分离的家族性高甘油三酯血症疾病的lpl新突变致病基因及检测该基因的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学分子生物学领域，具体涉及一种分离的家族性高甘油三酯血症疾 病的LPL新突变致病基因及检测该基因的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 家族性乳糜血综合征（familial chylomicronemia syndrome，FCS，在本文中也可 称为高甘油三酯血症）是一种罕见的常染色体隐性遗传性代谢缺陷，表现为患者体内缺乏 脂蛋白脂肪酶，使血液中的甘油三酯和乳糜微粒浓度升高。脂蛋白脂酶缺乏病症十分罕见， 每百万人中约有一到两例患者，患者体内的血液无法承受任何脂肪颗粒，而且这类患者在 饮食方面禁食正常餐饮，因为患者容易出现各种急性胰腺癌病症。其主要特点是：严重的高 甘油三酯血症伴随以下一个或多个临床症候群：1.孩童时期伴随腹痛出现的高三酸甘油 血症；2、反覆发作的急性胰脏炎；3、皮肤上发瘆般的黄色瘤；4、肝脾肿大。
[0003] 家族性高乳糜微粒血症是起因于脂蛋白脂肪酶（LPL)功能低下或不良，LPL是LPL 基因的产物，在染色体上的位置是8p22。LPL对于饮食中长链脂肪酸代谢至关重要。通常， 这些长链脂肪酸被包装到甘油三酯中，帮助将脂类从肠运送到其他组织，随后LPL将甘油 三酯分解为细胞能够处理的大小。在LPLD患者体内，LPL不能分解甘油三酯。因此，细胞 吸收饮食脂肪不良，使其仍然停留在血液中。一般来说，在用餐后，乳糜隔夜就应该会在血 浆中廓清。家族性高乳糜微粒血症患者体内，因为血浆中乳糜微粒廓清的功能受到损害，会 导致三酸甘油脂堆积在血浆中而使得血浆看起来像牛乳一般。
[0004] 家族性高甘油三脂血症可在10岁前就发生急性胰腺炎。患者胰腺炎反复发作，非 常痛苦，有时通常以少量安全形式分泌的消化酶会一次激活，开始消化胰腺和周围组织，从 而危及生命。FCS患者还有着异常高的血脂水平，使得他们易患早发性糖尿病和动脉粥样硬 化。
[0005] 到目前为止，通过测序筛选已经确定了 LPL、AP0C2、AP0A5, GHIHBP1，LMFl等的突 变均可导致甘油三酯代谢异常。其中以LPL相关突变位点就已达70余个基因位点。但是尽 管现有的关于FCS的致病机理方面的研宄已经较前有明显清晰，但仍存在着相当一部分未 知致病基因位点。已知对于未知致病基因的研宄有利于对家族性乳糜血综合征的诊断提供 可靠依据，还有可能作为治疗家族性乳糜血综合征的药物标靶，用于筛选易感家族性高甘 油三酯血症的生物样品的试剂盒以及筛选治疗或预防家族性高甘油三酯血症疾病的药物， 因此，对家族性高甘油三酯血症疾病的研宄对研发治疗或预防家族性乳糜血综合征的药物 具有很重要的作用。
[0006] 由此可见，能否进一步研宄FCS的致病机理，找出分离的家族性高甘油三酯血症 疾病的LPL新突变致病基因成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。
【发明内容】
[0007] 本发明为了解决上述技术问题，提供一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的 LPL新突变致病基因及检测该基因的试剂盒。本发明通过Sanger法测序验证方法确定的家 族性高甘油三酯血症的致病基因上的新突变。LPL基因的多个突变位点已经在其他发表的 文章中被证实与FCS相关，但本次发现的突变位点为新的，在现有技术中并未被提到。
[0008] 本发明的技术方案包括：
[0009] -种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变致病基因，所述LPL新突变 致病基因的核酸样本的核苷酸序列与编码野生型LPL蛋白的基因，如SEQ ID ΝΟ:1所示的 核苷酸序列相比，第928位碱基发生OT的突变，所述LPL突变致病基因的核酸样本为人工 分离或合成的单链DNA、双链DNA、RNA或DNA与RNA的聚合物。
[0010] LPL基因的新突变基因与原发性结晶样视网膜变性疾病的发病密切相关，从而通 过检测该新突变基因在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感家族性高 甘油三酯血症，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体 是否易感家族性高甘油三酯血症。
[0011] 一种分离的家族性高甘油三酯血症疾病的LPL新突变体多肽，其氨基酸序列与 SEQ ID N0:2相比，具有P.C310R突变，即343位的Y突变为D。该多肽是由前述分离的编 码LPL突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物 样品是否易感家族性高甘油三酯血症，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可 以有效地预测生物体是否易感家族性高甘油三酯血症。
[0012] 本发明通过Sanger外显子测序和基因突变验证的方法确定了家族性高甘油三酯 血症新的致病基因突变（NM_〇〇〇237. 2:c. 928C>T NP_000228. l:p. C310R)。LPL基因突变基 因，其与SEQ ID NO :1相比，该核酸具有p.C310R突变。在本文中所使用的表达方式"编码 LPL突变体的核酸"，是指与编码LPL突变基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别 限制，可以是任何包含与LPL突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷 酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。优选地，所述的编码LPL突变基因的核酸样 本为DNA。
[0013] 野生型LPL基因的m RNA序列具有1468nt，翻译后的LPL蛋白质含有475个氨基 酸，具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。发明人发现的新突变体与SEQ ID NO :1相比，具 有p. C310R突变，即相对于野生型LPL蛋白的基因，本发明的LPL基因突变基因的cDNA中 第928位的T突变为C，由此，其所编码的产物与野生型LPL蛋白（SEQ ID N0:1)相比，具 有p. C310R突变，即343位的Y (酪氨酸）突变为D (天冬氨酸）。
[0014] 已知，LPL基因所编码全长28. 188kp，包含10个外显子，编码产物为475个氨基酸 的蛋白质，在脂肪酸代谢中发挥重要作用，基于一些早期的LPL同源模型的分析和体内体 外实验证实，很多氨基酸的缺失和替代导致转录蛋白严重的结构变化，酶活性的丧失，影响 LPL的活性，使其不能发挥正常的功能。
[0015] 一种筛选易感家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法，包括以下步骤：从所述 生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO :1相比，具有p. C310R突变是所述生物样品易感家族性高甘油三酯血症疾病的指示。
[0016] 所述的生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织中的至少一种。
[0017] 所述核酸样本为从生物样品中直接提取的全基因组DNA、全基因组中包含LPL编 码序列的一部分、从生物样品中提取的总RNA或从生物样品中提取的mRNA中的任一种。
[0018] 确定所述核酸样本的核酸序列的方法为，先设计引物扩增LPL外显子的特异性引 物，对所述核酸样本进行PCR扩增，然后对得到的扩增产物进行Sanger测序。
[0019] LPL外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些LPL 外显子特异性引物具有SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列：5'GCCGAGATACAA TCTTGGTG-3'/5' GCATGATGAAATAGGACTCC-3'。
[0020] 一种筛选易感家族性高甘油三酯血症膜变性疾病的生物样品的方法。该筛选易感 家族性高甘油三酯血症的生物样品的方法可以包括以下步骤：生物样品提取核酸样本。生 物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品LPL是否存 在突变的核酸样本即可。生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此， 可以方便地进彳丁取样和检测，从而能够进一步提尚筛选易感家族性尚甘油二醋血症疾病的 生物样品的效率。这里所使用的术语"核酸样本"应做广义理解，其可以是任何能够反映生 物样品中