专利名称：定性检测人类braf v600e基因突变的测序引物对及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中区分人类BRAF V600E基因突变的测序引物对及其试剂盒。
背景技术：
BRAF基因全名为人源鼠肉瘤病毒(v-raf)致癌同源体Bl(v_raf mourine sarcomaviral oncogene homo log BI, B_raf),其编码的B型有丝分裂原激活的蛋白激酶依赖性激酶的激酶(RAF)是RAS/RAF/MEK/MARK信号通路的关键成分，该信号通路调节细胞的生长、增值和凋亡，当其发生改变时则可能导致肿瘤的形成。BRAF错义突变发生于近8%人类肿瘤中，主要发生在结直肠癌、黑色素瘤和甲状腺乳头状癌中。多种消化道肿瘤中均存在不同频率的BRAF基因突变。因此，该突变可作为一个诊断和预后的分子生物学标记及开发治疗相关癌症的基因祀点。BRAF基因包括3个保守区域，称为CR1、CR2和CR3。CR3为激酶区域。大多数的BRAF突变主要发生外显子15上的激活区，其中约92%位于第1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E(1799T>A))。而V600E突变正好位于BRAF基因的活性区域(CR3)上。目前认为，这一突变带来的负电荷模拟了苏氨酸598和丝氨酸601的磷酸酰基化过程，从而异常激活了 BRAF基因。BRAF V600E突变对下游激酶的激活能力是野生型的12. 5倍。在同一肿瘤中，BRAF突变和Kras突变几乎不同时出现。BRAF蛋白可能独立于RAS蛋白而发挥作用。因此，2010年版《NCCN结直肠癌临床实践指南》建议在使用西妥昔单抗前，对野生型KRAS患者进行BRAF基因(V600E)突变检测，能筛除约50%的非适用人群，以提高用药的针对性。目前医院用于BRAF V600E基因分型检测的“金标准”是PCR-直接测序法，但直接测序法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20%以上的肿瘤组织，对于含〈10%突变细胞的肿瘤组织以及外周血，常规PCR+直接测序法几乎无能为力。相比于直接测序法，焦磷酸测序的灵敏性更高、成本更低。焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(确定DNA中核苷酸的顺序)方法，是新一代DNA序列分析技术。它是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。通过分析出峰情况，达到测定DNA序列的目的目前市场上还没有利用焦磷酸技术进行BRAF V600E的基因多态性检测的产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性高、准确性好、能够定性检测人类BRAF V600E基因突变的测序引物对及其试剂盒。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为一种定性检测人类BRAF V600E基因突变的测序引物对，所述引物对为如下引物正向扩增引物5'-CTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3' (SEQ ID NO. I)反向扩增引物5'-GCATCTCAGGGCCAAAAATT-3' (SEQ ID NO. 2)；测序引物5'-CCACTCCATCGAGATT-3' (SEQ ID NO. 3)；其中，正向扩增引物的5'端进行了生物素标记。一种定性检测人类BRAF V600E基因突变的测序试剂盒，所述试剂盒中包括含有SEQ ID NO. I所示引物的PCR反应液，SEQ ID NO. 2所示的反向扩增引物，SEQ ID NO. 3所示的测序引物；其中，SEQ ID NO. I所示引物的5’端进行生物素标记。进一步地，所述试剂盒还包括BRAF阳性对照品；所述BRAF阳性对照品包含BRAF阳性对照品I和BRAF阳性对照品2 ;所述BRAF阳性对照品I为插有SEQ ID NO. 5所示核苷酸序列的野生纯合子质粒；所述对照品2为所述野生纯合子质粒与插有SEQ ID NO. 6所示核苷酸序列的突变纯合子质粒组成的质粒混合物；其中，质粒载体为PMD18-T质粒；所述质粒混合物中，野生纯合子质粒与突变纯合子质粒的数量比为1:1。进一步地，所述试剂盒中还包括质控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 4) (controloligo)和作为空白对照品的DNase-RNase-free水；质控序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核苷酸链，用于检测PyroMark Q24测序仪的各项性能指标。所述的PCR反应液I中其他组分为常规的IOx PCR Buffer、dNTP和H2O,各组分按常规体积比配置(10x PCR Buffer、dNTP、H2O和反应液中引物的体积比为5:3:37. 5:1)。试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，如尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。本发明的优点及有益效果I)本发明提供的定性检测人类BRAF V600E基因突变的焦磷酸测序试剂盒，定性准确，具有灵敏性高、特异性强的优点，样品处理简单，测序速度快，高通量，半个小时完成一次上机反应，直接给出检测位点频率分析，结果直观。2)本发明提供的定性检测人类BRAF V600E基因突变的焦磷酸测序试剂盒灵敏度和特异性高。由于采取特异性扩增引物和测序引物的双保险设计，通过对核昔酸加入顺序的选择，实现等位基因闻分辨检测，灵敏度和特异性均有很大提闻;3)本发明提供的定性检测人类BRAF V600E基因突变的焦磷酸测序试剂盒检测速度快；4)本发明提供的定性检测人类BRAF V600E基因突变的焦磷酸测序试剂盒步骤简单；5)本发明提供的定性检测人类BRAF V600E基因突变的焦磷酸测序试剂盒可同时进行高通量的样本检测。6)本发明的试剂盒中设置了空白对照和阳性对照，能更好的确保检测结果的准确性。
由于设计了灵敏度高，特异性好的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒能够对BRAF V600E基因分型进行快速检测。本发明的试剂盒可实时监测反应进程，反应时间短，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，高通量，比金标准——毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于突变分析。
图I为临床BRAF野生型的焦磷酸测序结果图；图2为临床质控品control oligo的焦磷酸测序结果图；图3为临床空白对照的焦磷酸测序结果图；图4为多组设计引物的凝胶电泳图；图中①、②表明非特异性条带，③表明特异性和片段大小均比较合适，④表明目的带片段大小不对。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例I :试剂盒的制备I.引物的设计与合成使用QIAGEN PyroMark Assay Design 软件，针对 BRAF 基因的 15 号外显子 1799位点(T>A)设计上下游扩增引物和测序引物。试剂盒中最主要的影响试剂盒的准确性的就是引物，包括扩增引物和测序引物，在设计的初期，我们设计了多组引物进行比较(见图5)；引物均委托专业公司合成，为HPLC纯化，其中SEQ ID NO. I所示正向扩增引物的5’端为生物素标记。表I突变位点与类型
权利要求
1.一种定性检测人类BRAF V600E基因突变的测序引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ ID NO. I所示的正向扩增引物，SEQ ID NO. 2所示的反向扩增引物，SEQ ID NO. 3所示的测序引物；其中，SEQ ID NO. I所示引物的5’端进行生物素标记。
2.一种定性检测人类BRAF V600E基因突变的测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有SEQ ID NO. I所示引物的PCR反应液，SEQ ID NO. 2所示的反向扩增引物，SEQ IDNO. 3所示的测序引物；其中，SEQ ID NO. I所示引物的5’端进行生物素标记。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括BRAF阳性对照品I和BRAF阳性对照品2 ;所述BRAF阳性对照品I为插有SEQ ID NO. 5所示核苷酸序列的野生纯合子质粒；所述对照品2为所述野生纯合子质粒与插有SEQ ID NO. 6所示核苷酸序列的突变纯合子质粒组成的质粒混合物；其中，质粒载体为PMD18-T质粒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒混合物中野生纯合子质粒与突变纯合子质粒的数量比为1:1。
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括如SEQID NO. 4所示的质控品和空白对照品。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述空白对照为DNase-RNase-free水。
全文摘要
本发明提供一种定性检测人类BRAF V600E基因突变的测序引物对及其试剂盒，属于体外核酸检测领域，所述试剂盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR反应液、PCR扩增引物、焦磷酸测序引物、以及阳性对照品；本发明提供的试剂盒灵敏度高，特异性好，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，比金标准——毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于突变分析。
文档编号C12N15/11GK102925555SQ201210347950
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者周姗 申请人:长沙三济生物科技有限公司