专利名称：Npc1基因突变的检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于基因技术领域；更具体地，本发明涉及NPCl基因突变的检测方法和试剂盒。
背景技术：
胆固醇是哺乳动物细胞内的一种至关重要的脂质。它具有调节胞膜活动的独特理化性质，并且是留类激素、羟固醇和维生素D的前体。胆固醇的失调会引发多种病变。在正常细胞中，低密度脂蛋白经受体介导内吞到达早期内体。随着胞内体的pH值下降，逐渐获得各种酸性水解酶，形成晚期内体。在晚期内体中，低密度脂蛋白颗粒解体， 胆固醇酯在酸性水解酶的作用下水解，释放出游离的胆固醇。这些胆固醇大部分被运送到质膜，还有一部分到达内质网和其它位点。C型I类尼曼-匹克蛋白(NPCl)是ー个跨膜脂质泵，它能监测细胞内胆固醇水平的变化，通过改变小泡转运方式或直接參与脂质跨膜转运来调节细胞脂质的平衡。它能促进脂质(特别是胆固醇)从晚期内体/溶酶体转运到高尔基复合体、内质网和细胞膜(Vance, J. E.，Lipid imbalance in the neurologicaldisorder, Niemann-Pick C disease. FEBS Lett, 2006. 580(23):p. 5518-24)。NPCl 蛋白几乎在姆一种组织中都有表达(Dieschy, J. M. and S. D. Turley, Control of cholesterolturnover in the mouse. J Biol Chem, 2002. 277(6):p. 3801-4)。NPCl蛋白是细胞晚期内体中含有的一种跨膜糖蛋白，由1278个氨基酸组成，分子量为142kDa，包含13个跨膜区域。其中在第3个和第7个跨膜区域之间含有固醇感受域(SSD)，类似于内质网中的固醇感受蛋白，它能识别蛋白质环境中的游离固醇并參与介导溶酶体中胆固醇的流出。NPCl还包含8个保守的半胱氨酸和I个亮氨酸拉链结构，后者介导蛋白质ニ聚化，而前者类似于ー个环指模体，參与蛋白质-蛋白质或蛋白质-脂质之间的相互作用。已有研究证实，NPCl基因的突变与C型尼曼-匹克病(NPC)的发生密切相关。NPC是ー种罕见的常染色体隐性遗传的神经脂质沉积症。发病率大约为1:150，000。患病个体通常在成年之前去世，并且至今尚无有效的治疗方法。临床表现为肝脾肿大以及神经退行性疾病，包括眼肌麻痹、运动失调、肌张力障碍和痴呆等。生物学上表现为因细胞内胆固醇转运障碍而导致的未酯化胆固醇在溶酶体和高尔基体内的堆积。目前，NPC被认为是由C型I类尼曼-匹克基因(NPCl)或C型2类尼曼-匹克基因(NPC2)的突变所导致的，其中95%的患者是由NPCl基因突变所致，目前已经被发现的突变达到200多个(Chang, T. Y. , et al. , Niemann-Pick type C disease and intracellular cholesteroltrafficking. J Biol Chem, 2005. 280(22):p. 20917-20 ；Tamura, H. , et al. , Niemann-Picktype C disease:novel NPCl mutations and characterization of the concomitantacid sphingomyelinase deficiency. Mol Genet Metab, 2006. 87(2):p. 113-21)。另外有报道指出，NPC I基因的突变可能与肥胖的发生有关。有研究组对1380个欧洲的肥胖病人和1416个年龄匹配的正常体重的对照人群进行全基因组关联分析(GffAS)，并且在另外的14186个包含肥胖病人和正常対照的人群中对分析结果进行验证，发现ー个位于NPCl基因上的单核苷酸多态性位点(SNP)与肥胖表型呈现显著的相关性(rsl805081,P=2. 9X10_7)。但这个 SNP 位点 rsl805081 (H215R)对 NPCl 蛋白的功能有何影ロ向尚イ、渭楚(Meyre, D.，et al. , Genome-wiae association study for early-onset andmorbid adult obesity identifies three new risk loci in European populations. NatGenet, 2009. 41(2) :p. 157-9)。以小鼠作为模型进行研究时，科学家发现与作为对照的正常(NpCl+/+)小鼠相比，NPCl纯合突变(Npcl+)的小鼠除了具有神经功能缺损和细胞胆固醇转运缺陷等症状之外，还表现为迟发性的减重和食欲减退(Xie，C.，et al., Cholestero Ibalance and metabolism in mice with loss oi function of Niemann-PicK しprotein. Am J Physiol, 1999. 276(2Pt I):ρ·E336-44)。而杂合突变(Npcl+勺的小鼠在高脂饮食的诱导下表现出明显的体重增加(Jelinek, D.，et al.，DecreasedNpcl gene dosage in mice is associated with weight gam.Obesity(bilverSpring), 2010. 18(7) :p. 1457-9)。因此，NPCl基因的突变可视为危险因素，对其突变的检测对于生物学研究和临床 诊断都具有重要的意义。目前，对于基因变异的检测较为常用的技术是聚合酶链式反应(PCR)。然而，NPCl基因的扩增模板通常为待检测个体的血液基因组DNA，复杂度较高，难以得到理想的目的基因片段用于后续的测序。因此，对于NPCl基因突变的检测还有待于进ー步优化。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种NPCl基因突变的检测方法和试剂盒。在本发明的第一方面，提供ー种检测样品中是否存在NPCl基因变异的试剂，所述的试剂是引物对，选自下组SEQIDNO: I 和 SEQ ID NO: 2 ；SEQIDNO:3 和 SEQ ID NO:4 ；SEQIDNO:5 和 SEQ ID NO:6 ；SEQIDNO:7 和 SEQ ID NO:8 ；SEQIDNO:9 和 SEQ ID NO: 10 ；SEQIDNO: 11 和 SEQ ID NO: 12 ；SEQIDNO: 13 和 SEQ ID NO: 14 ；SEQIDNO: 15 和 SEQ ID NO: 16 ；SEQIDNO:17 和 SEQ ID NO:18 ；SEQIDNO: 19 和 SEQ ID NO:20 ；SEQIDNO:21 和 SEQ ID NO:22 ；SEQIDNO:23 和 SEQ ID NO:24 ；SEQIDNO:25 和 SEQ ID NO:26 ；SEQIDNO:27 和 SEQ ID NO:28 ；SEQIDNO:29 和 SEQ ID NO:30 ；SEQIDNO:31 和 SEQ ID NO:32 ；
SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:34 ；SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:36 ；SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38 ；SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40 ；SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42 ；SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44 ;和/或SEQ ID NO:45 和 SEQ ID NO:46。在另ー优选例中，引物对SEQ ID NO: I和SEQ ID NO:2用于扩增NPCl外显子I序列； SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO:4用于扩增NPCl外显子2序列；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6用于扩增NPCl外显子3序列；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8用于扩增NPCl外显子4序列；SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 用于扩增 NPCl 外显子 5 序列；SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 用于扩增 NPCl 外显子 6 序列；SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 用于扩增 NPCl 外显子 7 序列；SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 用于扩增 NPCl 外显子 8 序列；SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18 用于扩增 NPCl 外显子 9 序列；SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO:20 用于扩增 NPCl 外显子 10 序列；SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22 用于扩增 NPCl 外显子 11 序列；SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 24 用于扩增 NPCl 外显子 12 序列；SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26 用于扩增 NPCl 外显子 13 序列；SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:28 用于扩增 NPCl 外显子 14 序列；SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO:30 用于扩增 NPCl 外显子 15 和 16 序列；SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:32 用于扩增 NPCl 外显子 17 序列；SEQ ID NO: 33 和 SEQ ID NO: 34 用于扩增 NPCl 外显子 18 和 19 序列；SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:36 用于扩增 NPCl 外显子 20 序列；SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38 用于扩增 NPCl 外显子 21 序列；SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40 用于扩增 NPCl 外显子 22 序列；SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42 用于扩增 NPCl 外显子 23 序列；SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44用于扩增NPCl外显子24序列；和/或SEQ ID NO:45 和 SEQ ID NO:46 用于扩增 NPCl 外显子 25 序列。在本发明的另一方面，提供ー种检测样品中是否存在NPCl基因变异的试剂盒，所述的试剂盒中含有所述的ー种或多种弓I物对；较佳的，所述的试剂盒中含有SEQ IDNO: 1-46的引物。在另ー优选例中，所述的试剂盒中还含有PCR扩增试剂；核酸提取试剂；核酸序列分析软件；和/或使用说明书。
在本发明的另一方面，提供一种获得NPCl基因扩增产物的方法，所述的方法包括以核酸样品为模板，利用所述的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物。在另ー优选例中，在进行PCR扩增时，PCR热循环步骤如下(a) 94 ± I °C 进打 30 ± 5 秒；(b) 59±4°C 退火 45±5 秒；(C) 72 ± I °C 进行 45 ± 5 秒；重复步骤(a)- (c) 25±5 次。在另ー优选例中，在进行PCR扩增时， 若以SEQ ID NO: I和SEQ ID NO:2为引物，退火温度是60± 1°C ；若以SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4为引物，退火温度是60± 1°C ；若以SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6为引物，退火温度是60± 1°C ；若以SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8为引物，退火温度是60± 1°C ；若以SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10为引物，退火温度是60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 为引物，退火温度是 60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 为引物，退火温度是 60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 为引物，退火温度是 60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18 为引物，退火温度是 60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO: 20 为引物，退火温度是 60± I°C ；若以SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22 为引物，退火温度是 60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 24 为引物，退火温度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 26 为引物，退火温度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO: 27 和 SEQ ID NO: 28 为引物，退火温度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO: 29 和 SEQ ID NO: 30 为引物，退火温度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:32 为引物，退火温度是 60± 1°C ；若以SEQ ID NO: 33 和 SEQ ID NO: 34 为引物，退火温度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO: 35 和 SEQ ID NO: 36 为引物，退火温度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO: 37 和 SEQ ID NO: 38 为引物，退火温度是 60± I°C ;若以SEQ ID NO: 39 和 SEQ ID NO: 40 为引物，退火温度是 60± I°C ;若以SEQ ID N0:41 和 SEQ ID NO:42 为引物，退火温度是 60± 1°C ；若以SEQ ID N0:43和SEQ ID NO:44为引物，退火温度是60± 1°C ;或若以SEQ ID NO: 45 和 SEQ ID NO: 46 为引物，退火温度是 60± I°C。在另ー优选例中，在进行PCR热循环前，还包括模板变性步骤95±1°C进行3±2分钟；或在进行PCR热循环后，还包括延伸步骤72±1°C进行10±2分钟。在另ー优选例中，在PCR扩增体系中，还加入ニ甲基亚砜，其在PCR扩增体系中的终浓度按照体积为3-10%。在本发明的另一方面，提供ー种确定待测核酸样品中是否存在NPCl基因变异的方法，所述的方法包括
(I)采用所述的方法从待测核酸样品中扩增NPCl基因片段；(2)分析(I)扩增产物中NPCl基因片段的序列，并与野生型NPCl基因中对应的序列进行比较；如果存在不同，则表明待测核酸样品中存在NPCl基因变异。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图I和2显示了采用本发明优化的引物进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳结果。其中，泳道1-23依次表示DNA Marker,以及利用表I中NPCl-I (F和R) ,NPCI-2 (F和R)、NPCI-3 (F 和 R) ,NPCI-4 (F 和 R) ,NPCI-5 (F 和 R) ,NPCI-6 (F 和 R) ,NPCI-7 (F 和 R) ,NPCI-8 (F和 R)、NPCI-9 (F 和 R)、NPC1-10 (F 和 R)、NPCl-Il (F 和 R)、NPCト 12 (F 和 R)、NPCト 13 (F 和R)、NPCト 14 (F 和 R)、NPCト 15/16 (F 和 R)、NPCト 17 (F 和 R)、NPC ト 18/19 (F 和 R) ,NPCI-20 (F和 R)、NPCト21 (F 和 R)、NPCト22 (F 和 R)、NPCト23 (F 和 R) ,NPCI-24 (F 和 R)、NPCト25 (F 和 R)相应引物，对C型尼曼-匹克病患者的血液基因组DNA为模板进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳結果。图3和4显示了采用其它引物(表2)进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳結果。其中，泳道1-23依次表示DNA Marker,以及利用表2中NPCl_lF_a和NPCl_lR_a，NPC1_2F_a 和 NPCl_2R_a，NPCl_3F_a和 NPCl_3R_a，NPCl_4F_a和 NPCl_4R_a，NPCl_5F_a和 NPC1_5R_a, NPCl_6F_a 和 NPCl_6R_a，NPCl_7F_a 和 NPCl_7R_a，NPCl_8F_a 和 NPCl_8R_a，NPC1_9F_a 和 NPCl_9R_a，NPCl_10F_a 和 NPCl_10R_a, NPCl_llF_a 和 NPCl_llR_a, NPCl_12F_a 和NPCl_12R_a, NPCl_13F_a 和 NPCl_13R_a， NPCl_14F_a 和 NPCl_14R_a， NPCl_15/16F_a 和NPCl_15/16R_a, NPCl_17F_a 和 NPCl_17R_a，NPCl_18/19F_a 和 NPCl_18/19R_a，NPC1_20F_a 和 NPCl_20R_a， NPCl_21F_a 和 NPCl_21R_a， NPCl_22F_a 和 NPCl_22R_a， NPCl_23F_a 和NPCl_23R_a，NPCl_24F_a 和 NPCl_24R_a，NPCl_25F_a 和 NPCl_25R_a 引物，对 C 型尼曼-匹克病患者的血液基因组DNA为模板进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳結果。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，找到了ー类特别适合于扩增NPCl基因的引物，所述引物经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增时特异性良好，且扩增效率高。本发明人还优化了 PCR扩增反应，进ー步提高了扩增效率。NPCl 基因C型I类尼曼-匹克蛋白(NPCl)是參与胞内胆固醇转运的重要跨膜蛋白。NPCl基因定位于18qll_ql2，基因组DNA包含约55kb，共25个外显子，编码1278个氨基酸。NPCl蛋白广泛表达于脑神经细胞，其功能异常引起细胞内胆固醇转运障碍，从而导致一系列病理变化(Vanier, Μ. Τ. , et al. , Genetic heterogeneity in Niemann-Pick Cdisease:a study using somatic cell hybridization and linkage analysis. Am J HumGenet，1996. 58(1):p. 118-25)。并且研究发现，NPCl基因在患病人群中变异率较高，而在正常人群中变异率很低。因此，针对NPCl基因各外显子上碱基的突变检测对于疾病的诊断是重要的。
NPCl基因变异的检测试剂或试剂盒基于NPCl基因与C型尼曼-匹克病和肥胖的密切相关性，可以通过分析NPCl基因的变异情況，对C型尼曼-匹克病和肥胖的患病人群进行易感性分析，还可以对相关人群的患病风险进行早期评估。可以采用多种技术来检测NPCl基因的变异位点，目前较为方便的是用NPCl基因特异的引物进行PCR扩增，然后对扩增产物进行序列測定，从而判断是否发生变异。该检测技术既可以针对cDNA，也可以针对基因组DNA。本发明人在研究中发现，检测NPCl基因突变时，利用一般的引物进行PCR扩增时特异性较差，扩增效率不高。因此，需要设计和筛选特异性好的引物。经过大量的实验和比较，本发明人找到了对应于NPCl基因25个外显子的23对引物。经验证，所述引物获得的扩增产物既包含了 NPCl基因各外显子上完整的序列，且特异性非常好，PCR扩增成功率接近100%，特别适用于复杂体系的PCR扩增。各引物的核苷酸序列及其较佳的退火温度如表I所示。
权利要求
1.一种检测样品中是否存在NPCl基因变异的试剂，其特征在于，所述的试剂是引物对，选自下组SEQ ID NO:I 和 SEQ ID NO:2 ；SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 ；SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 ；SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 ；SEQ ID NO:11 和 SEQ ID NO:12 ；SEQ ID NO:13 和 SEQ ID NO:14 ；SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:16 ；SEQ ID NO:17 和 SEQ ID NO:18 ；SEQ ID NO:19 和 SEQ ID NO:20 ；SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22 ；SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24 ；SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26 ；SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:28 ；SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO:30 ；SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:32 ；SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:34 ；SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:36 ；SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38 ；SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40 ；SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42 ；SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44 ;和 / 或SEQ ID NO:45 和 SEQ ID NO:46。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于， SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2用于扩增NPCl外显子I序列； SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4用于扩增NPCl外显子2序列； SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6用于扩增NPCl外显子3序列； SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8用于扩增NPCl外显子4序列； SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10用于扩增NPCl外显子5序列； SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12用于扩增NPCl外显子6序列； SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14用于扩增NPCl外显子7序列； SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16用于扩增NPCl外显子8序列； SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18用于扩增NPCl外显子9序列； SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20用于扩增NPCl外显子10序列； SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22用于扩增NPCl外显子11序列； SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24用于扩增NPCl外显子12序列； SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26用于扩增NPCl外显子13序列；SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28用于扩增NPCl外显子14序列； SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30用于扩增NPCl外显子15和16序列； SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32用于扩增NPCl外显子17序列； SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34用于扩增NPCl外显子18和19序列； SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36用于扩增NPCl外显子20序列； SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38用于扩增NPCl外显子21序列； SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40用于扩增NPCl外显子22序列； SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42用于扩增NPCl外显子23序列； SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44用于扩增NPCl外显子24序列；和/或 SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46用于扩增NPCl外显子25序列。
3.—种检测样品中是否存在NPCl基因变异的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有选自权利要求I的一种或多种引物对； 较佳的，所述的试剂盒中含有SEQ ID NO: 1-46的引物。
4.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有 PCR扩增试剂； 核酸提取试剂； 核酸序列分析软件；和/或 使用说明书。
5.一种获得NPCl基因扩增产物的方法，其特征在于，所述的方法包括 以核酸样品为模板，利用选自权利要求I的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在进行PCR扩增时，PCR热循环步骤如下(a)94 ± I °C 进行 30 ± 5 秒；(b)59±4°C 退火 45 ±5 秒； (c)72±l°C进行45±5 秒； 重复步骤(a)-(c) 25±5次。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在进行PCR扩增时， 若以SEQ ID NO: I和SEQ ID NO:2为引物，退火温度是58± 1°C ； 若以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12为引物，退火温度是60± 1°C ; 若以SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO:20为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26为引物，退火温度是60± 1°C ；若以SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID N0:41和SEQ ID NO:42为引物，退火温度是60± 1°C ； 若以SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44为引物，退火温度是60± 1°C ;或 若以SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46为引物，退火温度是60± 1°C。
8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于， 在进行PCR热循环前，还包括模板变性步骤95±1°C进行3±2分钟；或 在进行PCR热循环后，还包括延伸步骤72±1°C进行10±2分钟。
9.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在PCR扩增体系中，还加入二甲基亚砜，其在PCR扩增体系中的终浓度按照体积为3-10%。
10.一种确定待测核酸样品中是否存在NPCl基因变异的方法，其特征在于，所述的方法包括 (1)采用权利要求5所述的方法从待测核酸样品中扩增NPCl基因片段； (2)分析(I)扩增产物中NPCl基因片段的序列，并与野生型NPCl基因中对应的序列进行比较；如果存在不同，则表明测核酸样品中存在NPCl基因变异。
全文摘要
本发明涉及NPC1基因突变的检测方法和试剂盒。首次揭示一类特别适合于扩增NPC1基因的引物，所述引物经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增时特异性良好，且扩增效率高。本发明人还优化了PCR扩增反应，进一步提高了扩增效率。
文档编号C12Q1/68GK102827942SQ20121034762
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者宁光, 崔斌, 洪洁, 曹旻, 石娟, 缪琳 申请人:上海市内分泌代谢病研究所