一种克雷氏肺炎杆菌及其菌剂和制备方法与应用与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种克雷氏肺炎杆菌及其菌剂和制备方法与应用。

背景技术：

福美双是植物真菌病病害防治中的常用农药，化学名称是四甲基硫代过氧化二碳酸二酰胺，又经常被称为秋兰姆，赛欧散等。英文名：tetramethylthiuram disulfide；Thiram。白色或灰白色、有特殊气味、结晶粉末。密度略大于水。不溶于水，不溶于稀碱液、汽油，溶于乙醇、苯、氯仿、二硫化碳等。福美双和代森锰锌经常作为两种有效成分来制作成复配型杀菌剂，属低毒杀菌剂，对皮肤和粘膜有刺激作用。可以治疗疫病等真菌类病害，广泛用作植物杀菌剂，对多种作物的霜霉病、疫病、炭疽病、禾谷类黑穗病、苗期黄枯病有较好的防治，在烟草上福美双是常用的真菌病害防治药剂。由于长期大量地应用，烟叶中福美双的检出率越来越高。由于福美双及其衍生物具有致癌性、致突变性和致畸性，以及急性毒性和亚致死作用，目前已引起人们的极大关注。生物降解是对福美双污染烟叶进行降解的重要途径之一。对于福美双残留，国内外进行了福美双降解微生物的筛选工作。到目前为止，已分离出多个具有福美双降解能力的菌株，如假单胞菌属、分枝杆菌属、芽孢杆菌属等，但是未见肺炎杆菌用于福美双降解中的报道。

技术实现要素：

本发明第一目的在于提供一种克雷氏肺炎杆菌，第二目的在于提供一种以所述克雷氏肺炎杆菌作为活性成分的菌剂，第三目的在于提供所述以克雷氏肺炎杆菌作为活性成分的菌剂制备方法，第四目的在于提供所述以克雷氏肺炎杆菌作为活性成分的菌剂的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的克雷氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)FM84为福美双降解菌，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2015年12月15日，保藏编号：CGMCC No. 11663；所述克雷氏肺炎杆菌属于细菌界，变形菌门，γ-变形菌纲，肠杆菌目，肠杆菌科，克雷伯氏菌属。

——克雷氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)FM84的获得与鉴定

（1）克雷氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)FM84的获得与鉴定

本发明所述的克雷氏肺炎杆菌，是从烟草叶片中分离得到。

菌株获得：

LB液体培养基：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃，30min)后制得。

LB固体培养基：在LB液体培养基配方中添加琼脂15.0g。

烟叶样品采自云南省玉溪市红塔区，取1g烟叶样品置于250ml锥形瓶中，加入100ml LB液体培养基和终浓度为100mg/L的福美双，振荡培养(28℃，150rpm)5天，取培养液进行梯度稀释，取稀释后的培养液200μl涂布于含100mg/L福美双的LB固体平板上，置于恒温培养箱(28℃)中培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于含100mg/L福美双的LB固体平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至终浓度为100mg/L福美双的LB液体试管中振荡培养(28℃，150rpm)过夜，将培养好的菌液离心后接至富集培养液中培养一周，通过高效液相色谱法(HPLC)检测各富集培养液中福美双残留量，最后筛选获得一株能降解高效氯氰菊酯的菌株，命名为FM84。

菌株鉴定：

将上述获得的菌株进行生化特征和分子生物学鉴定。该菌株的主要生物学特征为：菌体无芽孢和鞭毛，革兰氏阴性，在LB固体培养基上为乳白色，不透明，有荚膜，粘韧度不等，近圆形，边缘整齐。生化测定结果见表1。菌株可在25～35℃，pH值7.0～9.0培养条件下较好生长。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为肺炎杆菌属的克雷氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）。

表1 FM84菌株生化特征测定

表1中，“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。

（2）克雷氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)FM84的保藏

通过上述鉴定结果，确认菌株FM84为克雷氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)的一个株系，命名为FM84，于2015年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100080），其保藏编号：CGMCC No. 11663。

本发明的第二目的是这样实现的，是以所述克雷氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)FM84经菌种活化、种子培养、生产培养、制剂制备后制成的菌剂。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的克雷氏肺炎杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，其特征在于包括菌种活化、种子培养、生产培养、制剂制备步骤，具体包括：

(1)菌种活化：将所述FM84菌株的保存种按平板培养法进行培养，培养至单菌落出现；

(2)种子培养：将所述单菌落接入至种子培养瓶中，用FM84菌株种子培养基培养至对数生长期；

(3)生产培养：将步骤(2)培养得到的培养液接入发酵罐中，用FM84菌株生产培养基培养至对数生长期，所述培养液的接入量为所述FM84菌株生产培养基总体积的4-8％；

(4)制剂制备：将步骤(3)培养得到的发酵液离心，沉淀用生理盐水悬浮，分装得到福美双农药残留降解菌剂。

本发明的第四目的是这样实现的，所述的菌剂在制备降解福美双药物中的应用。

本发明的克雷氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)FM84，生产成本低、福美双农药去除效果好、高效、无毒、环保，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到福美双农药残留降解菌剂，使用本发明菌株制备得到的降解菌剂具有生产成本低、使用方便，去除效果好等优点，能够有效用于农业生产中无农药残留农产品的生产。

除非另有说明外，本发明中所采用的百分数均为体积百分数。

附图说明

图1为本发明克雷氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)FM84在LB培养基的菌落特征示意图；

图2为本发明克雷氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)FM84对福美双的降解曲线示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明所述的克雷氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)FM84为福美双降解菌，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2015年12月15日，保藏编号：CGMCC No. 11663；所述克雷氏肺炎杆菌属于细菌界，变形菌门，γ-变形菌纲，肠杆菌目，肠杆菌科，克雷伯氏菌属。

所述的克雷氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)FM84的生物学特征为：菌体无芽孢和鞭毛，革兰氏阴性，在LB固体培养基上为乳白色，不透明，有荚膜，粘韧度不等，近圆形，边缘整齐。菌株可在25～35℃，pH值7.0～9.0培养条件下较好生长。

本发明所述的克雷氏肺炎杆菌为活性成分的菌剂，是以所述克雷氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)FM84经菌种活化、种子培养、生产培养、制剂制备后制成的菌剂。

本发明所述的克雷氏肺炎杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，其特征在于包括菌种活化、种子培养、生产培养、制剂制备步骤，具体包括：

菌种活化：将所述FM84菌株的保存种按平板培养法进行培养，培养至单菌落出现；种子培养：将所述单菌落接入至种子培养瓶中，用FM84菌株种子培养基培养至对数生长期；生产培养：将步骤种子培养得到的培养液接入发酵罐中，用FM84菌株生产培养基培养至对数生长期，所述培养液的接入量为所述FM84菌株生产培养基总体积的4-8％；种子培养和生产培养基的优选配方含：(NH4)₂SO₄ 1-3g/L、K₂HPO₄ 4-7g/L、KH₂PO₄1-3g/L、MgSO₄•7H₂O 0.1g/L、葡萄糖5-10 g/L。培养条件为：培养温度25～35℃，pH值7.0～9.0，搅拌频率150～200rpm，空气流量为0.1~1.0vvm。制剂制备：将步骤生产培养得到的发酵液离心（6000rpm，10min），沉淀用含有0.5％吐温-20和0.9%的氯化钠水溶液悬浮，分装得到福美双农药残留降解菌剂。

本发明所述的克雷氏肺炎杆菌为活性成分的菌剂的应用为所述的菌剂在制备毒降解福美双药物中的应用。

下面以具体实施例对本发明做进一步说明：

实施例1

菌株的筛选与鉴定

从大田生长的烟草上采集叶片样品，作为菌源进行自然富集培养，将葡萄糖2g，胰蛋白胨4g，牛肉膏4g，MgSO₄0.8g加入到400mL的蒸馏水中，配制好的培养液在121℃的温度条件下灭菌处理20min，在此培养基上培养三天，再配制无机盐基础培养基，加入福美双，配制成溶液后，然后再加入蒸馏水定容至500mL，上述加入福美双的量要使配制好的培养液中福美双的最终浓度均为100mg/mL，然后将配制好的培养液在121℃的温度条件下灭菌处理20min，即得所需的培养液。在此培养基上培养三天，稀释涂布分离出一株菌命名为FM84，该菌于2015年12月15日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC 11663。

FM84的16SrDNA基因的PCR扩增、测序由上海英骏生物技术有限公司完成。菌株FM84 16S rDNA序列（GenBank登记号：KU057959）与克雷伯菌属细菌亲缘关系最近，与Klebsiella pneumoniae CP010361.1菌株同源性达100.0%，结合形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定菌株属于克雷白氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）。

实施例2

菌剂的制备

将所述FM84菌株的保存种接种到LB固体平板培养法进行培养24h，至单菌落出现；将上述单菌落接入至含有(NH4)2SO4 1g/L、K2HPO4 4g/L、KH₂PO₄ 3g/L、MgSO₄•7H₂O 0.1g/L、葡萄糖5 g/L培养基的三角瓶中，培养至对数生长期得到种子液；将种子培养得到的培养液接入发酵罐中，接种比例为5%，28℃，200rpm，空气流量为0.8vvm，培养48h得到生产培养液。将生产培养得到的发酵液离心（6000rpm，10min），沉淀用含有0.5％吐温-20和0.9%的氯化钠水溶液悬浮，分装得到福美双农药残留降解菌剂。

实施例3

福美双降解实验

被福美双污染的大田烟叶，按每亩喷施1-10×10¹³cfu克雷白氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae ）FM84，烟株在田间自然生长7d后，即能实现对烟叶上福美双残留的生物降解。

图2表示了FM84菌处理烟叶中福美双随时间的动力学降解曲线。接种福美双降解菌FM84的处理在7天的时候福美双降解了99.2%，而喷施清水作为对照的CK烟叶降解缓慢，7天的时候降解了67.2%。可见福美双降解菌喷施后，加速了福美双残留的降解。

利用本发明的方法对烟叶上福美双残留的生物降解效果好，与福美双自然降解相比，提高了对福美双污染烟叶的降解效果，更有利于实际中对烟叶上福美双农药残留的控制。