东方泽泻和泽泻快速鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及用SNP分子标记鉴定东方泽 泻和泽泻的方法。
【背景技术】
[0002] 东方泽泻（Alisma orientale)和泽泻（Alisma plantago-aquatica)分别为泽泻 科泽泻属植物和干燥根，为大宗常用中药材，在临床配伍和中成药生产中使用广泛，如六味 地黄丸和出自《伤寒论》的名方五苓散等，2002年国家原卫生部明确泽泻为可用于保健食品 的原料。2010版《中国药典》收载东方泽泻Alisma orientale (Sam.) Juzep.的干燥块莖为 正品来源。东方泽泻和泽泻Alisma plantago-aquatica自然分布广，中国植物志记载泽泻 常与东方泽泻夹杂入药，二者区分特征仅在植株花瓣、花柱、花序分枝等部位，而对于作为 药用部位的块茎，极易鉴定错误，这就需要寻找到一种稳定可靠的方法将东方泽泻和泽泻 药材、饮片加以鉴定区分。
【发明内容】
[0003] 本发明第一个目的在于提供东方泽泻和泽泻鉴定用SNP。
[0004] 本发明第二个目的在于提供东方泽泻和泽泻鉴定用SNP在东方泽泻和泽泻鉴定 用的应用。
[0005] 本发明第三个目的在于提供东方泽泻和泽泻鉴定方法。
[0006] 本发明提供的东方泽泻和泽泻鉴定用SNP，自核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其 中，SEQ ID No. 1所示序列的5'端起第165位为A或T。
[0007] 本发明提供的SNP可用于鉴定东方泽泻和泽泻，如果自SEQ ID No. 1所示序列的 5'端起第165位为A，则鉴定为东方泽泻，如果自SEQ ID No. 1所示序列的5'端起第165 位为T，则鉴定为泽泻。
[0008] 本发明提供的东方泽泻和泽泻鉴定方法，其包括如下步骤：
[0009] 1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No. 1所示序列的片段；
[0010] 2)对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端5. 8S和26S基因区，获得完整ITS2 基因间隔区，通过分析SEQ ID No. 1所示的序列，确定自SEQ ID No. 1所示序列的5'端起 第165位的碱基。
[0011] 其中，如果自SEQ ID No. 1所示序列的5'端起第165位为A，则鉴定为东方泽泻， 如果自SEQ ID No. 1所示序列的5'端起第165位为T，则鉴定为泽泻。
[0012] 扩增引物使用ITS2引物，其序列为：
[0013] 正向引物：ATGCGATACTTGGTGTGAAT ;
[0014] 反向引物：GACGCTTCTCCAGACTACAAT。
[0015] 上述引物用于扩增东方泽泻或泽泻的ITS2序列。
[0016] 本发明还提供含有上述引物的东方泽泻和泽泻鉴定试剂盒。
[0017] 本发明方法适用性广，能检测所有能提取出DNA的东方泽泻和泽泻任何样品。因 此，能够实现东方泽泻、泽泻原植物、药材和生饮片的快速、准确鉴定。
【附图说明】
[0018] 图 1 所示为 ITS2 序列的扩增结果（注：M :Marker ;1 :YC0072MT06 ;2 :YC0072MT07 ; 3 ：YC0072MT03 ；4 ：YC0798MT26 ；5 ：YC0798MT27 ；6 ：YC0798MT31) 〇
[0019] 图2所示为东方泽泻和泽泻ITS2序列的比对结果。
【具体实施方式】
[0020] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0021] 实施例1
[0022] 1)从不同产地收集的13份东方泽泻和10份泽泻样品，分别取50 mg药材，20 mg 叶片，在MM400球磨仪（德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技（北京）有限公司的植 物基因组DNA试剂盒提取总DNA。
[0023] 表1东方泽泻和泽泻样品
[0024]
【主权项】
1?东方泽泻和泽泻鉴定用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism) SNP标 记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其中，SEQ ID No. 1所示序列的5'端 起第165位为A或T。
2. 权利要求1所述的SNP在鉴定东方泽泻和泽泻中的应用，其特征在于，如果自SEQ ID No. 1所示序列的5'端起第165位为A，则鉴定为东方泽泻，如果自SEQ ID No. 1所示序列 的5'端起第165位为T，则鉴定为泽泻。
3. 东方泽泻和泽泻鉴定方法，其包括如下步骤： 1) 以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No. 1所示序列的片段； 2) 对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端5. 8S和26S基因区，获得完整ITS2基 因间隔区，通过分析SEQ ID No. 1所示的序列，确定自SEQ ID No. 1所示序列的5'端起第 165位的碱基。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，如果自SEQ ID No. 1所示序列的5'端起 第165位为A，则鉴定为东方泽泻，如果自SEQ ID No. 1所示序列的5'端起第165位为T， 则鉴定为泽泻。
5. 权利要求1所述的SNP在鉴定东方泽泻和泽泻中的应用，无论通过何种方式获得包 含SEQ ID No. 1所示的序列，均可用SNP分子标记鉴定东方泽泻和泽泻。
6. 含有权利要求中5中所述的方式鉴定东方泽泻和泽泻试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种东方泽泻和泽泻鉴定方法，其包括如下步骤：1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示的序列；2)对扩增产物进行测序，分析SEQ ID No.1所示的序列，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第165位为A，则鉴定为东方泽泻，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第165位为T，则鉴定为泽泻。本发明能够实现东方泽泻、泽泻原植物、药材和生饮片的快速、准确鉴定。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104611328
【申请号】CN201510011569
【发明人】宋经元, 马晓冲, 姚辉, 辛天怡, 陈士林
【申请人】中国医学科学院药用植物研究所
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月12日