R反应体系为：PCR Mix 25 μ L， 10 ymol/LPCR引物上、下游引物各I. 5 yL，模板2 yL，灭菌水20 yL。
[0060] 所述 PCR 反应条件为：95 °C 5min ;95 °C 30s，56 °C 30s，72 °C 60s，30 个循环； 72°C 4min〇
[0061] 所述提取鸡羽毛中的DNA步骤为：所述羽毛样采集雏鸡或者成鸡换羽后刚长出 的羽毛2-3根，剪掉羽根上部的绒羽，羽毛剪碎后放入2mL离心管中，每个样品加入裂解液 1000 μ L及蛋白酶K 40 μ L摇匀，放摇床内59°C水浴消化；消化充分后，加700-800uL饱和 酷，摇勾IOmin后以转速IOOOOrpm离心5min ;
[0062] 吸取上清液放入2mL离心管中，加 IOOOuL饱和酚，摇匀5min后以转速IOOOOrpm 离心5min ;
[0063] 吸取上清液放入2mL离心管中，加氯仿1000uL，摇匀5min后以转速IOOOOrpm离心 5min ；
[0064] 吸取上清液放入2mL离心管中，加无水乙醇沉淀出DNA团块，留下DNA倒掉乙醇， 再把DNA团块用70%的酒精洗一遍，以转速IOOOOrpm离心IOmin ;倒掉乙醇，留下DNA，凉 干lh，加灭菌水IOOuL溶解，放-20°C冰箱保存。
[0065] 所述对测序获得序列进行拼接步骤为：将步骤3所述测序获得序列经DNAStar 5. 02软件的SeqMan程序拼接，将拼接序列与GenBank中红色原鸡参考序列NC_007235进行 比对，剪掉引物及多余的序列，获得鸡mtDNA Cytb基因全长。
[0066] 实施例1丝羽乌骨鸡系统进化及遗传多样性的研宄
[0067] LI DNA样本制备
[0068] 采集30只丝羽乌骨鸡颈部换羽后刚长出的羽毛，公母各半，随机取样。用剪刀剪 掉羽根上部的绒羽，在干净的PE手套上剪碎后，放入2mL离心管中，每个样品加入裂解液 1000 μ L及蛋白酶K 40 μ L摇匀，放摇床内59°C水浴消化。消化充分后，加700-800uL饱和 酚，摇匀IOmin后以转速IOOOOrpm离心5min。吸取上清液放入2mL离心管中，加 IOOOuL饱和 酷，摇勾5min后以转速IOOOOrpm离心5min。吸取上清液放入2mL离心管中，加氯仿1000uL， 摇匀5min后以转速IOOOOrpm离心5min。吸取上清液放入2mL离心管中，加无水乙醇沉淀 出DNA团块，留下DNA倒掉乙醇，再把DNA团块用70%的酒精洗一遍，以转速IOOOOrpm离心 10min。倒掉乙醇，留下DNA，凉干（Ih)，加灭菌水IOOuL溶解，放-20°C冰箱保存。
[0069] 1.2 5个亚种红色原鸡Cytb基因全序列下载
[0070] 从GenBank数据库中下载红色原鸡5个亚种Gallus galIus bankiva、Gallus galIus gallus、 Gallus gallus murghi、 Gallus galIus jabouillei、 Gallus galIus spadiceus等已经测出mtDNA Cytb基因全序列的序列，与丝羽乌骨鸡进行系统发育分析。
[0071] 1.3 PCR 扩增
[0072] PCR扩增体系（50 μ L) !PCRMix (南京博尔迪公司）25 μ L，10 μ mol/L引物各 I. 5 μ L，模板 2 μ L，灭菌水 20 μ L。反应程序为：95°C 5min，（95°C 30s，56°C 60s，72°C 60s) 30 循环，72°C 4min。I. 5%低溶点琼脂糖（Promega公司）凝胶电泳检测PCR产物，用试剂盒 (Promega公司）回收纯化。纯化后连同正向引物和步移引物一起送测序公司测序。
[0073] I. 4序列组装和分析
[0074] 测序获得序列用DNAStar 5. 02软件的SeqMan程序拼接，将拼接序列与GenBank 中红色原鸡参考序列NC_007235进行比对，剪掉引物及多余的序列，获得鸡mtDNA Cytb基 因全长。。用DnaSP version 5. 10软件统计多态位点数和突变位点总数，单倍型数，单倍型 多样度，核苷酸多样度等。用MEGA 4.0进行转换与颠换数目的统计和碱基组成分析，并用 其采用邻接法构建系统发育树，发育树选用Kimura 2模型，1000次重复。
[0075] 本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。
【主权项】
1. 鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及测序用引物，其特征在于，包括PCR引物和测序 引物，所述PCR引物的上游引物为：5'-TCTTACCTGGGTTCTTTCG-3'，PCR引物的下游引物为： 5'-TTTAGTGGAGTTGCGGTGT-3' ； 所述测序引物为 Walking primer :5'-CGCCTTTGTGGGCTATGIT-3'。
2. -种鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及测序方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取鸡羽毛中的DNA，并检测质量； (2) 在鸡mtDNA Cyt b基因上下游保守区域设计一对权利要求1所述的PCR引物，通过 PCR反应扩增包含Cytb基因的片段，经琼脂糖凝胶电泳检测； (3) 利用权利要求1所述的测序引物对PCR扩增产物进行测序； (4) 对测序获得序列进行拼接，并减掉上下游多余的序列，获得鸡mtDNA Cyt b基因全 序列，鸡mtDNA Cyt b基因全长为1143bp。
3. 根据权利要求2所述的鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及其测序方法，其特征在 于，所述用于扩增鸡mtDNA Cyt b基因全序列的PCR反应体系为：PCR Mix 25 yL，10 y mol/ LPCR引物上、下游引物各1. 5 y L，模板2 y L，灭菌水20 y L。
4. 根据权利要求2或3所述的鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及其测序方法，其特征 在于，所述PCR反应条件为：95°C 5min ;95°C 30s，56°C 30s，72°C 60s，30个循环；72°C 4min。
5. 根据权利要求2所述的鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及其测序方法，其特征在 于，所述提取鸡羽毛中的DNA步骤为：所述羽毛样采集雏鸡或者成鸡换羽后刚长出的羽毛 2-3根，剪掉羽根上部的绒羽，羽毛剪碎后放入2mL离心管中，每个样品加入裂解液1000 y L 及蛋白酶K 40 y L摇匀，放摇床内59°C水浴消化；消化充分后，加700-800uL饱和酚，摇匀 lOmin后以转速lOOOOrpm离心5min ; 吸取上清液放入2mL离心管中，加1000uL饱和酚，摇匀5min后以转速lOOOOrpm离心 5min ； 吸取上清液放入2mL离心管中，加氯仿1000uL，摇匀5min后以转速lOOOOrpm离心 5min ； 吸取上清液放入2mL离心管中，加无水乙醇沉淀出DNA团块，留下DNA倒掉乙醇，再把 DNA团块用70%的酒精洗一遍，以转速lOOOOrpm离心lOmin ;倒掉乙醇，留下DNA，凉干lh， 加灭菌水100uL溶解，放-20°C冰箱保存。
6. 根据权利要求2所述的鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及其测序方法，其特 征在于，步骤（4)中所述对测序获得序列进行拼接步骤为：将步骤3所述测序获得序列 用DNAStar5. 02软件的SeqMan程序拼接，将拼接序列与GenBank中红色原鸡参考序列 NC_007235进行比对，剪掉引物及多余的序列，获得鸡mtDNA Cytb基因全长。
7. 根据权利要求2所述的鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及其测序方法，其特征是， 测序获得包含mtDNA Cytb基因全长及上游和下游部分序列的1490bp的特异性扩增条带的 核苷酸序列为： TCTTACCTGG GTTCTTTCGC CCTCACAATC CTTACAACGA TCCTACTTAT CCAAAAATAA 60 ACTAatggca cccaacattc gaaaatccca ccccctacta aaaataatta acaactccct 120 aatcgacctc ccagccccat ccaacatctc tgcttgatga aatttcggct ccctattagc 180 agtctgcctc atgacccaaa tcctcaccgg cctactacta gccatgcact acacagcaga 240 cacatcccta gccttctcct ccgtagccca cacttgccgg aacgtacaat acggctgact 300 catccggaat ctccacgcaa acggcgcctc attcttcttc atctgtatct tccttcacat 360 cggacgaggc ctatactacg gctcctacct ctacaaagaa acctgaaaca caggagtaat 420 cctcctcctc acactcatag ccaccgcctt tgtgggctat gttctcccat ggggccaaat 480 atcattctga ggggccaccg ttatcacaaa cctattctca gcaattccct acattggaca 540 caccctagta gagtgagect gaggaggatt ctcagtcgac aacccaaccc ttacccgatt 600 cttcgcctta cacttcctcc tcccctttgc aatcgcaggt attactatca tccacctcac 660 cttcctacac gaatcaggct caaacaaccc cctaggcatc tcatccgact ctgacaaaat 720 tccatttcac ccatactact ccttcaaaga cattctgggc ttaactctca tactcacccc 780 attcctaaca ctagccctat tctcccccaa cctcctagga gacccagaaa acttcacccc 840 agcaaaccca ctagtaaccc ccccacatat caaaccagaa tgatattttc tattcgccta 900 tgccatccta cgctccatcc ccaacaaact tggaggtgta ctagccctag cagcctcagt 960 cctcatcctc ttcctaatcc ccttcctcca caaatctaaa caacgaacaa taaccttccg 1020 accactctcc caaaccctat tetgaettet agtagccaac cttcttatcc taacctgaat 1080 cggaagccaa ccagtagaac accccttcat catcattggc caaatagcat ccctctctta 1140 cttcaccatc ctacttatcc tcttccccac aatcggaaca ctagaaaaca aaatactcaa 1200 ctactaaAAT ACTCTAATAG TTTATGAAAA ACATTGGTCT TGTAAACCAA AAACTGAAGA 1260 CTCCACCCTT CTTAGAGTAT CAGAAAAGGA GGACTCAAAC CTCCATCTCC AGCTCCCAAA 1320 GCTGGTATTT TCAAATAAAC TACTCTCTGA AACCCTTAAA CCGCCCGAAT TGCCCCCCGA 1380 GACAACCCAC GCACAAGCTC TAGTACAACA AACAAAGCTA ACAACAAACC TCACCCAGCC 1440 ACCAAAAACA ACCCAACCCC ACATGAATAA AACACCGCAA CTCCACTAAA 1490。
【专利摘要】本发明公开了一种鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及测序方法和专用引物。鸡mtDNA Cytb基因全序列的扩增及测序用引物，见序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。扩增及其测序方法，包括以下步骤：（1）提取鸡羽毛中的DNA，并检测质量；（2）在鸡mtDNA Cyt b基因基因上下游保守区域设计一对所述PCR引物（SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2）；（3）利用测序引物（SEQ ID NO.3）对PCR产物进行测序；（4）对测序序列进行拼接。本发明的检测方法具有速度快、成本低、易掌握等优点，所获得的mtDNA Cytb基因全序列可以应用于鸡遗传资源多样性评估、母系起源、系统进化分析和种质资源鉴定与保护等多个领域。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-10, C12N15-11
【公开号】CN104611327
【申请号】CN201410835923
【发明人】高玉时, 贾晓旭, 唐修君, 陆俊贤, 唐梦君, 张静, 马丽娜, 樊艳凤
【申请人】江苏省家禽科学研究所
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年12月29日