcccccaa cctcctagga gacccagaaa acttcacccc 840
[0034] agcaaaccca ctagtaaccc ccccacatat caaaccagaa tgatattttc tattcgccta 900
[0035] tgccatccta cgctccatcc ccaacaaact tggaggtgta ctagccctag cagcctcagt 960
[0036] cctcatcctc ttcctaatcc ccttcctcca caaatctaaa caacgaacaa taaccttccg 1020
[0037] accactctcc caaaccctat tctgacttct agtagccaac cttcttatcc taacctgaat 1080
[0038] cggaagccaa ccagtagaac accccttcat catcattggc caaatagcat ccctctctta 1140
[0039] cttcaccatc ctacttatcc tcttccccac aatcggaaca ctagaaaaca aaatactcaa 1200
[0040] ctactaaAAT ACTCTAATAG TTTATGAAAA ACATTGGTCT TGTAAACCAA AAACTGAAGA 1260
[0041] CTCCACCCTT CTTAGAGTAT CAGAAAAGGA GGACTCAAAC CTCCATCTCC AGCTCCCAAA 1320
[0042] GCTGGTATTT TCAAATAAAC TACTCTCTGA AACCCTTAAA CCGCCCGAAT TGCCCCCCGA 1380
[0043] GACAACCCAC GCACAAGCTC TAGTACAACA AACAAAGCTA ACAACAAACC TCACCCAGCC 1440
[0044] ACCAAAAACA ACCCAACCCC ACATGAATAA AACACCGCAA CTCCACTAAA 1490
[0045] 。
[0046] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0047] 1、本发明的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点，能够有效检测出鸡的 mtDNA Cytb基因全序列，从而为鸡分子遗传学及分子系统进化学研宄提供有效的研宄平 台。与吴蝉等（黑龙江畜牧兽医，2013年，第2期，第51?53页）需要2对引物才能扩 增全长相比，更加简便容易操作；
[0048] 2、本发明提供了一种节约成本、简便易行的扩增鸡mtDNA Cytb基因全序列的方 法，本发明提供的鸡mtDNA Cytb基因全序列可应用于鸡遗传资源多样性评估、母系起源、系 统进化分析和种质资源鉴定与保护等多个领域；
[0049] 3、本发明采用羽毛采集，替代传统的血液采样，减小了对实验动物的伤害，并且能 获得高质量的DNA模板。
【具体实施方式】
[0050] 一种鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及测序用引物，包括PCR引物和测序引物。
[0051] PCR 引物的上游引物为：5' -TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3'，
[0052] PCR 引物的下游引物为：5' -TTTAGTGGAGTTGCGGTGT-3'。
[0053] 测序引物为 Walking primer :5' -CGCCTTTGTGGGCTATGTT-3'。
[0054] -种鸡mtDNA Cytb基因全序列扩增及测序方法，包括以下步骤：
[0055] (1)提取鸡羽毛中的DNA，并检测质量；
[0056] (2)在鸡mtDNA Cyt b基因上下游保守区域设计一对PCR引物，通过PCR 反应扩增包含Cytb基因的片段，经琼脂糖凝胶电泳；所述PCR引物的上游引物为： 5' -TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3'，PCR 引物的下游引物为：5' -TTTAGTGGAGTTGCGGTGT-3'，
[0057] (3)设计测序引物对PCR扩增产物进行测序，所述测序引物为Walking primer : 5'-CGCCTTTGTGGGCTATGTT-3' ；
[0058] (4)对测序获得序列进行拼接，并减掉上下游多余的序列，获得鸡mtDNA Cyt b基 因全序列，鸡mtDNA Cyt b基因全长为1143bp。
[0059] 所述用于扩增鸡mtDNA Cyt b基因全序列的PC