海水环境中氯氰菊酯降解菌及其分离纯化和应用的制作方法

专利名称：海水环境中氯氰菊酯降解菌及其分离纯化和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种海水环境中氯氰菊酯降解菌及其分离纯化和应用。
背景技术：
氯氰菊酯含有多个苯环结构，不溶于水，为高亲脂性农药，是一种高效、广谱人工合成拟除虫菊酯杀虫剂，目前被广泛应用于果园、茶园、农田以及渔业养殖等害虫的防治。然而，残余的氯氰菊酯可通过地表径流或养殖海域使用等途径进入水体，给环境、食品安全和人类健康带来极大危害，对渔业生产和生态环境造成影响。目前，对农药的残留的修复方法主要有物理、化学和生物修复方法，与物理化学方 法费用高、副作用大等相比，生物修复方法具有高效、成本低、无二次污染等优势，尤其是微生物修复在降解和消除农药残留方面具有安全、高效等特点，可以农药作为碳源和能源对农药进行代谢，是治理农药环境污染的有效生物修复途径。因此，筛选不同类型的拟除虫菊酯类农药高效降解菌，对拟除虫菊酯类农药残留的生物修复和应用具有十分重要的意义。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种海水环境中氯氰菊酯降解菌及其分离纯化和应用，该降解菌可安全、高效、快速的降解海水环境中氯氰菊酯，使其降解率达90%以上。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种海水环境中氯氰菊酯降解菌，该菌为HS-12菌株，分类命名为海环站菌属(Mesonia sp.)，于2012年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6045，该菌株的16S rRNA 的 Genbank 登陆号为 JX087927。该菌株的生物学特征如下革兰氏阴性，为杆菌，半乳糖甙酶、精氨酸双水解试验、柠檬酸盐试验、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧试验、V-P反应、明胶液化试验阳性，尿素酶试验、H2S反应、色氨酸脱羧酶、吲哚酶试验阴性，不可以利用蔗糖。该菌株海水中生长，最适生长温度25_30°C，最适生长pH为7. 0-7. 8，在固体培养基上，菌落圆形、较薄，呈白色，半透明。一种海水环境中氯氰菊酯降解菌的分离纯化方法，具体包括如下步骤
(1)培养基配制
将氯氰菊酯溶液加入到营养培养基中，使氯氰菊酯终浓度为100 mg/L，得到富集培养
液；
(2)降解菌分离纯化
取500 mL海水样品于无菌状态下过滤富集后，加入到富集培养液中，在温度28V、转速180 rpm的条件下，培养7 d，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自前次所得培养液，将最后一次培养所得的培养液稀释8-10倍后，取100 μ L涂布于含100mg/L氯氰菊酯的固体平板上，28°C恒温培养箱中培养，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至富集培养液中振荡培养，在温度28°C、转速180 rpm的条件下，培养7 d，通过气相色谱-电子捕获器检测各富集培养液中拟除虫菊酯类农药残留量，最后筛选获得一株对氯氰菊酯农药具有高效降解能力的菌株，即氯氰菊酯降解菌HS-12菌株。所述的营养培养基配制方法如下精确称取磷酸高铁O. Olg、蛋白胨5. 0g、酵母膏I. 0g，加入过滤海水IOOOmL,混合均匀后，调节pH为7. 0-7. 8，于121 °C高压蒸汽灭菌20 min后制得。一种海水环境中氯氰菊酯降解菌的应用，该菌株对氯氰菊酯具有较高的生物降解能力，可用于氯氰菊酯农药污染的海水及沉积物环境的生物修复。
该菌株在温度25-30°C、pH 7.0-7.8、氯氰菊酯农药浓度10011^/1的条件下，7 d后对海水中氯氰菊酯的降解率达到90 %以上。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明海水环境中氯氰菊酯降解菌，可安全、高效、快速的降解海水环境中残留的氯氰菊酯农药，在温度25-30°C、pH 7. 0-7. 8、农药浓度100mg/L的条件下，7d后对海水中氯氰菊酯的降解率为达到90. 1%，进一步采用发光细菌法研究了微生物降解前后，海水中氯氰菊酯污染的生物毒性，结果表明，该菌株对海水中氯氰菊酯具有较好的降解效果，极大的消除了氯氰菊酯及其降解产物的生物毒性。综上所述，本发明从海水中分离出氯氰菊酯降解菌，对海水中氯氰菊酯具有较好的降解效果，对保护海洋生态环境、水产品安全及人类健康具有重要的意义，同时为拟除虫菊酯类农药农残降解研究提供了基础，开发前景广阔。上述海水环境中氯氰菊酯降解菌，该菌株分类命名为海环站菌属(Mesonia sp.)菌株为HS-12株，保藏编号为CGMCC No. 6045，于2012年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。


图I为本发明HS-12农药降解菌的扫描电镜图2为本发明氯氰菊酯的标准样品色谱图。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。具体实施例一
降解菌株的筛选与鉴定
I、培养基和试剂
营养培养基精确称取磷酸高铁0.01 g、蛋白胨5. O g、酵母膏I. O g，加入过滤海水1000 mL，混合均匀后，调节pH为7.0-7.8，高压蒸汽灭菌(1211，20 min)后制得。富集培养液在营养培养基中加入氯氰菊酯溶液，使得氯氰菊酯的浓度为100 mg/L02、菌株分离纯化海水样品采自宁波近岸海域，取500mL海水于无菌状态下过滤富集后，加入到含100mg/L氯氰菊酯的富集培养液中，在温度28°C、转速180 rpm的条件下,培养7d,重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自前次所得培养液，将最后一次培养所得的培养液稀释10倍后，取100 μ L涂布于含100 mg/L氯氰菊酯的固体平板上，28 °C恒温培养箱中培养，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至富集培养基中振荡培养(28 °C, 180 rpm) 7 d，通过气相色谱-电子捕获器(GC-ECD)检测各富集培养液中拟除虫菊酯类农药残留量，最后筛选获得一株对氯氰菊酯农药具有高效降解能力的菌株，命名为HS-12。该HS-12菌株，分类命名为海环站菌属(Mesonia sp.)，于2012年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6045，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株的16S rRNA的Genbank 登陆号为 JX087927。具体实施例二 高效氯氰菊酯农药降解菌株的鉴定
将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照片如图I所示。该菌株的主要生物学特征为革兰氏阴性，为杆菌，β-半乳糖甙酶、精氨酸双水解试验、柠檬酸盐试验、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧试验、V-P反应、明胶液化试验阳性，尿素酶试验、H2S反应、色氨酸脱羧酶、吲哚酶试验阴性，不可以利用蔗糖。该菌株海水中生长，最适生长温度25-30 °C，最适生长pH为7. 0-7. 8，在固体培养基上，菌落圆形、较薄，呈白色，半透明，该菌株经16s rRNA序列分析鉴定为海环站菌属(Mesonia sp.)。具体实施例三
氯氰菊酯降解菌对海水中拟除虫菊酯类农药的降解效果及应用将分离、纯化后的菌株接种于100 mL含氯氰菊酯100 mg/L的富集培养液中(配制方法如实施例一所示)，以不接菌的富集培养基作对照，在28°C、180 rpm的恒温摇床上震荡培养7 d。培养结束后，吸取2 mL培养液，加O. 4 g NacL，涡旋混匀，依次采用4 mL的正己烷与丙酮(体积比1:1)的混合溶液和2 mL的正己烷与丙酮的混合溶液萃取，合并两次萃取所得上清液，取3 mL上清液，加入0.4 g无水硫酸钠，氮气吹干后用I mL异辛烷与丙酮(体积比1:1)的混合溶液溶解，供GC-ECD分析检测，每个实验重复三次，通过考察降解率来判断该菌的降解能力。气相色谱检测条件岛津GC-2010气相色谱仪，色谱柱，E⑶检测器，进样口温度2500C，柱温2400C，检测温度3200C，柱流I. Omg/L,分流比为3:10，载气为N2 (99. 999%)，进样量为lyL。降解率(％)=(对照样品残留量-处理样品残留量)X100/对照样品残留量
氯氰菊酯标准样品的色谱图如图2所示，测得的富集培养基中氯氰菊酯的回收率为98. 2%，变异系数为2.5%。本发明菌株在纯培养条件下对100 mg/L的氯氰菊酯的降解率为90. 1%，所有未加菌的空白对照7d后的水解率均小于5. 0%。实验结果表明该菌对海水中氯氰菊酯农药残留具有较好的降解能力，因此，该菌对环境中氯氰菊酯农药的降解，尤其是海水养殖环境污染的修复具有广泛的应用前景。上述实施例是对本发明的进一步详细说明，但本发明的保护范围不限于上述实施例，以权利要求书为准。
权利要求
1.一种海水环境中氯氰菊酯降解菌，其特征在于该菌为HS-12菌株，分类命名为海环站菌属(Mesonia sp.),于2012年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No. 6045，该菌株的16S rRNA的Genbank登陆号为JX087927。
2.根据权利要求I所述的海水环境中氯氰菊酯降解菌，其特征在于该菌株的生物学特征如下革兰氏阴性，为杆菌，半乳糖甙酶、精氨酸双水解试验、柠檬酸盐试验、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧试验、V-P反应、明胶液化试验阳性，尿素酶试验、H2S反应、色氨酸脱羧酶、吲哚酶试验阴性，不可以利用蔗糖。
3.根据权利要求I所述的海水环境中氯氰菊酯降解菌，其特征在于该菌株海水中生长，最适生长温度25-30°C，最适生长pH为7. 0-7. 8，在固体培养基上，菌落圆形、较薄，呈白色，半透明。
4.一种根据权利要求I所述的海水环境中氯氰菊酯降解菌的分离纯化方法，其特征在于具体包括如下步骤(1)培养基配制将氯氰菊酯溶液加入到营养培养基中，使氯氰菊酯终浓度为100 mg/L，得到富集培养液；(2)降解菌分离纯化取500 mL海水样品于无菌状态下过滤富集后，加入到富集培养液中，在温度28V、转速180 rpm的条件下，培养7 d，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自前次所得培养液，将最后一次培养所得的培养液稀释8-10倍后，取100 μ L涂布于含100mg/L氯氰菊酯的固体平板上，28°C恒温培养箱中培养，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至富集培养液中振荡培养，在温度28°C、转速180 rpm的条件下，培养7 d，通过气相色谱-电子捕获器检测各富集培养液中拟除虫菊酯类农药残留量，最后筛选获得一株对氯氰菊酯农药具有高效降解能力的菌株，即氯氰菊酯降解菌HS-12菌株。
5.根据权利要求4所述的海水环境中氯氰菊酯降解菌的分离纯化方法，其特征在于所述的营养培养基配制方法如下精确称取磷酸高铁O. 01 g、蛋白胨5. O g、酵母膏I. O g，加入过滤海水1000 mL，混合均匀后，调节pH为7. 0-7. 8，于121°C高压蒸汽灭菌20 min后制得。
6.一种根据权利要求I所述的海水环境中氯氰菊酯降解菌的应用，其特征在于该菌株对氯氰菊酯具有较高的生物降解能力，可用于氯氰菊酯农药污染的海水及沉积物环境的生物修复。
7.一种根据权利要求6所述的海水环境中氯氰菊酯降解菌的应用，其特征在于该菌株在温度25-30°C、pH 7. 0-7. 8、氯氰菊酯农药浓度100 mg/L的条件下，7 d后对海水中氯氰菊酯的降解率达到90 %以上。
全文摘要
本发明公开了海水环境中氯氰菊酯降解菌，该菌株为HS-12株，分类命名为海环站菌属(Mesoniasp.)，于2012年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.6045，该菌株的16SrRNA的Genbank登陆号为JX087927，该发明同时公开了海水环境中氯氰菊酯降解菌的分离纯化方法及应用，优点是可安全、高效、快速的降解海水环境中氯氰菊酯，在近海环境保护、养殖环境农药残留污染治理和保障食品安全方面具有很好的应用前景。
文档编号C12R1/01GK102899269SQ201210345258
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者刘菁华, 史西志, 孙爱丽, 李德祥, 周磊, 陈炯 申请人:宁波大学