一种铁载体高产菌制剂及其在污染土壤重金属修复方面的应用的制作方法

本发明属于环境污染生物修复领域，具体为一种铁载体高产菌制剂及其在污染土壤重金属修复方面的应用。

背景技术：

土壤的重金属污染现已成为全球性环境问题，备受社会和民众关注，亟待解决。我国许多地区(尤其是华东地区)土壤呈不同程度的重金属污染，许多地区粮食、蔬菜、水果中镉、砷、铜、铅、锌等重金属含量超标或接近临界值，严重危害人民群众健康。

土壤重金属污染治理迫在眉睫却又困难重重，主要原因在于重金属并不像有机污染物那样能够被生物降解，且重金属在土壤中迁移性差。传统的物理、化学方法如客土、淋洗、离子交换等往往只适合小规模重度污染的土壤治理，且因其成本高、破坏土壤结构，以及易引发二次污染等缺点而饱受诟病。与之相比，生物修复因具有成本低、效果好、简单易行和无二次污染等优点而备受青睐。其中，微生物—植物联合修复作为生物修复的一种，因其可以有效降低土壤中重金属的毒性，吸附重金属并改变根际微环境，进而提高植物对重金属的吸收或固定效率，且实施成本相对低廉、环境友好，以及可大规模原位修复等优点而备受欢迎，是近年来大力发展、推行的用于治理大面积土壤重金属污染的新技术。然而，上述联合修复技术的效率取决于修复植物的生物量，以及土壤中重金属的生物可利用性。换言之，植物生物量越大且能够尽量多地从土壤中吸收重金属，那么修复效率就越高，效果也就越好。如何提高植物修复效率成为了研究与关注的热点。超积累植物(如芸苔属、庭芥属和遏蓝菜属)通常生物量较低且难以大规模种植，因而其在实际修复中的应用十分有限。而一些生长快速、生物量大且具有重金属富集能力的植物正越来越多地应用于重金属污染场地修复。作为一种可用于生产生物乙醇的能源作物，甜高粱具有耐压能力强、生长迅速、生物量大等优点，成为了目前最具竞争力的重金属修复植物。

铁载体(Siderophore)是微生物产生的一种对铁具有超强络合力的有机化合物，其功能是向微生物细胞提供铁素养分，尤其是在低铁环境下。铁载体与重金属的结合主要体现在铁载体的生物学功能上，即在浓缩环境中的铁并促进其转运进入细胞的同时，铁载体还能通过络合作用影响其它金属的生物可利用性，从而降低其毒性。此外，微生物铁载体还能够通过抑制病原微生物的生长而提升植物根系的抗病能力。铁载体产生菌因其具有上述优点、特质，故而成为了微生物—植物联合修复重金属污染体系中微生物部分的热门候选。

目前，通过人工富集、筛选等技术，已有不少铁载体产生菌从环境中分离出，并实现了纯培养。然而，已报道的这些菌株中，铁载体高产菌株有限；兼具多种优点、特质(如多重重金属抗性和病原真菌结抗性)的菌株匮乏；具备切实强化植物吸收土壤中重金属能力的菌株寥寥无几。因而，寻找并获取性状优异的铁载体高产菌株成为了该研究领域的热点和焦点。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种铁载体高产菌制剂。

本发明的另一个目的是提供上述铁载体高产菌制剂在农田污染土壤重金属修复方面的应用，该应用主要是强化甜高粱修复典型重金属污染土壤。

本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的：

本发明所涉及的高产铁载体菌Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86源自浙江省杭州市浙江科技学院内试验田土壤，经人工富集培养、压力筛选和分离纯化得到。S17菌株为假单胞菌属细菌，革兰氏染色阴性，接触酶阳性，氧化酶阴性，V.P.试验阴性，吲哚试验阳性，菌体形态为短杆状，菌落呈淡黄色、圆形、边缘略显毛刺、光滑湿润，其它生理生化特征如表1所示，该菌株于2016年10月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No.13104。

一株铁载体高产菌，该菌是芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)的菌株S86，该菌株于2016年10月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No.13105，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(下同)。S86菌株为芽孢杆菌属细菌，革兰氏染色阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性，V.P.试验阳性，吲哚试验阴性，菌体形态为杆状，菌落呈白色、圆形、蜡质，其它生理生化特征如表2所示。

表1、菌株S17的生理生化特征

注：“+”表示生长或阳性反应；“-”表示不生长或阴性反应(下同)。

表2、菌株S86的生理生化特征

S17菌株的最适生长温度为29℃。以五分之一LB(Luria-Bertani)或工业发酵培养基(玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 6g/L，玉米浆6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MnSO₄ 0.05g/L，pH 7.0)培养24小时后，菌液菌体浓度可达6.5-9.2×10⁹CFU/mL(CFU，菌落形成单位)。该菌对氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、卡那霉素和四环素敏感(皆为寻常抗生素)。可以认为：当菌体被释放到自然环境中时，不会因抗(耐)药性问题而产生超级细菌。在病原菌拮抗测试中，发现该菌株可抑制青霉、黑曲霉和油菜菌核病三种病原真菌生长。该菌对12种测试金属离子(Li⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺和Co⁴⁺)呈现不同程度的耐受性(或抗性)。鉴于我国重金属污染土壤现状——多种重金属污染并存，可以认为——该菌株较其它不具多种重金属耐受性或抗性的菌株而言，在实施强化修复过程中修复效果受重金属抑制影响小。该菌株铁载体活性单位(Siderophore unit，SU)为99.2％，达产铁载体菌最高级，是国内已报道产铁载体菌中，产铁载体能力最强的菌株。此外，S17还具备一定的溶磷和产3-吲哚乙酸的能力。以1.5％葡萄糖为碳源，0.2％氯化铵为氮源，30℃，pH7.2，培养时间66h(初始接种量为2％)，该菌溶磷量为120.35mg/L。向含有L-色氨酸(200mg/L)的通用LB液体培养基中接入该菌(接种量为1％)，28℃、160r/min培养3天，随后测定发酵液中的3-吲哚乙酸含量，测定值为72.36mg/L。

S86菌株的最适生长温度为28℃。以五分之一LB或工业发酵培养基培养24小时后，菌液菌体浓度可达6.1-8.6×10⁹CFU/mL。该菌对氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、卡那霉素和四环素敏感或高度敏感。可以认为：当菌体被释放到自然环境中时，不会因抗(耐)药性问题而产生超级细菌。在病原菌拮抗测试中，发现该菌株可抑制番茄灰霉病、番茄早疫病、茄子枯萎病、棉花枯萎病、油菜菌核病和甜瓜蔓枯病病原真菌生长。该菌对12种测试金属离子(Li⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺和Co⁴⁺)呈现不同程度的耐受性(或抗性)。可以认为——该菌株较其它不具多种重金属耐受性或抗性的菌株而言，在实施强化修复过程中修复效果受重金属抑制影响小。该菌株SU值为76.4％，属于强铁载体产生菌。此外，当S86菌株和S17菌株在五分之一LB或工业发酵培养基中29℃，pH7.3，150r/min共同培养24时后(S86和S17初始接种量为各自单独接种培养时的一半)，发现菌悬液菌体密度(7.4-10.6×10⁹CFU/mL)要明显高于各自单独培养时的菌悬液菌体密度。

一种所述的铁载体高产菌在农田污染土壤重金属修复方面的应用。

作为优选，该应用是强化甜高粱修复重金属污染土壤，方法为在生长期的甜高粱的根部喷洒含有所述的铁载体高产菌的菌液，菌液的浓度为1-5×10⁸CFU/mL。

作为优选，所述的菌液为对数期的铁载体高产菌菌液。

作为优选，所述的菌液是由五分之一LB(Luria-Bertani)或工业发酵培养基培养22-24小时后得到，工业发酵培养基的配方为：玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 6g/L，玉米浆6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MnSO₄ 0.05g/L。

作为优选，所述的液体培养温度为25-30℃，基础无机盐液体培养基的pH为6.8-7.2。

作为优选，所述的液体培养温度为28℃，基础无机盐液体培养基的pH为7.0。

一种铁载体高产菌制剂，所述的铁载体高产菌制剂中含有芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)S86或假单胞菌属细菌(Pseudomonas sp.)S17中的一种或其组合。

作为优选，所述的制剂是由五分之一LB(Luria-Bertani)或工业发酵培养基接种菌种培养22-24小时后得到，工业发酵培养基的配方为：玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 6g/L，玉米浆6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MnSO₄ 0.05g/L。进一步的，所述的制剂发酵培养的温度为29±1℃，pH7.2-7.4。

一种所述的铁载体高产菌制剂在农田污染土壤重金属修复方面的应用。

作为优选，该应用是强化甜高粱修复重金属污染土壤，方法为在生长期的甜高粱的根部喷洒含有所述的铁载体高产菌制剂，铁载体高产菌制剂中菌体的总浓度为1-5×10⁸CFU/mL。

综上所述，本发明同现有技术相比具有如下优点：

本发明的Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86菌株均为强铁载体产生菌。其中，Pseudomonas sp.S17菌株已达产铁载体能力最高级，产铁载体能力为国内已报到菌株中最强。S17和S86菌株对常用抗生素敏感，对12种重金属呈现不同程度耐受性或抗性，并兼具病原真菌结抗性。而将二者共同培养时，发现其菌体密度要显著高于相同条件下各自单培养的菌体密度，存在互补增生效应。此外，S17菌株还具备溶磷能力和产3-吲哚乙酸能力。上述的这些优点和特点对微生物—植物联合修复重金属污染土地而言，意义重大！使得这一修复体系能够更为实际、更为高效地应用于污染场地修复。

具体实施方式

以下结合具体实施例来对本发明作进一步说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1：Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的分离与铁载体产生能力测试

以通用五点采样法现场采集浙江省杭州市浙江科技学院内试验田土壤100g，用无菌信封盛装，并迅速带回实验室。

通用CAS检测液和MSA液体培养基根据陈绍兴等报道(陈绍兴，赵翔，沈萍，等.高灵敏假单胞菌铁载体的平板检测方法.微生物学通报，2006，33：122-127)配制。固体检测平板则是在MSA液体培养基中加入5％的CAS检测液和2％的琼脂粉凝固而成。

将土壤样品用10倍递减法稀释，涂布于五分之一LB固体平板(即所有营养成分为通用LB培养基的1/5)上。25℃培养，出现菌落后，将不同形态的菌落逐一以无菌牙签挑出、转接到新的五分之一LB固体平板上，直至纯化成单菌落。所有纯菌株依次编号，并进行常规菌种保藏，以斜面的形式存放于4℃冰箱之中。

将上述纯化菌株，逐一转接至固体检测平板上，28℃倒置培养2天。观察菌落周围是否产生变色圈，并做详细记录，以变色圈的直径大小作为产铁载体菌产铁载体能力强弱的初步判定。此外，须同时设置Escherichia coli DH5α菌株为阴性对照。

铁载体定量测定依照陈绍兴等报道(陈绍兴，赵翔，沈萍，等.高灵敏假单胞菌铁载体的平板检测方法.微生物学通报，2006，33：122-127)进行，将各自供试菌株培养液以1％的量接入到30mL MSA液体培养基，28℃，200r/min培养24h，10000r/min离心15min，上清液用0.22微米的微孔滤膜过滤，并与等体积CAS检测液混合均匀。室温条件下，放置充分后测定各样品的OD₆₈₀(As)值，以双蒸水作对照调零。相同方法测定以未接菌的各液体培养基作为上清液的吸光值，以此为参比值(Ar)。铁载体的浓度用铁载体活性单位表示，每处理重复4次。随后，依据Persmark等人的报道(Persmark M,Expert D,Neilands JB.Isolation,characterization,and synthesis of chrysobactin,a compound with siderophore activity from Erwinia chrysanthemi.The Journal of Biological Chemistry,1989,264:3187-3193)对各菌株产铁载体能力进行分级。

结果，在五分之一LB固体平板上共计获得可培养菌株126株，其中9株具备铁载体产生能力(参见表3)。在具备铁载体产生能力的菌株中，又以S17菌株的能力最强，S86菌株次之。

表3、铁载体产生菌产铁载体能力记录表

实施例2：Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的抗生素敏感性试验与病原真菌拮抗能力测试

抗生素敏感试验采用滤纸片法，选择氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素和链霉素五种常用抗生素，以各个抗生素滤纸片在培养铁载体产生菌S17和S86平板上的抑菌圈直径大小，作为敏感或者耐(抗)药的判定标准。表4和表5给出的试验结果表明，菌株S17和S86对上述供试抗生素均呈不同程度敏感反应。

表4、菌株S17的抗生素敏感性试验结果

注：抑菌圈直径大于中度敏感范围上限值的为高度敏感，小于敏感范围下限值的为抗性(下同)。

表5、菌株S86的抗生素敏感性试验结果

本实施例说明当Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86菌体被释放到自然环境中时，不会因抗(耐)药性问题而成为超级细菌，这就为其后续实际应用提供了安全保证。

以10种病原菌——番茄灰霉病病菌、番茄早疫病病菌、茄子枯萎病病菌、甜瓜蔓枯病病菌、油菜菌核病病菌、青霉、棉花枯萎病病菌、黑曲霉、小麦纹枯病病菌和小麦叶枯病病菌为指示菌，利用平板对峙法测定S17和S86的病菌真菌拮抗能力。在通用PDA平板中央接种指示菌，四周分别接种S17和S86，每组试验重复5次，通过菌落半径和抑菌带宽度明确菌株S17和S86的拮抗能力。

结果如表6所示，Pseudomonas sp.S17对供试的青霉、黑曲霉和油菜菌核病病菌呈明显拮抗性，Bacillus sp.S86则对番茄灰霉病、番茄早疫病、茄子枯萎病、棉花枯萎病、油菜菌核病和甜瓜蔓枯病病菌呈不同程度结抗性。

表6、Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的拮抗能力测试

注：阴性记为“-”；抑菌圈直径0-5mm记为“+”；抑菌圈直径5-10mm记为“++”；抑菌圈直径10-15mm记为“+++”；抑菌圈直径大于15mm的记为“++++”。

实施例3：Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的重金属最小抑制浓度(MIC)测试

MIC试验设计参照Filali等人的研究进行(Filali BK，Taoufik J，Zeroual Y，Dzairi FZ，Talbi M，Blaghen M.Waste water bacterial isolates resistant to heavy metals and antibiotics.Current Microbiology，2000，41：151-156)，分别挑取等大、经活化处理的S17和S86单菌落于培养试管中，30℃，160r/min振荡培养32小时。依菌体长势判定MIC值，每组设3个重复，分别测试菌株对12种金属离子的耐受情况。结果如表7所示，供试菌株具多重重金属耐受(抗)性，性状优异。

表7、MIC测试结果

注：表中数据为3个测定值的平均值。

实施例4：Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86的溶磷与产3-吲哚乙酸能力测试

用接种环分别从试管斜面上取一环Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86，分别接种于盛有50mL液体LB培养基的三角瓶中，160r/min振荡培养24h，然后各自取1mL(约1×10⁸CFU)培养物，分别接种到以Ca₃(PO₄)₂为唯一磷源的100mL无机磷发酵培养基【葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 1g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.002g，MnSO₄·H₂O 0.002g，Ca₃(PO₄)₂ 5g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.5】中，30℃振荡培养(160r/min)48h，设置3个重复。运用通用钼锑抗比色法测定磷含量——各自取1mL培养液于相应编号的离心管中，5000r/min离心10min。准确取1mL上清于相应编号的25mL容量瓶中，再加入2.5mL钼锑抗显示剂，然后用蒸馏水定容。在室温下反应30min后，使用分光光度计测定700nm波长处吸光值，用mg P₂O₅/L来表示。以不接菌的处理为空白对照，实验设3个重复。结果，测得Pseudomonas sp.S17溶磷量为88.6±2.26mg/L，Bacillus sp.S86不具溶磷能力。

向含有L-色氨酸(200mg/L)的LB液体培养基中分别接入Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86，28℃、160r/min培养3天。随后以分光光度法测定各自菌悬液的OD₆₀₀值，然后将菌悬液10000r/min离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液(Libbert E and Risch H.Interactions between plants and epiphytic bacteria regarding their auxin metabolism[J].Physiologia Plantarum，1969，22：51–58)，避光静置30min使其显色，测定OD₅₃₀值。计算单位体积菌液中3-吲哚乙酸的含量，设置3个重复，并以不产3-吲哚乙酸的E.coli DH5α为阴性对照。结果，测得S17菌株3-吲哚乙酸得率为62.8±0.86mg/L，S86菌株和阴性对照均未检测到3-吲哚乙酸。

人们在以往重金属污染场地修复过程中发现——不少修复植株会因营养匮乏(特别是缺少磷元素)、吸收受限，以及生长受抑制等原因无法最大程度地发挥修复吸收作用。本实施例表明，Pseudomonas sp.S17具备溶磷和产3-吲哚乙酸的能力，而这对强化植株存活、生长及其修复效用而言是非常实际且重要的。实施例5：Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86共同强化甜高粱吸收重金属的应用

一种铁载体高产菌制剂，该制剂由A和B两种菌液复配获得。

A菌液：以Pseudomonas sp.S17为初始接种物，29℃，工业发酵培养基(玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 6g/L，玉米浆6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MnSO₄0.05g/L，pH 7.2)发酵培养24小时制得。

B菌液：以Bacillus sp.S86为初始接种物，28℃，工业发酵培养基(玉米粉10g/L，豆粕粉8g/L，(NH₄)₂SO₄ 6g/L，玉米浆6g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄·3H₂O 2g/L，MnSO₄0.05g/L，pH 7.5)发酵培养24小时制得。

复配前，A和B两种菌液分别以无菌水或自来水各自调节菌体浓度至1.0×10⁸CFU/mL。然后，按照V_A:V_B＝1:1(体积比)比例(即等体积比)进行复配，即得铁载体高产菌制剂。

试验所用土壤采自未受重金属污染的菜园，其主要理化性质如下：有机质4.84％，总氮832.6mg/kg，总磷292.1mg/kg，总钾220.3mg/kg，速效氮68.2mg/kg，速效磷18.1mg/kg，速效钾58.3mg/kg，pH6.2。重金属含量为镉0.21mg/kg，铜58mg/kg，锌101mg/kg。风干过筛后，分别加入不同含量的溶液态氯化镉、氯化锌和硫酸铜，使土壤中Cd²⁺的浓度为25mg/kg，Zn²⁺的浓度为800mg/kg，Cu²⁺的浓度为800mg/kg。充分混匀污染土壤，60％湿度条件下稳定2个月后测试。

修复植物甜高粱的种子购于临安市江桥路门市。种子先萌芽，待幼苗长至10cm左右时，挑选长势一致的幼苗移栽入1.5kg先前稳定好的重金属污染土壤塑料盆(高13cm，直径17cm)中，每盆1颗。移栽7天后，待植株生长正常，在各自植株的根部接入1mL新鲜配置，且摇匀的铁载体高产菌制剂。

为避免培养基中的营养成分影响测试结果，上述接入菌液为经无菌水洗涤3遍后，以无菌水重新悬浮的菌液。试验设4个处理：未种植物且未加菌的空白对照(C)、只种植物不接菌(P)、不种植物但加菌(M)，以及既种植物也加菌(PM)，每个处理设5个平行样。定期浇水，保持每天8h的光照，甜高粱在温室下生长82天后收获，根系洗净后用10mmol的EDTA溶液浸泡30min，再用去离子水冲洗2遍。植株在105℃杀青后80℃烘至恒重，称取根、地上部的干重。植物组织消解(HClO₄∶HNO₃＝1∶4)后，测定其重金属含量，全程序做空白对照以消除干扰。

结果如表8所示，接入Pseudomonas sp.S17和Bacillus sp.S86能够显著提高甜高粱的生物量和重金属吸收量。其中，地上部和根部的干重比未接菌的对照分别增加了31.8％和36.0％(PM处理与P处理相比)，而甜高粱地上部Cd²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺的总含量分别提高了87.5％、87.3％和88.4％。证实S17和S86复配菌剂具备促进甜高粱生长、强化甜高粱吸收供试重金属的能力。

表8、甜高粱地上部与根部的重金属吸收量

注：重金属含量＝生物量×重金属浓度；提取效率为植株提取的重金属总量(根部与地上部之和)与初始土壤中重金属总含量之比；*表示该值与相应的对照值存在显著差异(P<0.05)。

同最接近的现有技术相比(张璐.产铁载体细菌强化甜高粱修复土壤重金属污染.环境科学与技术，2014，37：74-79)，本发明“植物+微生物”处理的地上部干重，地上部Cd²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺的总含量，及各自提取效率较其分别提升了9.4％，25.8％、22.2％和31.9％，及24.5％、22.2％和28.6％，效果更佳，优势显著。而在提取率提升方面(PM处理提取率/P处理提取率)，本发明三种重金属提取率提升效果较其分别提升了56.5％、123.5％和44.0％，优势显著。此外，需要指明的是，Pseudomonas sp.S17同上述张璐研究中的Pseudomonas sp.T07不是同一种菌。因为，其在生理生化特征方面有着明显区别(参见表1)，具体表现在接触酶、氧化酶、葡萄糖利用能力和甲基红试验四个测试项目上。