水稻抗稻瘟病基因Piz-t特异性SNP分子标记引物及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子遗传学领域，具体涉及水稻抗稻瘟病基因 Piz-t特异性SNP分子 标记引物及应用，本发明提供的分子标记引物适于在水稻育种中对Piz-t基因型的大量筛 选以及从水稻种质资源中筛选新的Piz-t基因型抗原。 技术背景
[0002] 水稻稻瘟病是危害全球水稻生产最严重的3大病害之一，每年都会对水稻生产造 成巨大的损失，通过选育抗性品种防治稻瘟病具有经济、有效与环保的优点，能有效地减少 稻瘟病直接或间接带来的损失。然而在实际生产中，稻瘟病生理小种变异很快，含有单一抗 性基因的抗性品种长期使用便会因为稻瘟病菌新的优势种群的出现而抗性渐失，因此，并 利用分子标记辅助选择组装、聚合具有不同抗谱的抗性基因，培育广谱、持久抗性水稻品种 成为解决问题的最佳途径。
[0003] Piz-t 位于水稻 6 号染色体短臂（Zhou B, Qu SH, Liu GF et al. The Eight Amino-Aci d Differences Within Three Leucine-Rich Repeats Between Pi2and Piz-t Resistance Protei ns Determine the Resistance Specificity to Magnaporthe grisea. MOL PLANT MICROBE I N, 2006, 19 (11) :1216-1228),是一个具有对稻瘟病生理小种 具有广谱抗性的基因，因此对于培育具有广谱抗性的水稻品种具有巨大的利用价值，但该 基因所在位点具有多个对不同稻瘟病生理小种具有抗性的等位基因包括Pi9、Pi-z、Pi-2 以及感病等位基因，因此对于该基因利用的前提是将它与其余等位基因区分开。目前等位 性测定的方法是通过对含有不同等位基因的材料在温室内进行不同稻瘟病生理小种接种 鉴定，根据它们的抗谱差异将不同等位基因区分开来，但这种方法存在实验周期长、复杂、 繁琐，因此限制了它在育种中的应用。
[0004] 分子标记是一种快速、简便、成本低廉并可在水稻生长早期进行无损检测的一种 技术，但目前还没有对Piz-t等位基因鉴定的分子标记报导。本研宄通过对含有不同等位 基因材料目标位点利用染色体步移（Chromosome walking)技术通过大量测序以及序列比 对鉴定到一个Piz-t基因型特异性SNP位点（Piz-t为A碱基，其余均为G碱基），在两对交 叉引物 P CR(PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP)方法的基础上加以改 进创新，通过在内引物倒数第三位引入错配碱基，开发出鉴定该SNP位点不同碱基类型的 共显性标记，如图1所示，通过设计4条引物（AF、AR、GF、GR)并利用待测品种基因组DNA进 行PCR扩增，根据扩增条带类型鉴定Piz-t基因型，如果扩增出160bp条带则为纯合Piz-t 基因型，其余等位基因类型扩增条带为221bp，而杂合型则同时具有两条条带，并且三者还 会有一条331bp的共有条带。因此该方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助 选择育种或者水稻种质资源Piz-t基因型鉴定。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了水稻抗稻瘟病基因 Piz-t特异性SNP分子标记引物，分 别为：AF :TTGCTGAGCCATTGTTAAACA ;AR :ATGGCAAATGAACTAAAGG ;GF :GGTCC TCTGCATGGTATG ; GR :AGGAGAGATAGAACATTGTTGTAAC。引物特异性好，扩增效率高，可用于水稻抗稻瘟病基因 Piz-t的基因型鉴定。
[0006] 本发明的另一个目的是提供了水稻抗稻瘟病基因 Piz-t特异性SNP分子标记引物 的应用，利用该引物可以有效的对抗稻瘟病基因 Piz-t进行基因型选择，既可以用于水稻 资源的筛选鉴定，又可以用于水稻抗稻瘟病基因 Piz-t的分子育种。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采取了以下技术措施：
[0008] 本发明技术方案采取以下思路：Piz-t位于水稻第6号染色体的短臂，CDNA全长 3335b p，含有两个内含子，长度分别是3839bp和116bp，并且在该位点Piz-t还具有Pi9、 Pi-z、P i-2这3个抗病等位等位基因以及1个没有功能的感病等位基因，因此通过寻找 Piz-t特异性序列或碱基并设计引物进行PCR扩增是区分Piz-t与其余等位基因的最好方 法。
[0009] 通过对4个抗性等位基因及1个感病基因的基因组编码区进行序列比对并没 有发现Piz-t特异性序列或者碱基，因此我们通过设计引物在Piz-t编码区的上下游通 过Chromosome Walk ing的方法对Piz-t来源材料基因组进行了 PCR扩增、测序，将获得 序列首先与包含感病等位基因的材料Nipponbare及9311的对应序列进行比对（因为 Nipponbare与9311是已测序品种，全基因序列均可获得），对于具有差异序列的位点再利 用包含其余3个等位基因的材料进行测序比对确认，最终在Piz-t下游15387bp处获得一 个Piz-t特异性SNP位点，Piz-t等位基因型为A碱基，其余基因型均为G碱基；因此，通过 设计特异性引物对该SNP位点特异性扩增即可实现Piz-t等位基因的鉴定。
[0010] 引物设计原理如下（图1):在设计A型等位基因鉴定引物时，根据PCR-CTPP方法 原理，首先以该SNP位点的A碱基作为3'端在该位点上游设计正向引物AF(表1)，在下游 设计反向引物AR，理论上AF的3'端的A碱基与A型等位基因材料正常结合扩增而与G型 材料形成A/C错配无法扩增，而我们的实验结果表明该错配并不能区分两种基因型，在G型 材料中也有较微弱的扩增，因此为增强该引物特异性我们在AF的倒数第三位引入了一个 错配碱基A增强其特异性，结果表明该引物只有与A型等位基因材料扩增时有一条160bp 条带，与G型材料没有条带扩增；同理，按照上述思路开发出扩增G型等位基因材料的GF与 GR ;4条引物名称、序列、Tm值及扩增片段长度见表1所示。
[0011] 我们接着做了一个PCR扩增退火温度的梯度及引物浓度梯度测试（图2)，退火温 度分别为55°C、57°C和59°C，由于PCR-CTPP方法中一般将外引物（即GF、AR)浓度设置为 内引物（即GR、AF)浓度的一半，我们也设置了 3个不同的引物浓度比：AF、AR、GF与GR浓 度比分别为I: I: I: I、I. 5:1:1:2以及2:1:1:1. 5,结果表明在退火温度为55°C引物浓度比 为1:1:1:1时扩增条带清晰。
[0012] 水稻抗稻瘟病基因 Piz-t特异性SNP分子标记引物的应用，包括以下步骤：
[0013] 1)水稻DNA的提取
[0014] 2)合成表1所示的引物序列。
[0015] 3) PCR 扩增
[0016] PCR反应体系为 20 yL，含 2. 0 yL lOXBuffer，I. 0 yL dNTPs(10mmol/L)，4 条引 物均为 0· 2 μ M，0· 2 μ L Taq 酶（5U/ μ L)，2. 0 μ L 模板 DNA，12. 8 μ L ddH20 ;PCR 反应程序： 94°C预变性5min ;94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35个循环；72°C延伸 lOmin，扩增产物在3%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。
[0017] 4.结果判断
[0018] 4条引物AF、AR、GF与GR等量混合扩增，根据扩增条带类型判断基因型，SNP位点 为A碱基的Piz-t型等位基因材料扩增出160bp和331bp 2条条带，SNP位点为G碱基的其 它等位基因材料扩增出221bp和331bp 2条条带，AG杂合型则扩增出160bp、221bp和331bp 的3条条带。331bp的共有条带扩增不明显或不稳定，但对本方法的结果判定无任何影响。
[0019] 表1引物序列
[0020]
【主权项】
1. 水稻抗稻瘟病基因Piz-t特异性SNP分子标记引物，分别为：AF : TTGCTGAGCCATTGTTAAACA ；AR ：ATGGCAAATGAACTAAAGG ；GF ：GGTCCTCTGCATGGTATG ；GR ： AGGAGAGATAGAACATTGTTGTAAC 〇
2. -种对水稻抗稻瘟病基因的鉴定方法，包括： 利用 AF ：TTGCTGAGCCATTGTTAAACA ；AR ：ATGGCAAATGAACTAAAGG ；GF ： GGTCCTCTGCATGGTATG ;GR :AGGAGAGATAGAACAITGTTGTAAC，对水稻 DNA 进行 PCR 扩增；纯合 产办-纟基因型扩增出160bp和331bp条带，其余等位基因类型扩增条带为221bp和331bp条 带，杂合型的扩增条带为160bp、221bp和331bp条带。
3. 权利要求1所述的引物在水稻抗稻瘟病基因分子育种中的应用。
4. 权利要求1所述的引物在水稻资源的筛选鉴定中的应用。
【专利摘要】本发明公开了水稻抗稻瘟病基因Piz-t特异性SNP分子标记引物及应用。申请人通过将不同等位基因测序及序列比对鉴定到一个Piz-t特异性SNP位点并开发了一套鉴定该SNP的分子标记引物，分别为：AF：TTGCTGAGCCATTGTTAAACA；AR：ATGGCAAATGAACTAAAGG；GF：GGTCCTCTGCATGGTATG；GR：AGGAGAGATAGAACATTGTTGTAAC。利用该引物对水稻DNA进行PCR扩增，可快速判断待测水稻Piz-t的基因型。方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Piz-t基因型鉴定。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104611332
【申请号】CN201510039800
【发明人】蔡海亚, 游艾青, 徐得泽, 周雷, 程建平, 闸雯俊, 李三和, 焦春海
【申请人】湖北省农业科学院粮食作物研究所
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月27日