花生特异启动子AhRSP与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及花生特异启动子AhRSP与应用，属于植物基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 花生是我国重要的油料作物和经济作物之一，也是单产、总产、单位面积产油量和 种植业产值最高的大宗油料作物和出口创汇的优势农产品。长期以来，根部病虫害是影响 花生产量和品质的主要病害，如花生的青枯病、根结线虫、蛴螬等。花生青枯病是土传性的 细菌病害，该病害从根部侵入，一旦发生会给花生生产造成毁灭性性的打击，该病目前在我 国南方花生产区，如广东、福建、江苏、湖南、湖北、安徽等省份普遍发生，目前在山东、辽宁、 河北、河南等地也有发生，危害十分严重。花生根结线虫病是一种世界性病害，几乎所有种 植花生的国家和地区都有发生，其中以山东发病最为普遍。花生感病后根的吸收功能被破 坏，植株矮小发黄，结果少而稀。一般减产20 %?30 %，严重的可减产70 %以上，甚至绝收。 除了上述两种病虫害，蛴螬也是危害花生的重要虫害。蛴螬剥食花生主根使植株死亡，导致 严重减产，甚至绝产的现象时有发生。但是对于上述花生根部病虫害至今没有特效药可治。 利用基因工程手段将抗病、抗虫的基因导入花生中，提高花生的抗性，是减少花生病害损失 的重要途径。
[0003] 植物基因工程技术的成功应用不仅需要大量的优异基因资源，而且需要驱动基因 高水平表达的启动子，需要在特定器官、组织中特异表达的启动子，以避免在转基因过程 中的不利影响。在植物转基因载体构建过程中常用的启动子主要有2个，第一，花椰菜花 叶病毒CaMV35S启动子，该启动子来自花椰菜病毒，是非植物内源的组成型启动子（Odell et al.，1985)，该启动子能驱动目的基因在单、双子叶转基因植物的所有组织中高效表达 (Battraw and Hall，1990)。第二，玉米ZmUbi启动子，该启动子来源于玉米泛素，是植物内 源的组成型的启动子，ZmUbi启动子在单子叶植物许多的细胞中都有很高的活性，能够调控 目的基因在根、叶中强烈表达（Cornejo et al.，1993)。但是，组成型启动子驱动的基因在 植物的所有组织、所有生长阶段都高水平的表达，在实际应用过程中会产生一系列的问题 (Napoli et al.，1990)。例如，外源基因在植物体内大量表达会产生许多的异源蛋白或者 产生有害物质，这些物质在植物体内积累，会打破植物体内原有的代谢平衡，影响植物正常 的生长发育，造成植物生长延缓、开花延迟、甚至不育或死亡（Pino et al.，2007)。
[0004]目前转基因的安全性受到了受到了广泛的关注，并且饱受质疑，选择有效、安全的 启动子成为了当前转基因育种的热点与难点。因此，鉴定能在植物特定组织、器官以及特定 时期调控基因表达的启动子进行遗传载体的构建，对于作物的遗传改良显得尤为必要。对 花生而言，克隆能够在花生根中特异、高水平表达的启动子，不仅可以构建抗病、抗虫的表 达载体，通过转基因获得抗病虫的转基因植株。而且，花生的抗旱、耐盐等性状也和根的生 长发育相关，将通过根特异启动子将抗旱耐盐的基因在花生根中特异表达，对花生的抗旱、 耐盐研宄也具有积极的意义。但是目前，在可检索的资料中花生根特异启动子的报道很少， 限制了利用基因工程改良花生根部性状的研宄进程。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种花生特异启动子AhRSP与应用。利用特异 启动子来安全有效的解决花生生产过程中的根部病虫害，提高花生抗旱、耐盐的能力。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 一种花生特异启动子AhRSP，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的花生特异启动子AhRSP。
[0009] -种重组细胞，含有上述花生特异启动子AhRSP或者上述重组载体。
[0010] 上述花生特异启动子AhRSP、重组载体和/或重组细胞在改良花生或其他经济作 物抗病虫、抗旱、耐盐转基因植物中的应用。
[0011] 根据本发明优选的，上述应用，步骤如下：
[0012] 构建由SEQ ID NO. 1所示根特异启动子驱动目的基因的植物表达载体，通过农杆 菌介导、花粉管导入或者基因枪的方法转入作物中，培育获得转基因作物。
[0013] 进一步优选的，所述的目的基因为抗病、抗虫、抗盐或耐旱的基因。
[0014] 进一步优选的，所述的作物为花生、大豆或苜蓿。
[0015] 有益效果
[0016] 1、本发明所述的根部特异启动子AhRSP，在花生的根部表达量高，而在种子中不表 达，种子是花生的收获器官、食用器官和经济器官，种子上不表达，能够提高花生转基因的 安全性；其克服了传统的基因工程所用的启动子为组合型35S启动子或Ubi启动子，它在植 物所有的组织器官、发育的不同阶段都有表达、容易发生基因沉默的缺陷，能够满足转基因 安全性的要求；
[0017] 2、本发明所述的根部特异启动子AhRSP，确定了花生根部特异启动子的表达特性， 由AhRSP驱动外源基因只在花生根中表达，不会引起其他不良性状的产生，为花生抗根茎 部病害和耐盐抗旱新品种的培育奠定了良好的技术基础。
【附图说明】
[0018] 图1花生根特异基因 Unigene68985的启动子AhRSP在花生不同器官中表达的柱 状图；
[0019] 图2根特异启动子AhRSP全长序列克隆的电泳图；
[0020] 其中：M、DNA分子标准，A、启动子，B、C、D代表非特异扩增；
[0021] 图3生物信息学统计根特异元件在AhRSP启动子的分布图；
[0022] 图4根特异表达基因植物表达载体构建示意图；
[0023] 图5转基因花生PCR检测结果的电泳图；
[0024] 其中：1，6-12为阳性转化苗，13为质粒阳性对照，14为阴性对照，M为DNA分子标 准，其它为阴性转基因苗。 具体实施方案
[0025] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于 此。
[0026] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
[0027] 鲁花14和GX029来源于山东省农作物种质资源中心，普通市售产品；
[0028] 中花9号来源于中国农业科学院油料作物研宄所，普通市售产品。
[0029] 实施例1 :花生AhRSP启动子的表达分析
[0030] 以花生品种鲁花14,中花9和GX029的根、茎、叶、花、种皮为材料，提取RNA，经反 转录，制得cDNA。用花生Actin引物检测cDNA质量。根据基因 Unigene68985的序列设计 定量PCR检测引物：
[0031] Unigene68985RTF :5' -CAAGGATGACACAATACCAGAACATAG-3' 和
[0032] Unigene68985RTR :5' -GGAAACAGGAATCTCCCCAATC-3' 〇
[0033] 以这三个品种的各组织的cDNA为模版，使用实时荧光定量进行定量分析。定量C 使用FastStart SYBR Green试剂盒（购自Roche公司）进行扩增，配制20 μ L的反应体 系，含有IOng的引物和2 μ L的cDNA，在进行实验前先用半定量的方法对各个组织cDNA浓 度进行估算和平衡。
[0034] 反应程序为：95°C预变性IOmin ;两步法扩增95°C 15s，60°C lmin，40个循环；测定 溶解曲线95°C 15s，60°C 15s，95°C 15s。每个反应均设3次重复。
[0035] 根据溶解曲线检测PCR产物的特异性。基因表达水平测定使用相对表达，通过2_ AACT方法。定量PCR结果表明，在不同花生品种中Unigene68985基因均在根中高水平积 累，而在其他组织中几乎检测不到，证明是Unigene6898根特异表达基因（图1)，其启动子 AhRSP是花生根特异的启动子。
[0036] 花生不同组织RNA提取的方法如下：
[0037] (1)称取0. 2g新鲜组织，在液氮中充分研磨至粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮， 防止材料解冻；
[0038] (2)将研好的组织迅速转移至预热（65°C )的装有600 μ I CTAB提取液（2% CTAB， 2%PVP，0,1M Tris-Cl，2. OM NaCl，25mM EDTA)的 EP 管中，立即剧烈涡旋振荡 30s，使其混 匀；
[0039] (3) 65°C水浴2-5min，期间剧烈涡旋振荡3-5次；
[0040] ⑷稍微冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇（氯仿：异戊醇=24 :1 (V/V)，下同）， 祸旋振荡 Imin,混勾，4°C，12, OOOrpm 离心 15min ;
[0041] (5)将上清转移到另一新的EP管中，加入2微升的DNase I，37°C水浴15min ;
[0042] (6)再加入等体积的氯仿/异戊醇祸旋振荡lmin,混勾，4 °C，12000rpm离心 15min ；
[0043] (7)将上清转移到另一新的EP管中，加入1/3体积的8M LiCl，使其终浓度为2M， 4 °C过夜沉淀；
[0044] (8)4°0，12000印111离心2〇1^11，弃上清，分别用70%乙醇，无水乙醇洗沉淀，晾干， 加 30-50 μ I DEPC-H2O 溶解沉淀；
[0045] (9)在微量离心管中加入全部 RNA，DNaseI Buffer 5ul，DnaseI (5U/ μ 1) 5 μ 1， Rnase Inhibitor (40 μ / μ 1)0. 5 μ 1，最后加入 DEPC H2O 使总体积达到 50 μ 1，37°C反应 I 个小时；
[0046] (10)加入 50 μ I DEPC H2O，混匀；
[0047] (11)加入等量（100 μ 1)的苯酚/氯仿/已戊醇（体积比25:24:1)，充分混匀；
[0048] (12)离心，取上层水相到新离心管中；
[0049] (13)加入等量（100 μ 1)的氯仿/已戊醇（体积比