专利名称：骨骼肌特异性表达pepck-c以改变小鼠运动能力和代谢功能的转基因载体的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种骨骼肌特异性表达PEPCK-C以改变小鼠运动能力和代谢功能的转基因载体。
背景技术：
憐酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase, PEPCK)是催化糖异生(gluconeogenesis)反应的一个限速酶，即由草酰乙酸和GTP转变为磷酸烯醇式丙酮酸、⑶P及C02的反应。目前已知有两种PEPCK同工酶，分别是PEPCK-M (mitochondrialform)和PEPCK-C(cytosolic form)，PEPCK-C (也叫PCKl)在糖异生中有重要作用，对其研究也更多。目前PEPCK-C已成为肝脏糖异生的一明确的标记物，肝脏中此基因的转录水 平成为临床上2型糖尿病评价的重要指标，即如果PEPCK-C的mRNA表达增加，糖异生的速率就一定会增加。PEPCK-C基因编码了一个63kDa的蛋白酶，主要在肝脏和肾皮质中表达，并催化糖异生反应；在肝脏以及白色和棕色脂肪组织中，PEPCK-C还参与甘油异生反应(glyceroneogenesis);此外，PEPCK-C在流失反应(cataplerosis)中起作用，以去除朽1檬酸循环中的阴离子；PEPCK-C酶同时还广泛存在于哺乳动物的组织内，包括小肠、结肠、乳腺、肾上腺、肺和肌肉。但是其在这些组织中的代谢作用仍未明确。PEPCK-C在不同组织中的活性是在转录水平上调控的。例如，在肝脏中特异表达 PEPCK-C基因只需要从_460bp到+69bp的启动子序列，营养物质和荷尔蒙可调控PEPCK-C基因的转录水平，cAMP、糖皮质激素和胰岛素都能调节PEPCK-C基因的转录，并已确定了它们在PEPCK-C启动子上的相对应的调控序列。由于PEPCK-C在不同组织中的主要功能不同，所以不同的组织特异性的基因敲除或过表达引起多种不同的表型。正常情况下，PEPCK-C在骨骼肌中不表达或表达量很低。PEPCK-C用6个ATP的能量来催化丙酮酸转变为一个葡萄糖，而在骨骼肌中的无氧酵解每分解一个葡萄糖，却只能生成2个ATP。我们预期在骨骼肌中过度表达PEPCK-C，血液中的甘油三酯和游离脂肪酸可能都会向骨骼肌运输，提供更多的能量，并可能影响机体的代谢水平。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能在骨骼肌中特异性表达PEPCK-C以改变小鼠运动能力和代谢功能的转基因载体。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下—种能在骨骼肌中特异性表达PEPCK-C的转基因片段包含小鼠的α -骨骼肌肌动蛋白(a-skeletal actin)基因的启动子、小鼠PEPCK-C的cDNA和牛生长激素基因(bGH)的3’端不翻译区域，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因一嘌呤霉素(Puromycin)基因和原核细胞中筛选用的抗性基因一氨苄青霉素(ampicillin)基因(见图2)。3. 3kb的小鼠α -骨骼肌肌动蛋白(a -skeletal actin)启动子可保证下游的基因在骨骼肌中特异性表达。本发明构建的骨骼肌特异表达鼠PEPCK-C的转基因载体的全序列如SEQ ID No:I所示，其中228-3525碱基为α -骨骼肌肌动蛋白(a-skeletal actin)基因的启动子区，第3604-5472碱基为鼠PEPCK-C编码区，第6386-6610碱基为bGH 3’端不翻译区，第6693-7292碱基为嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因，第9337-10336碱基为氨苄青霉素(Ampicillin)抗性基因。本发明的转基因载体可用于体细胞克隆，以构建能够改变小鼠运动能力和代谢功能的PEPCK-C转基因小鼠。
图I是本发明的技术流程图。图2是本发明构建的PST229转基因载体的示意图。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例I :插入小鼠PEPCK-C编码区域DNA片段，构建pst228。将本实验室的载体pst215用BsaBI和AscI双酶切，酶切体系为2 μ g质粒DNA，
3μ 110Xbuffer, I. 5 μ IBsaBI 酶，I. 5 μ IAscI 酶，加入 ddH20 补足体积至 30 μ 1，37。C 温浴3小时。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出6. 3kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤为，将紫外光下切下目的DNA条带装入1.5ml离心管中，称重后加入3倍体积的溶胶液，55°C保温10分钟，使琼脂糖凝胶完全融化；融化的凝胶待温度降至室温后，将混合液转入附柱中，10，OOOg离心I分钟，倒掉流出液；加入650 μ I漂洗缓冲液，10，OOOg离心I分钟，倒掉流出液；吸附柱再次离心，10，OOOg离心，I分钟，倒掉流出液；将吸附柱转移到一个新的I. 5ml离心管中，加入50 μ IddH2O，放置I分钟，10，OOOg离心I分钟收集纯化产物。通过全基因合成(Invitrogen)得到小鼠PEPCK-C编码区域DNA片段，用BsaBI和AscI 双酶切，酶切体系为 3 μ g质粒 DNA，3 μ 110 X buffer, I. 5μ IBsaBI 酶，I. 5μ IAscI 酶，加入ddH20补足体积至30 μ 1，37° C温浴3小时。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出I. 9kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。。将pst215(BsaBI/AscI)和小鼠 PEPCK-C 编码区域 DNA 片段(BsaBI/AscI)连接，连接反应中加入2μ I载体，6 μ I插入片段，1μ 1T4DNA连接酶，16° C温浴16小时。将连接产物转化到Ε. coli的感受态细胞中。取一管50 μ I的Trans5 α受态细胞置于冰上，待其融化后，向其中加入4μ I上述连接产物，轻弹混匀，后于冰上孵育30分钟；42°C热击30秒，后冰上静置10分钟；加入500 μ I无抗性的LB液体培养基，37°C震荡培养I小时；4，000rpm离心5分钟，吸走，保留100 μ I左右的培养基，用移液器将细菌沉淀吹打均匀后涂布在含氨苄青霉素抗性的LB培养基平板上。然后将平板置于37°C温箱培养16小时。
克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C震荡培养12小时，提取质粒DNA，用EcoRI酶切鉴定，阳性克隆中可得到4. Okb,2. 7kb、l. 9kb、
0.5kb的四条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性，得到的克隆即为pst228。实施例2 :插入小鼠α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA片段，构建pst229。将pst228 用 Nrul 和 BsaBI 双酶切，酶切体系为 2μ g 质粒 DNA，3y 110Xbuffer,
1.5 μ INrul SI, I. 5 μ IBsaBI酶，加入ddH20补足体积至30 μ 1，37° C温浴3小时。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出7. Okb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。通过PCR扩增得到3. 3kb的小鼠α -骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA片段，PCR条件如下1 μ I (约 IOOng)鼠基因组 DNA，引物 I (TCG CGA ACG CGT GCCTTCCCTGTC)和引·物 2 (GAT CAC GAT CTA GTT TCT GCA AAG ACA AG)的终浓度均为 O. 5 μ Μ, dNTPs 的终浓度为 0·2πιΜ，5μ 110Xbuffer, I μ IHiFi Taq 酶，加入 ddH20 补足体积至 50 μ I. PCR 循环为，95° C，2分钟；接着是95° C，30秒，55° C，60秒，72° C，3分钟，35个循环；72° C，5分钟；4° C，保温。将PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出3. 3kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。将PCR扩增得到的3. 3kb的小鼠α -骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA片段通过TA克隆连接到pEASY-T3载体(全式金公司)上。lμlpEASY-T3，加入4μl3. 3kb的鼠α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA片段，25° C，30分钟。然后将连接反应转化到E. coli感受态细胞中，把转化后的细胞涂布到含有IPTG和X-Gal以及氨苄青霉素的LB平板上生长。克隆生长出来后，挑白色的单克隆菌落至3ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37°C震荡培养12小时，提取质粒DNA，用EcoRI酶切鉴定，阳性克隆中可得到3. Okb和3. 3kb的两条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性，得到的克隆即为PPEK。从pPEK用Nrul和BsaBI双酶切以切出小鼠α -骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA,酶切体系为 3 μ gpPEK3DNA，3 μ 110 X buffer, I. 5 μ INrul 酶，I. 5 μ IBsaBI 酶，加入ddH20补足体积至30 μ 1，37° C温浴3小时。然后将酶切体系在1%的琼脂糖凝胶中通过电泳分离，切出3. 3kb大小的DNA条带，用胶回收纯化试剂盒纯化DNA。具体步骤同上。将pst228 (Nrul/BsaBI)和小鼠α -骨骼肌肌动蛋白基因的启动子DNA (NruI/BsaBI)连接，连接反应同上。将连接产物转化到Ε. coli的感受态细胞中。具体步骤同上。克隆生长出来后，挑单克隆菌落至3ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37 °C震荡培养12小时，提取质粒DNA，用EcoRI酶切鉴定，阳性克隆中可得到6. lkb,2. lkb、L4kb和0.8kb的四条DNA条带。再通过测序进一步确定阳性克隆的正确性，得到的克隆即为pst229,即本发明描述的转基因载体。实施例3 :利用原核注射的方法构建转基因小鼠并进行鉴定。将构建好的pst229转基因载体直接注入受精卵，使外源基因整合到DNA中，然后将受精卵植入4-5周龄的代孕母鼠体内。PEPCK-Cmus转基因小鼠繁殖成功后，进行运动及代谢方面的相关研究，研究发现，与同龄的野生型小鼠比较，PEPCK-Cmus转基因小鼠运动能力更强(小鼠运动平板测试158. 25±54. 59vs. 2366±687. 77，单位m，P〈0. 01)，胰岛素敏感性更高(胰岛素耐量试验血糖-时间曲线下面积16. 27 ± I. 16vs. 15. 19 ±O. 90,单位mmol/L,Ρ〈0· 05)，血脂水平较低(I. 64±0· 20vs. 5. 19±2· 02，单位nmol/L, Ρ〈0· 01)，空腹血糖(7. 73±0· 35vs. 6. 48±0· 78，单位mmol/L)、体重(25. 95±0· 07vs. 28. 25±0· 35，单位g)、腹部脂肪比例没有差异(16. 14±1.92vs. 17. 52±1.20，单位:%)，但通过组织切片H&E染色和油红染色结果发现骨骼肌中有明显脂肪堆积。结果说明PEPCK-C基因在小鼠骨骼肌中特异性表达，提高了小鼠的运动耐力和胰岛素敏感性并使血脂维持在较低水平，进一步说明PEPCK-C基因在骨骼肌中表达对机 体的能量代谢有重要作用。
权利要求
1.骨骼肌特异性表达PEPCK-C以改变小鼠运动能力和代谢功能的转基因载体，其特征在于，所述转基因载体含有小鼠的3. 3kb α -骨骼肌肌动蛋白基因的启动子、小鼠PEPCK-C的cDNA和牛生长激素基因的3’端不翻译区域，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因一嘌呤霉素基因和原核细胞中筛选用的抗性基因一氨苄青霉素基因。
2.根据权利要求I所述的骨骼肌特异性表达PEPCK-C以改变小鼠运动能力和代谢功能的转基因载体，其碱基全序列如SEQ ID No. I所示。
全文摘要
本发明公开了一种肌肉组织特异性表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)以改变小鼠运动能力和代谢功能的转基因载体，所述转基因载体含有小鼠的3.3kbα-骨骼肌肌动蛋白(α-skeletal actin)基因的启动子、小鼠PEPCK-C的cDNA和牛生长激素基因(bGH)的3’端不翻译区，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因—嘌呤霉素(Puromycin)基因和原核细胞中筛选用的抗性基因—氨苄青霉素(Ampicillin)基因。本发明的转基因载体可用于体细胞克隆，以构建PEPCK-Cmus转基因小鼠。
文档编号C12N15/85GK102827874SQ201210345550
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者戴一凡, 冯玮, 任媛媛, 刘乃丰 申请人:中国药科大学, 南京医科大学