一种降低人POKEMON基因表达的siRNA及其相关应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及RNA干扰技术，更具体地涉及一种降低 人POKEMON基因表达的小分子干扰核糖核酸（siRNA)。
【背景技术】
[0002] RNA干扰技术是一种新兴的基因治疗技术，又称为基因敲低（knock-down)或基因 沉默（gene silencing)，其中siRNA (small interfering RNA)是最关键的效应分子，其具 有21-23nt碱基的短片段双链RNA分子，能够以序列特异性地结合靶mRNA并使mRNA降解。 能有效、特异地抑制细胞内基因的表达。由于RNA干扰具有高效、特异性，siRNA介导的转录 后基因沉默是针对靶向基因的外显子序列，对其启动子或内含子序列却没有效应，是一种 转录后基因表达调控机制，且不诱导非特异性的干扰素激活途径，因而成为继反义核普酸、 核酶技术之后一种新的分析功能缺失表型的工具，为基因功能研宄和基因治疗开辟了新的 道路，目前已广泛用于抑制特定基因的表达研宄，特别是靶向恶性肿瘤中高度表达基因的 研宄。
[0003] POKEMON是POK转录抑制因子家族成员之一，它包括一个氨基末端Ρ0Ζ/ΒΤΒ结构 域和羧基端Krilppel型锌手指结构域，是T淋巴细胞、B淋巴细胞和红细胞系发育和成熟的 重要因子。研宄结果显示，POKEMON的作用位于许多肿瘤抑制基因和原癌基因的上游，通过 ARF_HDM2_p53和Rb_E2F路径对肿瘤发生发展进行调节，可使癌细胞获得抗老化和死亡的 能力，因此被称为癌症的"总开关"。因此，将其作为靶基因将有助于肿瘤的根治。POKEMON 基因在乳腺癌、肝癌和淋巴瘤等肿瘤的异常表达在癌基因转化和肿瘤的发生过程中发挥着 重要的作用。重点是细胞内POKEMON基因的缺失不会对细胞的正常生长造成影响，这为设 计低副作用的特异性抗癌药物提供了可能。目前尽管早期癌症患者进行了根治性切除和辅 助治疗，但仍具有很大的复发和转移的风险。总体而言，约50% -60%的患者将最终发展为 转移性或晚期疾病，5年生存率小于5%。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供4对针对人POKEMON基因 DNA片段的SiRNA，能高效的抑制 人POKEMON基因表达的小干扰核糖核酸。
[0005] 本发明首先提供了一种降低POKEMON基因表达的小分子干扰RNA(SiRNA)，包括正 义链和反义链，序列如下：
[0006] siRNAl 正义链：5' -CCCACCACAAACGUAGAAUUU-3'
[0007] 反义链：3' -UUGGGUGGUGUUUGCAUCUUA-5，
[0008] siRNA2 正义链：5' -GACCUUAAAUGAUUUCU⑶UU-3'
[0009] 反义链：3' -UUCUGGAAUUUACUAAAGACA-5'
[0010] siRNA3 正义链：5' -CUGAC⑶GAAGAG⑶CUUAUU-3'
[0011] 反义链：3 ' -UUGACUGCACUUCUCCAGAAU-5 '
[0012] siRNA4 正义链：5' -CUCUGUGACACACACAUCUUU-3'
[0013] 反义链：3' -UUGAGACACUGUGUGUGUAGA-5，
[0014] 本发明所述小分子干扰RNA(siRNA)针对的POKEMON基因的靶序列如SEQ ID No. 1-4 所示。
[0015] SEQ ID No. I ：AA CCCACCACAAACGTAGAAT CC
[0016] SEQ ID No. 2 ：AA GACCTTAAATGATTTCTGT CT
[0017] SEQ ID No. 3 ：TT CTGACGTGAAGAGGTCTTA GC
[0018] SEQ ID No. 4 ：ΤΤ CTCTGTGACACACACATCT TC
[0019] 本发明提供了一种小分子干扰核糖核酸（siRNA)，其包含正义RNA片段和反义RNA 片段，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段能形成双链RNA，该双链RNA能抑制人POKEMON 基因的表达。对于上述小分子干扰核糖核酸来说，所述正义RNA片段和反义RNA片段可以 存在于两条不同的RNA链上，也可以存在于同一条RNA链上。当正义RNA片段和反义RNA 片段存在于同一条RNA链上时，所述核糖核酸优选为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA片 段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。对于上述任一项所述的小分子干扰 核糖核酸，其中正义RNA片段和反义RNA片段的长度为21个核苷酸。对于任一项所述的小 分子干扰核糖核酸，其中双链RNA的互补区域至少有19个碱基对。本发明的所述抑制人 POKEMON基因表达的siRNA，通过人工合成形成，其生产和制备属于现有技术。
[0020] 本发明提供的SiRNA能特异性抑制POKEMON基因的表达，MTT分析实验结果表明 本siRNA能抑制癌细胞的增殖。该siRNA能够高效、特异地抑制人POKEMON基因的表达，同 时具有较低的毒副作用。
【具体实施方式】
[0021] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合表格对本发明作进 一步的详细描述。
[0022] 实施例1抑制人POKEMON基因表达的siRNA序列的合成
[0023] 从 Genebank 调取POKEMON基因（ΝΜ_015898)信息，用 http://sirna. wi. mit. edu/ home, php的在线设计软件设计针对POKEMON基因可能有效的siRNA靶点。再通过BLAST分 析，将候选siRNA靶位点同人类基因序列进行同源性比对，排除同POKEMON基因以外的其它 人类基因序列具有较高序列同源性（16个以上碱基）的序列，以确保候选SiRNA靶位点不 会对其它人类基因发生抑制作用，而仅对POKEMON基因具有特异的抑制作用。分析设计总 共得到20对siRNA。
[0024] 实施例2RT-PCR法检测siRNA对POKEMON基因的沉默效率
[0025] 使用Invitrogen的lipofectamine2000脂质体进行转染，所有操作均严格遵守 Invitrogen提供的操作规程。将处于对数生长期的HepG2细胞进行胰酶消化，制成细 胞悬液（细胞数约为5X IOVml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约40%即可用 于转染。将siRNA干粉溶解于无 RNA酶的无菌水中，配置终浓度为20pmol/L的siRNA溶 液。转染时，分别取10 μ L的上述一种siRNA溶液和5 μ L的lipofectamine2000分别稀释 于250 μ L无血清培养液（Opti-MEM)中，并在室温下孵育5min，然后将上述siRNA溶液和 lipofectamine2000溶液混合，复合物与室温下静置20min后，把500 μ L的siRNA-脂质体 复合物与I. 5mL无血清DMEM培养基混合后，加到细胞培养板中，6h后换为10 % FBS-DMEM培 养基，于48h后收集细胞进行RT-PCR检测。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽 提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将总RNA逆转录获得cDNA。（逆转录反应 体系为：4. OyL 5XRT buffer、2.0yL IOmM dNTPs、0. 5 yL RNasiruLOyL M-MLV-RTase、 3· 5 yL DEPC H2CMLOyL Total，42。。反应lh，然后在70。。水浴锅中水浴IOmin使逆转录 酶失活）。使用PCR仪（Biorad)进行扩增反应。PCR反应以β -actin为内参照，Ρ0ΚΕΜ0Ν上 游引物：5' -TTGTGCTCTACCTCCAC-3 '，Ρ0ΚΕΜ0Ν 下游引物：5' -AATGCTTTCTCCGCTCTG-3 ' 扩增片段长度 418bp ; β -actin 上游引物：5' -CTATTGGCAACGAGCGGTTC-3'，β -actin 下 游引物：5 ' -CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT-3 ^，扩增片段长度776bp。根据PCR试剂盒与扩增 仪说明，采用5(^1^反应体系：。0嫩5 4 1^，2\?〇?1&18七6125 4 1^，25臟〇1/1]\%(：122 4 1^， Ρ0ΚΕΜ0Ν上游引物（10 ymol/L)2 yL，P0KEM0N下游引物（10 ymol/L)2 yL，β -actin上游引 物（1〇4!11〇1/1)2 4 1^0-&(^11下游引物（1(^111〇1/1)2 4 1^(1(1!12〇1(^1^反应条件：预变 性94°C 5min ;94°C lmin，56°C 50s，72°C Imin共 30 个循环；72°C延伸 10min，4°C保温30min。 扩增后的产物取3yL进行1%浓度的琼脂糖凝胶电泳，然后在KODAK IMAGE STATI0N2000R 成像仪上进行拍照，利用SensiAnsys图像分析软件分析电泳条带的灰度值。mRNA表达的相 对强度=目的条带的灰度值/ β -actin条带的灰度值
[0026] 对设计的20对siRNA进行上述实验，结果显示，其中仅有4对siRNA显示了较好 的干扰效果，其余16对siRNA则无感染效果或明显低于10%的抑制率。
[0027] 最终筛选得出的4对siRNA的靶点序列为SEQ ID NO : 1-4所示，该4对siRNA的 序列如下所示：
[0028] siRNAl 正义链：5' -CCCACCACAAACGUAGAAUUU-3'
[0029] 反义链：3' -UUGGGUGGUGUUUGCAUCUUA-5，
[0030] siRNA2 正义链：5' -GACCUUAAAUGAUUUC腳UU-3'
[0031] 反义链：3' -UUCUGGAAUUUACUAAAGACA-5，
[0032] siRNA3 正义链：5' -CUGACGUGAAGAGGUCUUAUU-3'
[0033] 反义链：3' -UUGACUGCACUUCUCCAGAAU-5'
[0034] siRNA4 正义链：5' -CUCUGUGACACACACAUCUUU-3'
[0035] 反义链：3' -UUGAGACACUGUGUGUGUAGA-5，
[0036] 选取与基因组中的任何序列都没有连续16个碱基的同源性的靶序列作为阴性对 照NC，具体序列如下：
[0037] 正义链序列：5' -UUCUCCGAAGCUGUCACGUTT-3'
[0038] 反义链序列：5' -ACGUGACAGCUUCGGAGAATT-3'
[0039] 所述siRNA 1-4和NC序列中的A、G、C、U分别表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核 糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
[0040] 结果如表1所示，与转染了阴性对照siRNA(NC-siRNA)的细胞比较，实验组中人 HepG2细胞的Ρ0ΚΕΜ0Ν mRNA表达水平下降，4组均差异显著（P < 0. 05)。
[0041] 表I :siRNA对人HepG2细胞的Ρ0ΚΕΜ0Ν mRNA表达水平的影响
[0042] 实验组 ImRNA表达的相对强度|P值 _
【主权项】
1. 一种人POKEMON基因小分子干扰核糖核酸（siRNA)序列，其特征在于，所述siRNA序 列包含如下序列： siRNAl 正义链：5' -CCCACCACAAACGUAGAAUUU-3' 反义链：3' -UUGGGUGGUGUUUGCAUCUUA-5， siRNA2 正义链：5' -GACCUUAAAUGAUUUCUGUUU-3， 反义链：3' -UUCUGGAAUUUACUAAAGACA-5' siRNA3 正义链：5' -CUGACGUGAAGAGGUCUUAUU-3， 反义链：3' -UUGACUGCACUUCUCCAGAAU-5， siRNA4 正义链：5' -CUCUGUGACACACACAUCUUU-3' 反义链：3' -UUGAGACACUGUGUGUGUAGA-5'。
2. 权利要求1所述的人POKEMON基因小分子干扰核糖核酸（siRNA)序列在用于制备治 疗癌症的药物中的用途。
3. 权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的癌症为乳腺癌、肝癌和淋巴瘤。
4. 一种用于治疗癌症的药物，其特征在于：所述药物含有如下所示的siRNA中的至少 一种： siRNAl 正义链：5' -CCCACCACAAACGUAGAAUUU-3' 反义链：3' -UUGGGUGGUGUUUGCAUCUUA-5， siRNA2 正义链：5' -GACCUUAAAUGAUUUCUGUUU-3， 反义链：3' -UUCUGGAAUUUACUAAAGACA-5' siRNA3 正义链：5' -CUGACGUGAAGAGGUCUUAUU-3， 反义链：3' -UUGACUGCACUUCUCCAGAAU-5， siRNA4 正义链：5' -CUCUGUGACACACACAUCUUU-3' 反义链：3' -UUGAGACACUGUGUGUGUAGA-5，
5. 权利要求4所述的药物，其特征在于：所述药物含有siRNAl与siRNA2的组合或 siRNA3与siRNA4的组合中的至少一种组合。
6. 权利要求4所述的药物，其特征在于：所述的癌症为肝癌。
【专利摘要】本发明涉及一种针对POKEMON基因的siRNA。通过自行设计得到4对针对POKEMON基因的siRNA，并将该4对siRNA进行两两组合试验，并通过试验证实，所述siRNA能取得良好的基因沉默效率、蛋白表达抑制率和肿瘤生长抑制效果，其中组合1(siRNA1与siRNA2)的肿瘤抑制效果最佳，其肿瘤抑制率为54.95％。
【IPC分类】A61P35-00, A61K31-713, C12N15-113
【公开号】CN104611333
【申请号】CN201410814045
【发明人】孔晶, 柳晓平
【申请人】淮阴工学院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年12月22日