[0050]1.5重组载体的转化与鉴定
[0051]取连接产物I μ I加入到冰浴的100 μ I ToplO感受态细胞中，冰浴30min。然后42°C热激60s，冰浴2min。加入200 μ I LB液体培养基，于37°C下200rpm培养lh。将菌液全部涂布于含有50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上，于37°C培养12_16h。
[0052]挑选单菌落于450 μ I含有50 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37 °C培养4h。之后进行菌液PCR，反应结束后取5μ I反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定阳性克隆，送至测序公司(上海生工)测序，测序结果无误后用质粒小提试剂盒(购自天根)提取质粒。
[0053]1.6阳性载体的转化
[0054]将重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)感受态细胞中，于含有50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上37°C培养12_16h获得单菌落。挑取5个单菌落于5ml含有50 μ g/ml卡那霉素LB液体培养基中培养过夜，用甘油保存菌种，获得以pET-28b为载体，以E.coli BL21 (DE3)为宿主菌构建的耐高温木聚糖内切酶XynllA工程菌。
[0055]1.7耐高温木聚糖内切酶XynllA的诱导表达
[0056]重组菌按1%的接种量转接到10ml含50 μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基，370C 200rpm振荡培养至0D600达到0.6左右时，取出培养基冰浴lOmin。加入IPTG至终浓度0.1mM, 16°C 160rpm振荡培养12_16h。之后在4°C条件下4000rpm离心15min收集菌体，加入 3ml Binding Buffer (50mM Tris-HCl ρΗ7.5, 300mMNaCl)重悬菌体。用超声破碎仪超声破碎后，4°C条件下12000rpm离心15min,吸取上清。超声上清在65°C下水浴30min,去除热不稳定蛋白，4°C条件下12000rpm离心20min所得上清即为粗酶液。
[0057]实施例2:重组耐高温木聚糖内切酶XynllA的纯化
[0058]利用重组酶C，N_末端含有组氨酸标签，N1-NAT亲和层析对重组蛋白进行纯化。用含有 150mM 咪唑的 Elut1n BufferC50mM Tris-HCl pH7.5，300mMNaCl)洗脱与重组蛋白结合的N1-NAT，收集洗脱液。收集到的洗脱液加入处理过的透析袋，在柠檬酸缓冲液(pH6.0)中透析24h去除咪唑和换缓冲液。将去除咪唑后的酶液进行葡聚糖凝胶层析，出现波峰时收集蛋白，凝胶层析图谱如图1A所示。用超滤管将样品浓缩至100 μ I。进行SDS-PAGE电泳检测目的蛋白纯度，可看到单一的电泳带，如图1B所示。
[0059]实施例3:重组耐高温木聚糖内切酶XynllA最适反应温度和最适反应pH测定
[0060]通过预实验，即XynllA与底物的反应时间设定为30s、60s、90s、120s、150s、180s、240s和360s，用PHBAH法测定不同反应时间下的还原糖含量，做出还原糖生成量与反应时间的曲线。确定重组耐高温木聚糖内切酶XynllA在反应时间是90s时能保持最快反应速率。
[0061]3.1最适反应pH
[0062]5 μ I适当稀释的酶液分别加到95 μ 11%底物的ρΗ4.0-8.5 (每个pH间隔0.5)的柠檬酸缓冲液中，在75°C反应条件下测定重组耐高温木聚糖内切酶XynllA的活力，反应时间90s。用PHBAH法测定各个反应pH下的还原糖含量。测得最适反应pH为6.0，且在5_7的反应条件下，其活力仍能达到60%以上。如图2A所示。
[0063]3.2最适反应温度
[0064]5 μ I适当稀释的酶液加到95 μ 11%底物的ρΗ6.0的柠檬酸缓冲液中，在40_100°C反应条件下测定重组耐高温木聚糖内切酶XynllA的活力，反应时间90s。用PHBAH法测定各个反应温度下的还原糖含量。测得XynlIA最适反应温度为75°C，且在60_85°C的反应条件下，其活力仍能达到60%以上。如图2B所示。
[0065]实施例4:重组耐高温木聚糖内切酶XynllA的pH稳定性和热稳定性
[0066]4.1pH 稳定性
[0067]将XynllA酶液在ρΗ4.0-8.5 (每个pH间隔0.5)的条件下，室温放置17h后测定重组耐高温木聚糖内切酶XynllA的活力，反应时间90s。用PHBAH法测定各个反应pH下的还原糖含量。结果如图3A所示，重组蛋白在pH4.0-8.5条件下均能维持较好的活性。
[0068]4.2热稳定性
[0069]重组酶XynllA 在 70、75、80°C 下，处理 0min、30min、lh、2h、3h、4h、6h。在 75。。，PH6.0的条件下测定其剩余活力。结果如图3B所示，重组酶在70°C时稳定性非常好，在75°C时，其半衰期为3h。
[0070]实施例5:重组耐高温木聚糖内切酶XynllA特异性酶活测定
[0071]重组酶XynllA在75 °C、pH6.0的条件下，加入到75°C预热5min的榉木木聚糖(2.5mg/ml)溶液中反应90s。用PHBAH法测定还原糖含量。木聚糖酶活力单位定义:在特定条件下(最适反应温度和pH)，每分钟产生lymol木糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。
[0072]XynllA 特异性酶活为 1752.0IU/mg。
[0073]实施例6:重组耐高温木聚糖内切酶XynllA水解榉木木聚糖和低聚木糖。
[0074]取适当稀释倍数的XynllA酶液5 μ 1，分别加入到50 μ 11%的榉木木聚糖和2%低聚木糖的底物溶液中，在70°C，pH6.0下进行水解反应4h，水解产物进行薄层层析检测。适当控制加酶量可以生成低聚木糖，如图4A所示，加0.01 μ g酶后水解产物为低聚木糖，而加I μ g酶后的水解产物主要为木二糖和少量的木糖。重组耐高温木聚糖内切酶XynllA水解榉木木聚糖和低聚木糖的最终水解产物均主要为木二糖及少量的木糖，如图4B所示。
[0075]实施例7:利用重组耐高温木聚糖酶XynllA降解预处理玉米芯
[0076]称取0.1g经高温蒸煮的玉米芯渣，加5ml pH6.0的柠檬酸缓冲液溶解，配制成2%的悬浮液。加入一定量的重组耐高温木聚糖酶XynllA,于7(TC、pH6.0条件下300rpm振荡水解，每隔一段时间取样(I，3，6，12h) 50ul，样品13400rpm离心20min，上清置于4°C保存。取水解样品进行薄层层析反应，检测生成产物的成分。结果显示，随水解时间的增加，水解产物中木糖、阿拉伯糖、和木二糖的含量都随之增加，木三糖、木四糖和木五糖却随着反应的深入逐渐减少，水解12h时产物以木二糖为主，含有少量木糖和阿拉伯糖。实验组中酶解产物木寡糖含量为93.2%，木二糖含量超过50%，木糖含量为5.2%，木聚糖降解率达到91.7%。
[0077]实施例8:利用重组木聚糖酶XynllA降解甘蔗渣
[0078]用1L10M的NaOH溶液甘蔗渣浸泡40h以上，用4层纱布过滤，滤液用浓盐酸调制pH5.0,13000rpm离心1min,离心沉淀洗漆干净,烘干后磨成粉末过100目筛。称取0.5g溶于20%Na0H溶液，再用稀盐酸中和，13000rpm离心1min去上清，沉淀用pH6.0柠檬酸缓冲液定容至50ml。实验组中加入一定量的重组耐高温木聚糖酶Xynl 1A，于70°C、pH6.0条件下300rpm振荡水解12h。水解样品13400rpm离心20min,上清液用PHBAH法测定还原糖含量，用薄层层析法分析甘蔗渣木聚糖水解液中产物的成分。结果显示，酶解12h后，酶解液主要成分为木糖和木二糖。酶解产物木寡糖含量为90.3%，木二糖含量超过50%，木糖含量为3.4%，木聚糖降解率达到86.3%。
[0079]SEQUENCE LISTING
[0080]<110>中国科学院过程工程研究所
[0081]<120> 一种耐高温木聚糖酶基因及其蛋白表达与应用
[0082]<130>耐高温木聚糖内切酶基因xynllA核苷酸序列及氨基酸序列
[0083]<160>2
[0084]<170>PatentIn vers1n 3.3
[0085]〈210〉I
[0086]<211>996
[0087]〈212〉DNA
[0088]〈213〉热解纤维素菌(Caldicellulosiruptorkronotskyensis)
[0089]〈220〉
[0090]<221> gene
[0091]〈222〉 (1)..(996)
[0092]〈223〉耐高温木聚糖内切酶基因xynllA序列
[0093]〈400〉I
[0094]gcaataaccctcacatccaatgctagtggaacttatgatggctattactatgaattgtgg 60
[0095]aaggattctggaaatacaacaatgacagttgacacaggaggaagatttagctgtcaatgg 120
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