本发明属于微生物及生物能源技术领域，具体涉及一种用于浒苔发酵制备沼气的耐盐微生物菌群获得方法及其应用。
背景技术：
浒苔（Enteromorpha）是绿藻纲、石莼科的一种大型绿藻，常见种类包括肠浒苔、扁浒苔、缘管浒苔、条浒苔等。浒苔具有顽强的生命力、较高的环境适应性、较快的繁殖速度，因此，它的大量滋生会对同海域中其它藻类的生长造成很强的抑制作用。近年来，由于海洋环境污染加剧、海水的富营养化，导致了浒苔的恶性繁殖。同时，浒苔漂浮至海岸腐烂发臭不仅对环境造成了极大危害，而且威胁了沿海渔业及旅游业的发展。绿藻浒苔的爆发引起了社会的广泛关注，但绿藻浒苔约含蛋白质9%-24%，脂肪0.9%-2%，粗纤维8%-18%，可以作为生产沼气的原料。
沼气属于二次能源，是可再生能源的一种，是有机质经过微生物厌氧发酵后产生的可燃性的混合气体。沼气的主要成分是甲烷（45~70%）和二氧化碳（25~55%），也含有一些少量的其它气体，如一氧化碳、硫化氢、氢气、氮气等。沼气发酵能降低原料中有机物的含量，降低环境污染。发酵结束后的沼渣可再次循环用于生产有机饲料及肥料。沼气的低热值为20-25MJ/m3，每立方米沼气完全燃烧后可以产生0.7千克无烟煤的热量。目前，世界各国已经开始将沼气用作燃料和用于照明，用沼气代替汽油、柴油发动机器的效果也很好。
在现有技术中，不乏使用微生物发酵浒苔生产沼气的报道。如《不同预处理和发酵条件对浒苔沼气产率的影响》、《颗粒大小和几种预处理方法对浒苔厌氧发酵产沼气的影响》等文章对浒苔厌氧发酵生产沼气做了报道，结果表明浒苔有良好的产气潜力。专利CN 101418315A、CN 102876727A、CN 104642530A提供了多种以浒苔为原料生产沼气的方法，但这些方法需要使用清水脱去浒苔中的盐分或者以淡水配制发酵液，这是由于浒苔属于海洋中的藻类，收获后的浒苔携带大量海盐，而以往的技术中使用的发酵菌群则通常是从湖泊污泥、温泉淤泥、动物粪便中富集获得，对海盐耐受能力不足，导致了利用浒苔发酵生产沼气难以实现产业化生产。可见，为解决目前浒苔发酵生产沼气的工艺无法达到理想效果的问题，其亟待解决的问题是如何获得一个具有耐盐、高效的浒苔降解菌群。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高效、耐盐的微生物菌群的获得方法，并通过该菌群实现高效、稳定的浒苔降解与沼气生产。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于浒苔发酵制备沼气的微生物菌群获得方法，包括以下步骤：
（1）收集潮间带滩涂地表深度5-10 cm处的黑色泥沙及海水；
（2）将收集的泥沙及海水按质量体积比1-5 g/100 mL加入厌氧发酵罐中，加入未清洗盐分的浒苔，浒苔加入量为0.5-2 g/100 mL，然后调节体系pH值为7.0-7.5、盐度为10‰-20‰，密封后于25~40℃下发酵15-30天进行菌群驯化，发酵结束后使用2-4层无菌纱布过滤，分离发酵液及沼渣；
（3）将未清洗盐分的浒苔加入所得发酵液中，使发酵罐中总固形物含量为0.5-5%，并按沼渣与发酵液的质量体积比为1-3 g/100 mL加入所得沼渣，调节体系pH值为6.8-7.8、盐度为10-20‰，于25~40℃下发酵15-30天，发酵结束后使用2-4层无菌纱布过滤，再次分离发酵液及沼渣；
（4）重复步骤（3）3-5次后，所得滤液即为含耐盐微生物菌群ST.EP的菌液。
对所得菌群ST.EP中的古菌进行鉴定，结果表明，其包括如下主要微生物：产甲烷袋菌属（Methanofollis），鬃毛甲烷菌属（Methanosaeta），甲烷盘菌属（Methanoplanus），甲烷囊菌属（Methanoculleus），甲烷八叠球菌属（Methanosarcina），甲烷螺菌属（Methanospirillum），甲烷裂叶菌属（Methanolacinia），甲烷绳菌属（Methanolinea），热裸单胞菌属（Thermogymnomonas），甲烷食甲基菌属（Methanomethylovorans），甲烷热杆菌属（Methanothermobacter），产甲烷菌属（Methanogenium），甲烷微菌属（Methanosphaerula）；
对所得菌群ST.EP中的细菌进行鉴定，结果表明，其包括如下主要微生物：热球菌属（Thermococcoides），海洋袍菌属（Oceanotoga），螺旋菌属（Sphaerochaeta），Kosmotoga属，氨基杆菌属（Aminobacterium），氨基单胞菌属（Aminomonas），互营单胞菌属（Syntrophomonas），糖发酵菌属（Saccharofermentans），厌氧棒菌属（Anaerobaculum），梭菌属（Clostridium sensu strict），脱硫弧菌属（Desulfovibrio），红树林杆菌属（Mangroviflexus）以及拟杆菌门未分类细菌（Bacteroidetes）。
所得微生物菌群可用于浒苔发酵制备沼气；其操作步骤为：将所得菌液加入发酵罐中，其加入量为发酵罐体积的40-80%，然后向发酵罐中加入未清洗盐分的浒苔，其加入量为1-10g/100mL，同时调节体系盐度在10-35‰之间，体系初始pH值在6.8-7.8之间；将发酵罐中的空气排出进行厌氧发酵，发酵温度为25-40℃，批式发酵时间为15-30天，连续式发酵应在日产气量低于日均产气量的20%时重新加料；发酵过程中维持pH值在6.5-8.0之间。
所述浒苔包括新鲜浒苔以及干燥浒苔，品种包含肠浒苔（Enteromorpha intestinalis），扁浒苔（E. compressa），缘管浒苔（E. linza），条浒苔（E. clathrat）中的一种或几种；使用前将浒苔用闸刀、粉碎机等进行组织破碎后更有利于发酵的进行。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明所得菌群的耐盐性高，可简化浒苔发酵的前处理步骤，能达到节水节能的效果；
（2）本发明菌群获得方法简单，经驯化后的耐盐菌群稳定性及降解效率高；
（3）经长期应用实践结果表明，利用本发明菌群降解浒苔，其平均降解率大于75%，15d的积累产沼气量达250-300 mL/g，甲烷浓度可达55-65%。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
一种用于浒苔发酵制备沼气的微生物菌群获得方法，包括以下步骤：
（1）收集福建省平潭县龙凤头海滨浴场潮间带（119.80°E，25.50°N）滩涂地表深度5-10 cm处的黑色泥沙及海水；
（2）将收集的泥沙及海水按质量体积比1-5:100（g/mL）加入厌氧发酵罐中，并加入未清洗盐分的浒苔作为基质，浒苔加入量为0.5-2 g/100 mL；然后调节体系pH值为7.0-7.5、盐度为10‰-20‰，密封后于25~40℃下发酵15-30天进行菌群驯化，发酵结束后使用2-4层无菌纱布过滤得发酵液及沼渣；
（3）将未清洗盐分的浒苔加入所得发酵液中，使发酵罐中总固形物含量为0.5-5%，并按沼渣与发酵液的质量体积比为1-3:100（g/mL）加入所得沼渣，调节体系pH值为6.8-7.8、盐度为10-20‰，于25~40℃下发酵15-30天，发酵结束后使用2-4层无菌纱布过滤，再次分离发酵液及沼渣；
（4）重复步骤（3）3-5次后，所得滤液即为菌群ST.EP的菌液。
对所得菌群ST.EP中的古菌进行鉴定，结果表明，其包含的主要微生物及丰度如下：产甲烷袋菌属（Methanofollis）（50.15%），鬃毛甲烷菌属（Methanosaeta）（24.58%），甲烷盘菌属（Methanoplanus）（17.59%），甲烷囊菌属（Methanoculleus）（2.19%），甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）（1.35%），甲烷螺菌属（Methanospirillum）（1.14%），甲烷裂叶菌属（Methanolacinia）（0.55%），甲烷绳菌属（Methanolinea）（0.44%），热裸单胞菌属（Thermogymnomonas）（0.42%），甲烷食甲基菌属（Methanomethylovorans）（0.24%），甲烷热杆菌属（Methanothermobacter）（0.07%），产甲烷菌属（Methanogenium）（0.03%），甲烷微菌属（Methanosphaerula）（0.01%）以及1.23%的未分类古菌；
对所得菌群ST.EP中的细菌进行鉴定，结果表明，其包含的主要微生物及丰度如下：热球菌属（Thermococcoides）（9.59%），海洋袍菌属（Oceanotoga）（8.42%），螺旋菌属（Sphaerochaeta）（5.85%），Kosmotoga属（4.43%），氨基杆菌属（Aminobacterium）（3.49%），氨基单胞菌属（Aminomonas）（3.12%），互营单胞菌属（Syntrophomonas）（3.01%），糖发酵菌属（Saccharofermentans）（2.35%），厌氧棒菌属（Anaerobaculum）（2.31%），梭菌属（Clostridium sensu strict）（2.08%），脱硫弧菌属（Desulfovibrio）（1.79%），红树林杆菌属（Mangroviflexus）（1.43%）以及32.91%的未分类细菌，这些未分类细菌属于拟杆菌门（Bacteroidetes）。
所述浒苔包括新鲜浒苔以及干燥浒苔，品种包含肠浒苔（E. intestinalis），扁浒苔（E. compressa），缘管浒苔（E. linza），条浒苔（E. clathrat）中的一种或几种；使用前将浒苔用闸刀、粉碎机等进行组织破碎后更有利于发酵的进行。
上述步骤中，调节pH值的试剂包括盐酸、氢氧化钙、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠中的一种或几种，检测仪器使用酸度计。
上述步骤中，调节盐度的试剂包括淡水、海水、氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、硫酸铵、碳酸氢钠、氯化钙、氯化钾、磷酸二氢钾、溴化钠、氯化锶、柠檬酸铁铵中的一种或几种，检测仪器使用盐度计。
实施例1
将所得菌液加入发酵罐中，其加入量为发酵罐体积的40%，然后向发酵罐中加入未清洗盐分的浒苔，其加入量为1g/100mL，同时调节体系盐度为10‰，体系初始pH值在6.8；将发酵罐中的空气排出进行厌氧发酵，发酵温度为25℃，批式发酵30天，发酵过程中维持pH值在6.5-7.0之间。发酵结束后，浒苔的降解率为79%，产气量为263mL/g，甲烷浓度为59%。
实施例2
将所得菌液加入发酵罐中，其加入量为发酵罐体积的80%，然后向发酵罐中加入未清洗盐分的浒苔，其加入量为10g/100mL，同时调节体系盐度为35‰，体系初始pH值在7.8；将发酵罐中的空气排出进行厌氧发酵，发酵温度为40℃，批式发酵15天，发酵过程中维持pH值在7.5-8.0之间。发酵结束后，浒苔的降解率为75%，产气量为258 mL/g，甲烷浓度为56.5%。
实施例3
将所得菌液加入发酵罐中，其加入量为发酵罐体积的60%，然后向发酵罐中加入未清洗盐分的浒苔，其加入量为5g/100mL，同时调节体系盐度为20‰，体系初始pH值在7.2；将发酵罐中的空气排出进行厌氧发酵，发酵温度为30℃，连续式发酵应在日产气量低于日均产气量的20%时重新加料；发酵过程中维持pH值在6.8-7.5之间。发酵结束后，浒苔的降解率为78%，产气量为277 mL/g，甲烷浓度为62.5%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。