一种阿氏芽孢杆菌及其菌剂和制备方法与应用与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种阿氏芽孢杆菌及其菌剂和制备方法与应用。

背景技术：

拟除虫菊酯类杀虫剂属第三代农药，是模仿天然除虫菊酯的化学结构的而人工合成的一类杀虫剂。经过对天然除虫菊酯结构的不断修饰和改造，目前已开发了 50 多种商品化的拟除虫菊酯类农药，其中主要有氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯、功夫菊酯、氟氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯等拟除虫菊酯类农药。由于拟除虫菊酯类人工合成的农药因其对环境相对友好，具有杀虫谱广、药效高，对哺乳动物安全性高，这样使得菊酯类杀虫剂在卫生和农用方面迅速扩大了施用面积。随着传统的有机氯、有机磷等毒性高、降解慢的农药的禁用，拟除虫菊酯类农药成为现今我国施用面积最为广泛的农药之一。高效氯氰菊酯是拟除虫菊酯类杀虫剂中的一种，常用于烟草上的害虫控制，具有胃毒和触杀作用，虽然对作物安全，但是它们对人、畜有中等毒性，对水生生物、蜜蜂、家蚕高毒。随着该类农药使用量的增加，环境中的拟除虫菊酯类农药残留不断积累，对生态环境造成了污染，直接影响了农产品的质量和食品安全。对于环境中的农药残留的解决，可以采用禁用、物化方法和生物修复方法，物化方法工程大、费用高、副作用大、易引起二次污染、而且解决不彻底，生物修复方法具有高效、安全、成本低、无二次污染、应用范围广等优势，主要有动植物修复、微生物修复、根际环境的生物降解。微生物降解是消除农药污染的一种重要手段,它具有成本低、效率高、无二次污染等优点。国内外研究最多的就是利用微生物降解修复环境中的农药残留。迄今，已经筛选到多株氯氰菊酯降解菌。但是，关于利用高效氯氰菊酯降解菌降解烟叶上高效氯氰菊酯的报道则很少见到。

技术实现要素：

本发明第一目的在于提供一种阿氏芽孢杆菌，第二目的在于提供一种以所述阿氏芽孢杆菌作为活性成分的菌剂，第三目的在于提供所述以阿氏芽孢杆菌作为活性成分的菌剂制备方法，第四目的在于提供所述以阿氏芽孢杆菌作为活性成分的菌剂的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104为高效氯氰菊酯降解菌，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2015年12月15日，保藏编号：CGMCC No. 11664；所述阿氏芽孢杆菌属于细菌界，厚壁菌门门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。

——阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104的获得与鉴定

（1）阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104的获得与鉴定

本发明所述的阿氏芽孢杆菌，是从烟草叶片中分离得到。烟叶样品采自云南省玉溪市红塔区，取1g烟叶样品置于250ml锥形瓶中，加入100ml富集培养液，振荡培养(28℃，150rpm)5天，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液中，继续黑暗振荡培养(28℃，150rpm)5天，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培养液。

取最后一次培养所得的培养液少许进行梯度稀释，取稀释后的培养液200μl涂布于含100mg/L高效氯氰菊酯的LB固体平板上，置于恒温培养箱(28℃)中培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于含100mg/L高效氯氰菊酯的LB固体平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体试管中振荡培养(28℃，150rpm)过夜，将培养好的菌液离心后接至富集培养液中培养一周，通过高效液相色谱法(HPLC)检测各富集培养液中高效氯氰菊酯残留量，最后筛选获得一株能降解高效氯氰菊酯的菌株，命名为BC104。

菌株鉴定：

将上述获得的菌株进行生化特征和分子生物学鉴定。该菌株的主要生物学特征为：革兰氏染色反应阴性，菌体短杆状，有鞭毛，无芽孢，大小为(0.6μm～1.2μm)×(1.0μm～2.0μm)，菌落表面平坦湿润，接触酶阳性，氧化酶、磷酸酶、酯酶、半乳糖苷酶等阳性，胰蛋白酶、芳胺酶等阴性，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40，不能利用乙酸盐、柠檬酸盐、山梨醇、鼠李糖，甲基红试验阴性。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为芽孢杆菌属的阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）。

表1 BC104菌株生化特征测定

表1中，“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。

（2）阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104的保藏

通过上述鉴定结果，确认菌株BC104为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)的一个株系，命名为BC104，于2015年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100080），其保藏编号：CGMCC No. 11664。

本发明的第二目的是这样实现的，是以所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104经活化培养、发酵培养后制成的菌剂。

本发明的第三目的是这样实现的，包括活化培养、发酵培养步骤，具体包括：

A、活化培养：将阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104接种到无机盐培养液中，于温度25~35℃、震荡频率100~250rpm的条件下震荡培养12~24h得到液体发酵种子；

B、发酵培养：将液体发酵种子按培养基体积1~10%的量接种入发酵罐，在25~35℃下培养24~48h，搅拌速度为100~300rpm，空气流量为0.1~1.0vvm，得到阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104发酵液；

C、将阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104发酵液离心、弃上清，用10~100倍的PH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮得到目标物阿氏芽孢杆菌为活性成分的菌剂。

本发明的第四目的是这样实现的，所述的菌剂在制备降解高效氯氰菊酯药物中的应用。

本发明菌种对高浓度的高效氯氰菊酯具有一定的降解能力，在纯培养条件下对50mg/L的高效氯氰菊酯的降解率达95.4%，BC104菌剂对烟叶上残留的高效氯氰菊酯降解率为47.3%。该降解菌可通过直接喷雾的方式应用于烟叶表面残留的高效氯氰菊酯的降解，能安全、高效、快速的降解烟叶上残留的高效氯氰菊酯，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。

除非另有说明外，本发明中所采用的百分数均为体积百分数。

附图说明

图1为本发明阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104在LB培养基的菌落特征示意图；

图2为本发明阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104对高效氯氰菊酯的降解曲线示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明所述的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104为高效氯氰菊酯降解菌，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2015年12月15日，保藏编号：CGMCC No. 11664；所述阿氏芽孢杆菌属于细菌界，厚壁菌门门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。

所述的阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104的生物学特征为：革兰氏染色反应阴性，菌体短杆状，有鞭毛，无芽孢，大小为(0.6μm～1.2μm)×(1.0μm～2.0μm)，菌落表面平坦湿润，接触酶阳性，氧化酶、磷酸酶、酯酶、半乳糖苷酶等阳性，胰蛋白酶、芳胺酶等阴性，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40，不能利用乙酸盐、柠檬酸盐、山梨醇、鼠李糖，甲基红试验阴性。

本发明所述的阿氏芽孢杆菌为活性成分的菌剂，是以所述阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104经活化培养、发酵培养后制成的菌剂。

本发明所述的阿氏芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，包括活化培养、发酵培养步骤，具体包括：

A、活化培养：将阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104接种到无机盐培养液中，于温度25~35℃、震荡频率100~250rpm的条件下震荡培养12~24h得到液体发酵种子；

B、发酵培养：将液体发酵种子按培养基体积1~10%的量接种入发酵罐，在25~35℃下培养24~48h，搅拌速度为100~300rpm，空气流量为0.1~1.0vvm，得到阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104发酵液；

C、将阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)BC104发酵液离心、弃上清，用10~100倍的PH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮得到目标物阿氏芽孢杆菌为活性成分的菌剂。

所述的A步骤中无机盐培养液的为NaCl 1g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，(NH4)₂SO₄2.0g，MgSO₄ 0.1g，1ml微量元素溶液，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌后制得，所述的微量元素溶液的配方方法为：1L微量元素溶液按如下组成配制：MnSO₄·H₂O 0.1g，ZnCl₂ 0.2g，CuSO₄·H₂O 0.02g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.1g，用蒸馏水补足至1000ml。

所述的B步骤中所述的培养基为LB液体培养基，是以酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌后制得。

所述的C步骤中离心的转速为5000~7000rpm/min，离心时间为2~4min。

所述的PH值为7.0的磷酸缓冲液是取0.2mol/L的磷酸二氢钠39ml和0.2mol/L的磷酸氢二钠61ml，用超纯水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌后即得。

本发明所述的阿氏芽孢杆菌为活性成分的菌剂的应用为所述的菌剂在制备降解高效氯氰菊酯药物中的应用。

下面以具体实施例对本发明做进一步说明：

实施例1

菌株的筛选与鉴定

培养基：

无机盐培养基：NaCl 1g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，(NH4)₂SO₄2.0g，MgSO₄ 0.1g，1ml微量元素溶液(1L微量元素溶液按如下组成配制：MnSO₄·H₂O 0.1g，ZnCl₂ 0.2g，CuSO₄·H₂O 0.02g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.1g，用蒸馏水补足至1000ml)，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃，30min)后制得。

富集培养液：在无机盐培养液中加入高效氯氰菊酯溶液，使得高效氯氰菊酯浓度为50mg/L。

LB液体培养基：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃，30min)后制得。

LB固体培养基：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃，30min)后制得。

菌株分离纯化：

烟叶样品采自云南省玉溪市红塔区，取1g烟叶样品置于250ml锥形瓶中，加入100ml富集培养液，振荡培养(28℃，150rpm)5天，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液中，继续黑暗振荡培养(28℃，150rpm)5天，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培养液。

取最后一次培养所得的培养液少许进行梯度稀释，取稀释后的培养液200μl涂布于含100mg/L高效氯氰菊酯的LB固体平板上，置于恒温培养箱(28℃)中培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于含100mg/L高效氯氰菊酯的LB固体平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体试管中振荡培养(28℃，150rpm)过夜，将培养好的菌液离心后接至富集培养液中培养一周，通过高效液相色谱法(HPLC)检测各富集培养液中高效氯氰菊酯残留量，最后筛选获得一株能降解高效氯氰菊酯的菌株，命名为BC104。

菌株鉴定：

将上述获得的菌株进行生化特征和分子生物学鉴定。该菌株的主要生物学特征为：革兰氏染色反应阴性，菌体短杆状，有鞭毛，无芽孢，大小为(0.6μm～1.2μm)×(1.0μm～2.0μm)，菌落表面平坦湿润，接触酶阳性，氧化酶、磷酸酶、酯酶、半乳糖苷酶等阳性，胰蛋白酶、芳胺酶等阴性，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40，不能利用乙酸盐、柠檬酸盐、山梨醇、鼠李糖，甲基红试验阴性。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为芽孢杆菌属的阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）。

表1 BC104菌株生化特征测定

表1中，“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。

实施例2

菌剂制备

1、将保藏于液体试管中的菌种接种于无机盐培养液中活化培养2d；

2、将活化好的菌种接种于LB液体培养基中，30℃、150rpm振荡养至对数生长期；

3、将上述处于对数生长期的菌液进行离心3min(6000rpm)，弃上清，菌体用适量的PH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮，此即为菌剂。

pH为7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲液的配方为：取0.2mol/L的磷酸二氢钠39ml和0.2mol/L的磷酸氢二钠61ml，用超纯水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌(121℃、20min)后即得。

实施例3

高效氯氰菊酯液体降解实验

无机盐培养液中高效氯氰菊酯含量的检测：

在20 mL培养基中加20 mL二氯甲烷，剧烈震荡3 min后，静置分层，取有机相经无水Na2SO4脱水，然后准确的取1 mL有机相置于2 mL离心管在通风柜内挥发后，重新定溶到1 mL色谱纯的正己烷中，气相色谱检测。检测条件如下：ECD检测器、SPB-5毛细管柱（30.0 mm×0.530 mm×1.5 µm），进样口温度260℃，柱温240℃，检测器温度300℃，载气为氮气，流速为1 mL/min。

高效氯氰菊酯降解实验

取100ml锥形瓶若干，均加入40ml无机盐培养基，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后加入高效氯氰菊酯溶液，使其浓度均为50mg/L，取适量的高效氯氰菊酯降解菌菌种接种于此无机盐培养基中，相应的配置不含该菌种的作为空白对照，然后一同置于摇床(30℃，200rpm)中黑暗振荡培养。试验组与对照组均为15个重复，在培养时间为0、1、3、4、5d时定时取样，随机抽取三瓶，根据上述方法检测无机盐培养基中高效氯氰菊酯的残留量。

本发明菌株在纯培养条件下对不同浓度的高效氯氰菊酯的降解曲线如图2所示。观察图2，可以发现，培养4d后，本发明高效氯氰菊酯降解菌对50mg/L的高效氯氰菊酯的降解率为95.4％，所有未加菌的空白对照5d后的水解率均小于10％。

实施例4

烟叶上高效氯氰菊酯降解实验

菌体制备同实施例2。

烟草在田间旺长期喷施高效氯氰菊酯，喷施量为100克/亩。施药后7d 喷施BC104菌剂，以清水为对照，菌剂喷施7天后去烟叶样品进行高效氯氰菊酯残留量的测定。取烟叶20g，通过二氯甲烷提取，其他测定方法同实例3的方法。

对照的高效氯氰菊酯残留量为1.459μg/g，喷施BC104菌剂处理的高效氯氰菊酯残留量为0.769μg/g，BC104菌剂对烟叶上残留的高效氯氰菊酯降解率为47.3%。

实验结果表明该菌种对烟叶上残留的高效氯氰菊酯具有较高的降解能力，因此，该菌对烟叶上高效氯氰菊酯的降解具有一定的积极意义。