专利名称：一种检测肺癌骨转移试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒，具体而言，涉及一种肺癌骨转移荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术：
目前全世界范围内每年有超过100万的患者被诊断为肺癌，恶性肿瘤可以转移至体内不同的器官，骨转移是恶性肿瘤常见并发症之一。骨组织是恶性肿瘤远处转移最好发的器官，许多类型的恶性肿瘤都可以发生骨转移，引起骨转移的常见肿瘤有乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌等。恶性肿瘤骨转移多发生在50-80岁，40岁以下少见。骨转移可累及全身骨骼，中轴骨(脊柱，骨盆等)及长骨近端是骨转移的好发部位。骨转移常为多发性，少数为单发病变。骨的破坏形式大多为溶骨型，少数为成骨型或两者兼有(混合型)。原发性肺癌骨转移的好发部位依次为胸部、脊柱、骨盆、肢体骨及颅骨，肺循环血·流丰富，癌细胞可循血运到达人全身骨骼系统造成骨转移；肺癌中腺癌的骨转移率高于其他类型原发性肺癌，可能和腺癌的生物学特性有关，腺癌周围型肺癌较多见，容易直接侵犯到肋骨、脊柱又可以通过血路经脊柱静脉和肺静脉达到全身骨骼；也可能和腺癌病人存活时间长有关。肺癌骨转移最常见的类型为溶骨性骨转移，虽然也有局部骨组织的反应性增生，但其主要表现为骨组织的溶解破坏和吸收。成骨性转移以大量病理性成骨为特点，这些新生骨组织呈编织样，不具备正常骨的功能，反而破坏了骨的正常结构，影响骨的正常功能，因此会造成病理性骨折等并发症。病理性成骨的形成是肿瘤细胞与成骨细胞相互作用的结果，但也不能忽视破骨细胞的作用。肿瘤细胞在骨局部通过破骨细胞破坏骨组织的同时，可释放出骨组织中贮存的生长因子如TGFp、IGF等，加上肿瘤细胞自身分泌的BMP，PSA，ET-I等，可刺激成骨细胞的增殖。当成骨细胞活性增高，成骨大于破骨时，就出现了肿瘤性成骨，显示成骨性转移的特殊临床病理表现。混合性转移一般说来，由于骨代谢的特点，成骨及溶骨过程二者相互关联，成骨细胞与破骨细胞在功能上相互依存。因此，肿瘤的骨转移往往都是二者共存，只不过某一过程占据主导地位而已。破骨细胞的激活是所有骨转移发生的重要先决条件。以前列腺癌为例，尽管临床表现以成骨性转移为主，但在转移发生的早期阶段，肿瘤细胞对骨组织的破坏是重要的起始步骤，骨组织中贮存的生长因子如TGFp、IGF等的释放启动了前列腺癌骨转移的过程。随着成骨细胞的激活，病理性成骨逐渐变得明显，最后形成前列腺癌特有的成骨性转移。一般来说，30% -40%的晚期肺癌会发生骨转移，骨转移所致的骨损害将加重患者的病情，引起功能障碍，降低患者的生活质量，甚至缩短生存期。因此，深入研究恶性肿瘤发生骨转移的机制，分析骨转移患者的临床特点，早期诊断骨转移，预防相关并发症，可以提高患者的生活质量，为进一步的治疗提供条件。
预测肿瘤骨转移的手段有很多，如影像学诊断X线、CT，ECT，PET ;化学诊断主要包括血清学、生化、免疫学指标的检测；细胞学和病理组织学诊断仅对病人预后和临床治疗方案选择有一定的帮助；基因诊断的敏感性高，但极容易出现假阳性，诊断特异性取决于对靶分子的选择，发展高通量，自动化，集成化，标准化的基因诊断技术是今后的研究方向；骨髓穿刺活检(bone marrow biopsy):骨髓中发现的肿瘤细胞,不仅可以预测骨转移的情况，对预测其它器官如肺、肝的转移也很有临床价值。恶性肿瘤骨转移的诊断方法目前主要依赖病理和影像学检查如穿刺细胞学检查，X线、CT，MR和ECT检查等，尚无特异性实验室诊断方法，目单纯依赖ECT检查来判断骨转移有无及其进展状况，已难以满足临床需求。恶性肿瘤骨转移的诊断方法如能提前，可根据病人实际进行针对性治疗，阻止骨转移的发生，降低其危害。骨转移的发生必定需要基因的调控，基因起作用亦需要上游RNA的调控，所以、以miRNA为诊断检测骨转移的指标可将预测病变的时间大大提前，为阻止骨转移创造更佳的时机并争取更多的时间。
由于miRNA对引起骨转移的基因具有重要调控作用，因此本发明针对可引起骨转移病变的miRNA开发出一对特异性引物，并开发制作出试剂盒，并经大群体人群实验验证，结果显示本发明设计的可预测肺癌骨转移的试剂盒能有效检测可引起肺癌骨转移miRNA的发生。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测小RNA表达水平的荧光定量PCR试剂盒及使用方法，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。本发明的另一目的是在于提供一种荧光定量PCR试剂盒对肺癌是否发生骨转移进行快速的检测。为了实现上述目的，本发明首先分别提取了肺癌发生骨转移患者肿瘤细胞和肺癌未发生骨转移患者肿瘤细胞的总RNA,并从中纯化miRNA,利用Single-end library建库方法，共得到两个肺癌骨转移前后肿瘤细胞miRNA转录组文库。对所得的miRNA转录组文库进行高通量测序，对高通量测序序列过滤，去除低质量序列，使用S0AP2方法跟人类基因组进行比对。并对测序结果进行分析，其中通过fold-change方法，对不同样本的表达差异基因进行了比较，得到了表达差异显著的miRNA novel_mir_89，其序列见序列表SEQ ID NO. 5。本发明根据noVel_mir_89的序列信息，设计了四条引物，第一条为茎环状结构的反转录引物RT89，其序列见序列表SEQ NO. I ;第二条是上游的特异引物F89，其序列见序列表SEQ NO. 2 ;第三条为下游的通用引物R89，其序列见序列表SEQ NO. 3 ;第四条是在荧光定量PCR中需要的荧光探针引物Flu89，其序列见序列表SEQ NO. 4，在荧光探针Flu89的5’端标有荧光基因FAM，在荧光探针Flu89的3’端标有荧光淬灭基团TAMRA。本发明还制备了含有noVel_mir_89序列的标准DNA模板。制备步骤方法如下提取肺癌发生骨转肿瘤细胞的总RNA，从中纯化出miRNA，接着进行逆转录反应，反转录体系为茎环状结构的反转录引物RT89，SEQ ID NO. I (2 μ mol/L) I μ 1，miRNA4y tl, dNTP混合物(每种 2. Smmol /I,) 4 μ 1,0. lmol/L DTT2 μ I, SuperScript RNase H 逆转录酶(200U/μ1)2μ1。反应条件为37°C水浴60分钟，95°C水浴3分钟。将逆转录反应得到的cDNA进行常规PCR扩增，PCR产物检测后切胶回收并纯化，将纯化产物连接到PGM-T克隆载体上，随后转化到DH5a感受态细胞中。通过序列为SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备。本发明还制备了一种检测novel_mir_89表达水平的突光定量PCR试剂盒，组分如下特异性引物、特异性探针、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ IDN0.2，下游引物序列为SEQ ID NO. 3，特异性探针的核苷酸序列见序列表SEQN0. 4，在荧光探针的5’端标有荧光基因FAM，在荧光探针的3’端标有荧光淬灭基团TAMRA。本发明还公开了一种检测肺癌是否发生骨转移的荧光定量PCR试剂盒的使用方法，荧光定量 PCR 体系Hot-start Taq DNA 聚合酶(2. 5U/μ I) I μ l，Hot_startTaq DNA 聚合酶的10Xbuffer5 μ 1，dNTP混合物(每种IOmmoI/L) I μ 1，上游引物(10 μ mol/L)，下游 引物(10 μ mol/L) ,TaqMan 探针(5 μ mol/L)各 I μ 1，样品 cDNA5 μ I 或标准质粒 DNA2 μ 1，加离子水至50 μ I。荧光定量PCR程序5°C IOmin预变性，接45个循环95°C 40s，60°C lmin。本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为107-102COpieS/μ i，最小检出浓度为IOOcopies/ μ I。通过对阳性样品的检测，发现本试剂盒检测准确率达91 %。连续3次重复实验，实验结果稳定。
图I小RNA长度在样本A和B的分布。样本A为肺癌未转移病人的肿瘤细胞miRNA转录组数据，样本B为肺癌骨转移病人的肿瘤细胞的miRNA转录组数据。图2各浓度下标准DNA模板的PCR扩增曲线。曲线从左到右依次为浓度为108、107U06U05U04U03U02个拷贝/ μ I的标准DNA模板的PCR扩增曲线。图3标准DNA模板荧光定量PCR的标准曲线。图4novel_mir_89在肺癌骨转移病人和正常人中的表达量。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。实施例I肺癌骨转移前后肿瘤细胞microRNA表达的变化一材料和方法I、材料肿瘤细胞均来自于附属医院2004年-2010年因肺癌住院病例，分别取30例肺癌骨转移病人的肿瘤细胞和30例肺癌未转移病人的肿瘤细胞。2、方法2. I肺癌骨转移前后肿瘤细胞总RNA的提取
按Trizol试剂盒说明书提取肺癌骨转移病人和肺癌未转移病人肿瘤细胞的RNA，通过凝胶电泳证明RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。采用上海华舜生物工程有限公司总RNA抽提试剂盒子提取。主要操作步骤如下(I)用胞裂解液BL裂解组织细胞，离心取上层细胞。在上层细胞中加入Iml的Trizol，用带针头的一次性注射器抽打裂解物10次。(2)静置5分钟后，加入200 μ I的氯仿，用力颠倒离心管混匀后，室温静置使之分层，12000g离心5分钟，小心移取水相至I. 5ml的离心管中。(3)加入等体积的异丙醇，彻底混匀后，取出750 μ I移入吸附柱，离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中，将剩余的全部将入吸附柱中，离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一个收集管中。(4)加入500 μ L RP液，离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集 管中。(5)将500 μ I的W3液，静置I分钟，离心15秒。(6)将吸附柱移入一个干净的收集管中，加入500 μ I W3液，离心15秒。(7)倒掉收集管中的液体，再将吸附柱移入同一收集管中，离心I分钟。(8)将吸附柱放入另一个干净的I. 5ml的离心管中，在吸附膜中央加入50 μ I纯水，室温静置I分钟后，离心I分钟。将RNA贮存于-70°c。(9)总RNA完整性鉴定取2 μ I RNA样品在I. 5%琼脂糖凝胶电泳(80v，15min)，分出区带后，EB染色，紫外灯下观察电泳区带。(10)用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度2. 2、肺癌骨转移前后肿瘤细胞miRNA转录组文库的构建及测序利用QIAGEN公司的RNeasy MinElute Cleanup Kit从上述得到的总RNA中纯化miRNA,具体步骤见说明书。利用Single-end library建库方法,共得到两个肺癌骨转移前后肿瘤细胞miRNA转录组文库。将上述miRNA转录组文库进行高通量测序，对高通量测序序列过滤,去除低质量序列，使用S0AP2方法跟人类基因组进行比对。2. 3、生物信息学分析生物信息学分析流程Illumina测序所得50nt序列，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据处理得到干净序列，对其进行序列长度分布的统计及样品间公共序列统计。将清理后的干净序列分类注释，可以获得样品中包含的各组分及表达量信息。将所有小RNA片段注释后，用预测软件Mireap对未得到注释片段进行新的miRNA预测。具体生物信息学内容如下数据处理对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads的处理，并统计sRNA的长度分布，标准信息分析(I)分析样品间的公共序列及特有序列；(2)探索sRNA在选定的参考基因组上的分布；(3)通过与Rfam(9. I)数据库以及Genbank的比对,鉴定rRNA、tRNA、snRNA等非编码RNA ；(4)通过与miRNA数据库(miRBasel6. O)中指定范围的miRNA进行比对,鉴定样品中的已知miRNA ；(5)分析已知miRNA的表达模式；(6)通过与重复序列的比对，鉴定与重复序列相关的sRNA ；(7)通过与外显子、内含子的比对鉴定mRNA降解片段；(8)按照优先级对sRNA进行分类注释；(9)利用Mireap对没有注释的sRNA进行预测预测新的miRNA,绘制新的miRNA 的二级结构图；(10)参照Audic S.等人发表在Genome Research上的基于测序的差异基因检测方法，分析了肺癌骨转移前后病人的肿瘤细胞miRNA的差异表达。二结果通过使用Illumina Solexa Hiseq2000,利用 Single-end library 建库方法,共得到两个miRNA转录组数据，分别为A和B，A为肺癌未转移病人的肿瘤细胞miRNA转录组数据，B为肺癌骨转移病人的肿瘤细胞的miRNA转录组数据。I. small RNA测序结果概述对这些初步的35nt左右的原始reads做去接头,去低质量reads,去污染等处理，得到高质量的测序reads，其中A有25 100 000个reads，B有24 600 000个reads，后续分析均以此为基础。首先对小RNA做长度分布统计，一般来说，miRNA集中在21或22nt，siRNA集中在24nt，piRNA集中在30nt。2个样本的small RNA均在22nt位置呈现出明显的单峰结构(如图I)，说明其大多数为miRNA。A组中20— 24nt的sRNAs占细胞总sRNA的51. 61 %，B组中20—24nt的sRNAs占细胞总sRNA的52. 28%。样品中reads做分类注释，得到2个样本中各种小RNA的比例(如图2)。可以看到miRNA的含量最高，其次是未注释的RNA(unarm)，其可能为siRNA和未发现的miRNA。2.新miRNA候选基因的预测将clean reads序列做分类注释，我们获得样品中各类小RNA的表达信息，其包括miRNAs, rRNA, tRNA, scRNA, snRNA, snoRNA,重复序列相关小 RNA，mRNA 相关 RNA 和未注释的小RNA。除表达量最高的miRNAs之外，其次就是未注释的小RNA。对新miRNA的生物信息学预测，是基于已知的miRNA加工成熟中的特点来实现的，长度为18-25nt，其对应前体的位置能够形成发夹样结构，我们是利用miRNA预测软件Mireap (https: //sourceforge. net/pro jects/mireap/)进行的，预测 miRNA 主要是根据miRNA的特殊结构1、候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存在；2、sRNA必须在远离发夹结构环，位于发夹结构两臂上；3、酶切位点的保守性，一般的miRNA酶切位点不会偏移超过3个碱基；4、发夹前体要有较低的折叠自由能能量。分析发现了一些新的miRNA候选基因，共107条，其中在骨转移前88条，骨转移后76条。3.肺癌骨转移前后病人的肿瘤细胞miRNA的差异表达分析为了分析肺癌骨转移前后病人miRNA的差异表达，先将A、B两个miRNA转录组的各个miRNAs标准化，某miRNA标准化表达=某miRNA实际数量X 1000000/转录组中reads的总数。如果某个miRNA在两个转录组中的标准化reads之和小于1，则被剔除不再分析，如果某个miRNA在其中一个转录组中的表达值为O则其标准表达值为O. 01。倍数变化(fold-change)计算为Log2 (实验组/对照组)。用下面方法计算P值
倍数变化值大于I则认为miRNA表达上调，倍数变化值小于_1则认为miRNA表达下调，特别是当P值小于O. 05时，具体结果见表I :表I肺癌骨转移前后病人的肿瘤细胞miRNA的差异表达
权利要求
1.一种miRNA novel_mir_89的特异性引物及特异性探针,其特征在于,所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3，特异性探针的核苷酸序列为SEQ ID NO. 4。
2.一种检测肺癌骨转移的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求I所述的特异性引物和特异性探针。
3.根据权利要求2所述的一种检测肺癌骨转移的荧光定量PCR试剂盒，还包括标准DNA 模板、Hot-start Taq DNA 聚合酶,其浓度为 2. 5U/μ I, Hot-start TaqDNA 聚合酶的IOXbuffer, dNTP 混合物，每种 NTP 浓度为 10mmol/L。
4.权利要求I的引物和探针在制备检测肺癌骨转移试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测肺癌骨转移荧光定量PCR的试剂盒。该试剂盒包括以下成分特异性引物、特异性探针、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液。本发明还公开了一种检测肺癌骨转移荧光定量PCR试剂盒的使用方法。利用该试剂盒可以快速定量检测novel_mir_89的表达量，从而检测肺癌骨转移的发生情况。本发明操作简便、快速、结果稳定、灵敏度高且特异性强。
文档编号C12N15/11GK102876789SQ201210347230
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者杨祚璋, 谢琳, 徐磊, 李国奇 申请人:杨祚璋