一种用于霍乱弧菌实时荧光定量pcr检测的多核苷酸、方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一种适用于霍乱弧菌实 时荧光定量PCR检测的质粒标准分子及其构建方法、定量方法和应用。
【背景技术】
[0002] 霍乱弧菌（Vibrio cholerae)是能引起一类以腹泻为主要症状的烈性传染病的一 种致病菌，霍乱弧菌的快速准确鉴定，对该病的预防和治疗有着重要作用。长期以来人们发 现，01群霍乱弧菌能够引起霍乱的流行。0139群霍乱作为新发传染病，1992年在印度和孟 加拉国引起霍乱大流行。1993年以来在我国许多地区也不同程度出现0139群霍乱弧菌引 起的疫情，近几年来，0139群霍乱暴发的比例仍然在不断上升。01群和0139群霍乱弧菌的 致病性取决于其菌株与毒素相关的编码产物，如霍乱弧菌毒素共调菌毛（TCP)，毒素表达调 控蛋白（toxR)等。霍乱的检测方法包括生化培养、血清学试验及噬菌体分型等，这些方法 存在着检出率偏低，检查时间长的缺点，往往达不到疫情控制的需要。荧光定量PCR方法则 可以快速、灵敏地根据霍乱弧菌的特异基因序列的检出情况，在几小时内即可完成菌株的 检出。质粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在PCR定 性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定量分 析的标准曲线。目前质粒DNA分子作为基因检测的标准物质得到了越来越多的深入研究和 应用，但是针对霍乱弧菌实时荧光PCR检测方法的质粒DNA标准物质还是空白。在实际霍 乱弧菌实时荧光PCR时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品，其中 的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确度差， 造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种用于霍乱弧菌实时荧光定量PCR检测的多核苷酸、方 法和试剂盒。
[0004] 本发明的第一方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含霍乱弧菌毒 力调控子toxR的基因序列。
[0005] 在另一优选例中，所述霍乱弧菌毒力调控子toxR的基因序列选自下组：
[0006] (a)序列如SEQ ID NO. : 1所示的多核苷酸序列；
[0007] (b)核苷酸序列与SEQ ID NO. : 1所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0008] (c)序列与SEQ ID NO. :1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为 100bp-654bp(较佳地150-645bp，更佳地200-500bp)的多核苷酸序列；
[0009] (d)与（a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
[0010] 在另一优选例中，所述所述多核苷酸的序列选自下组：
[0011] (a)序列如SEQ ID NO. :2或SEQ ID NO. : 1所示的多核苷酸序列；
[0012] (b)核苷酸序列与SEQ ID NO. :2或SEQ ID NO. :1所示序列的同源性彡95% (较 佳地彡98% )的多核苷酸序列；
[0013] (C)与（a)-(b)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
[0014] 本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包含本发 明的第一方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体序 列。在本发明的一个优选地实施方式中，在本发明第一方面所述的多核苷酸两端设有线性 酶切位点。
[0015] 在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。
[0016] 在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体。
[0017] 在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为霍乱弧菌检测的标准分子（质粒标 准分子）。
[0018] 在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体，并且所述质粒或表达载体 的骨架质粒选自下组：pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScriptIISK和pGEM。
[0019] 在另一优选例中，所述质粒的序列如SEQ ID NO :2所示。
[0020] 本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第一方面所述 的多核苷酸或者本发明第二方面所述的DNA构建物。
[0021] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的引物序列：
[0022] (I)SEQ ID NO. :3 和 SEQ ID NO. :4 所示的引物序列；
[0023] (2) SEQ ID NO. :5 和 SEQ ID NO. :6 所示的引物序列；
[0024] (3) SEQ ID NO. :7 和 SEQ ID NO. :8 所示的引物序列；和
[0025] (4) SEQ ID NO. :9 和 SEQ ID NO. : 10 所示的引物序列。
[0026] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括SEQ ID NO. : 11所示的探针序列。
[0027] 本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的多核苷酸、本发明第二方面 所述的DNA构建物或本发明第三方面所述的试剂盒的用途，用于霍乱弧菌的检测。
[0028] 在另一优选例中，所述检测为非诊断或治疗目的。
[0029] 在另一优选例中，所述检测为荧光定量PCR检测。
[0030] 本发明的第五方面，提供了 一种霍乱弧菌实时荧光定量PCR检测方法，所采用的 标准物质是本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第二方面所述的DNA构建物。
[0031] 在另一优选例中，所述方法中采用的引物对选自下组：
[0032] (I)SEQ ID NO. :3和SEQ ID NO. :4所示的序列构成的引物对；
[0033] (2) SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :6所示的序列构成的引物对；和
[0034] (3) SEQ ID NO. :7和SEQ ID NO. :8所示的序列构成的引物对。
[0035] 在另一优选例中，所述方法中使用的探针序列如SEQ ID NO. : 11所示。
[0036] 本发明的第六方面，提供了一种多核苷酸产品，所述产品包括：
[0037] (i)霍乱弧菌标准品，所述的标准品选自：本发明第一方面所述的多核苷酸和本 发明第二方面所述的DNA构建物；
[0038] (ii)特异性扩增霍乱弧菌序列的引物对，所述引物对选自下组：
[0039] (I)SEQ ID NO. :3和SEQ ID NO. :4所示的序列构成的引物对；
[0040] (2) SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :6所示的序列构成的引物对；和
[0041] (3) SEQ ID NO. :7和SEQ ID NO. :8所示的序列构成的引物对。
[0042] 在另一优选例中，所述的产品为多核苷酸的组合（combination)，较佳地所述组分 ⑴和（ii)是各自独立的。
[0043] 在另一优选例中，所述的广品为试剂盒形式。
[0044] 在另一优选例中，所述的产品中还包括SEQ ID NO. : 11所示的探针序列。
[0045] 本发明的第七方面，提供了一种霍乱弧菌的质粒标准分子的制备方法，其特征在 于，包括以下步骤：
[0046] ①人工合成霍乱弧菌的毒力调控子toxR基因序列，所述毒力调控子toxR表达基 因序列如序列表中SEQ ID NO :1所不；
[0047] ②将步骤①所得霍乱弧菌的毒力调控子toxR表达基因序列克隆至克隆载体上， 得到霍乱弧菌的质粒标准分子。
[0048] 在另一优选例中，所述步骤②中所述克隆载体为质粒pUC19, pUC18, pUC118， pUC119，pBlueScript II SK或pGEM;优选地，步骤②所述克隆载体为pUC19。
[0049] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0050] 图1是本发明质粒标准分子PLW07的图谱。
[0051] 图2是本发明所得质粒标准分子PLW07稳定性检测结果图。
[0052] 图3是利用本发明质粒标准分子建立的实时荧光PCR标准曲线。
【具体实施方式】
[0053] 本发明人通过广泛而深入的研究，获得一段能够用于霍乱弧菌PCR检测的多核苷 酸序列以及与之相配合的引物对，实验结果表明，采用合适的骨架质粒将所述多核苷酸序 列制备为标准质粒分子，并配合本发明的引物对进行实时荧光PCR检测，具有极佳的特异 性和灵敏度，并且稳定性良好。
[0054] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的霍乱弧菌实时荧光PCR检测方法 中缺乏阳性标准品和阳性标准品配置的问题，提供了一种适用于霍乱弧菌实时荧光PCR检 测的质粒标准分子以及该质粒标准分子的构建方法、定量方法和应用。
[0055] 实时荧光PCR检测霍乱弧菌的原理
[0056] 采用实时荧光PCR技术