小麦根特异表达膨胀素基因的启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种小麦根特异表达膨胀素基因的启动 子及其应用。
【背景技术】
[0002] 启动子是重要的基因表达调控元件。直接决定着基因的时空表达特征和表达量， 因此分离合适的启动子是基因工程育种的重要研宄内容。组织特异性表达的启动子是一类 特殊的诱导型启动子，在这些启动子的调控下，基因往往只在某些特定的器官组织进行表 达。深入研宄这些启动子不仅可以避免组成型表达启动子持续表达所造成的浪费等缺点， 而且有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，具有广泛的应用价值。例Dapena et al. (2006)利用种子特异表达的启动子DSlO启动小热激蛋白蛋白基因（你汉5?釣转化 太阳花，外源基因表达可以在不影响转基因植株生长发育条件下提高转基因株系种子的寿 命。研宄根特异性表达启动子不仅可以分析根中特异表达基因的生理功能，更重要的是因 为根特异表达系统有着其它组织所不能具有的优点。例，根特异表达系统可用于研宄转基 因植物的高渗、胁迫耐受、根际分泌等问题。利用根特异表达系统产生的目的蛋白可以分泌 到液体培养基中，更有利于回收（Borisjuk et α1·，1999)〇Ι^Γ??η et al. (1996)以生长 素诱导主要在根和花中表达的GH3基因的启动子启动GUS基因的表达，用于研宄根的向地 性和侧根的发育。
[0003] 目前来看，虽然有许多诱导型启动子及组织特异性表达的启动子被克隆，但由于 专利保护及表达活性不高等限制因素，真正应用较多的诱导型及组织特异表达启动子的数 量还很有限，在小麦中克隆的组织特异表达的启动子更少。且随着基因工程育种的不断深 入，适用的启动子却越来越显得捉襟见肘。因此，有关启动子的分离和研宄在最近几年成为 国内外研宄的热点之一。
[0004] 膨胀素又称细胞壁松弛蛋白，在细胞生长过程中对细胞壁的膨胀起作用。近年来， 几个根毛特异发育相关的膨胀素基因在不同作物中被相继克隆和鉴定。功能研宄表明，这 些膨胀素基因参与了植物对非生物胁迫的抗性及根毛的形态建成（Guo et al.，2011; Ma et al.，2013)，启动子研宄表明，这些基因的启动子可启动基因在根毛中特异表达。因 此克隆及研宄这些启动子的功能对培育耐盐、抗旱等作物及研宄根系的形态发生具有重要 意义及应用价值。但目前有关小麦根毛特异表达的膨胀素基因的启动子的克隆及应用还未 见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种在单子叶植物根中（特别是根毛中）特异表达的启动子 TaREXP。
[0006] 本发明的技术方案是：利用已发表的大麦根特异表达的膨胀素基因序列，利用同 源基因克隆的办法，以小麦根cDNA为模板，PCR获得小麦根特异表达的膨胀素基因的全长 cDNA序列；然后根据获得的cDNA序列，在5 z端设计嵌套引物，以小麦基因组DNA为模板， 利用GenomeWalker获得小麦根特异表达地膨胀素基因的启动子序列；然后构建以GUS为报 告基因的稳定表达载体，通过GUS组织化学染色的方法测定目标启动子的表达活性及表达 部位。
[0007] 本发明所提供的启动子来自小麦根特异表达的膨胀素基因 TaExpansin的上游序 列，命名为TaREXP。是序列表中序列的SEQ ID NO. IDNA序列。
[0008] 本发明还提供了含上述启动子的植物表达载体pCAM1391Z/TaREXP。
[0009] 本发明所述启动子TaREXP在培育耐盐、抗旱植物中的应用。所述植物优选是普通 小麦。
[0010] 植物表达载体在培育耐盐、抗旱植物中的应用也在本发明保护范围之内。
[0011] 本发明所述启动子TaREXP启动子在生产根特异表达蛋白中的应用，上述根特异 表达蛋白优先指有药用价值的蛋白。
[0012] 将任何基因连接到本发明所述根特异表达启动子的下游均可转录。而且任何一种 可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用。
[0013] 述启动子在培育小麦中的应用以及植物表达载体在培育小麦中的应用，同样也是 本发明的保护范围。
[0014] 本发明的有益效果：通过⑶S组织化学染色研宄表明，本发明所克隆的启动子能 在转基因植株根中(特别是根毛中)特异表达。该启动子可以启动任何外因基因在根部的表 达，可广泛用于培育耐盐、抗旱农作物新品种以及用于生产根特异表达蛋白。具有重要的应 用价值。
【附图说明】
[0015] 附图1根特异表达膨胀素基因 TaExpansin在小麦3338幼苗不同组织中的 RT-PCR 分析； 附图2从小麦3338基因组DNA中扩增到的TaExpansin启动子序列及启动字区所含顺 式作用元件分析； ABRE:ABA响应元件；ARE :厌氧诱导响应元件；Box-Wl :真菌诱导响应元件；CAAT-box : 启动子区通用的增强子；CGTCA :茉莉酸甲酯响应元件；GC-motif :缺氧特异性诱导增强子； LTR :低温响应元件；P-box :GA响应元件；TATA-box :启动子的核心元件；W box :WRKY转录 因子结合元件；RHE :根毛特异表达元件。
[0016] 附图3对照及转pCAM1391Z/TaREXP载体的拟南芥⑶S染色结果； A :未转基因对照幼苗⑶S染色结果，B :转基因幼苗⑶S染色结果，C :B图根部放大效 果图，D :C图箭头所示部分放大效果图，E :转基因植株花序GUS染色结果，F :转基因植株 果荚⑶S染色结果。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1 小麦根特异表达膨胀素基因的表达分析 材料 小麦品种3338的种子正常萌发，一周后收集小麦幼苗的根和叶。在小麦的抽穗期（幼 穗抽出叶鞘一半时)，取小麦穗下节O-Icm分生组织及幼穗，液氮中保存。
[0018] Trizol 法提取小麦 Total RNA 1. 将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末； 2. 待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每IOOmg材料约加入1ml的Invitrogen 公司的TRIzoI提取液，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟； 3. 加入0. 2ml氯仿（chloroform)，剧烈振荡混勾15秒，室温放置10分钟； 4. 4°C，12000rpm 离心 15 分钟； 5. 用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500 μ 1的异丙醇 (1:1体积），充分混匀，-20°C，沉淀30min ; 6. 4°C，12000rpm离心10min，小心弃去上清液； 7. RNA沉淀用Iml的75%乙醇洗涤。4°C，8000rpm离心10min收集沉淀； 8. 重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀； 9. 去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积 (30-50 μ 1)的RNase-free水充分溶解（可放于-80°C长期保存）； 10. 紫外分光光度计及l%Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。
[0019] 注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，10D=40ug/ml。根 据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD26tZOD28tl比值应接近2. 0 (比 值最好在1. 9~2. 1之间）。
[0020] b)用l%Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1 μ I RNA加入3 μ 1的 RNase-free水，加1 μ 1上样缓冲液6 5°C变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3 μ 1的Ikb DNAMarker作为对照。
[0021] 第一链cDNA的合成 米用 PrimeScript? RT-PCR Kit 进行。
[0022] 反应步骤如下： 1. 在Microtube管中配制下列混合液。
[0023] dNTP Mixture (10 mM) 1 μ 1 Oligo dT Primer (2. 5μΜ) ΙμL Total RNA 4 μL Rnase free H2O 4 μ I 2. 在PCR仪上进行变性、退火反应。
[0024] 65 °C 5 min 4°C I min 3. 离心数秒钟使RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。
[0025] 4.在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。
[0026] 上述变性、退火后反应液 10 μ 1 5XPrimerScript? Buffer 4 μ I RNase Inhibitor (40U/μ I) 0. 5 μ I PrimScript? RTase 0.5 μ I Rnase Free dH20 5 μ I 5.在PCR仪上按下列条件进行反转录反应 42 〇C 15-30 min 95 °C 5 min 4 °C PCR反应及电泳 1. 以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下 TaAct-S :5' - GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC -3' TaAct-A :5' - GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC -3' TaEXP-SiS