专利名称：一种使用盐析和透析分离纯化贻贝粘蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离纯化蛋白质的方法，具体地是涉及一种使用盐析和透析法分 离纯化贻贝粘蛋白的方法。
背景技术：
贻贝粘蛋白(Mussel adhesive protein, MAP)，也叫紫贻贝足丝蛋白(Mytilus edulis foot protein, Mefp)来自海洋贝类紫贻贝，M;^7^e^to，它有在近海耐受波浪影响的 能力，它在特殊腺体内生成和储存一种蛋白胶，通过足丝释放到岩石一类的固体表面 上，形成抗水的结合，从而将自己固定。在玻璃上的研究显示，蛋白胶形成了斑，从 斑延伸开，有很强的抗张强度(106-10、ewtoirmetef2)，而斑内物质包含了贻贝粘蛋 白MAP。
贻贝粘蛋白含有L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)，它由酪氨酸酶对酪氮酸残基 的作用形成。L-DOPA残基由于氧化反应而相互交联，交联反应导致了贻贝和特殊表 面纤维内强而持久的胶接，其生物粘附的机理很有趣。贻贝粘蛋白粘附对人没有毒性 和免疫原性，结合能力和寿命不受水的影响，作为医用手术尤其是眼科手术胶己经引 起注意。
全世界每年进行1100万例白内障手术，我国白内障的发病率非常高，50岁以上 人群中白内障发病率29.64%， 70岁以上人群发病率高达60%。随着社会老龄化的加 剧，这一数字还会i:升。目前医生可以用两种闭和方式结束眼科手术让伤口自行愈 合或是用尼龙线缝合切口，每种闭合方法都各有缺点自愈有感染和眼内液体泄露的 危险；缝合会有感染发炎及血管发育异常的危险。而贻贝粘蛋白贻贝粘蛋白能在低浓 度下交联，并形成可注射到不规则形状部位的低粘性液体，这种溶液可凝固而填充到 指定空间，在几分钟内可封闭切口，少于缝合所需时间。贻贝粘蛋白还形成了一个不 可破坏的封条，在大于正常人眼压12倍的压力下不会使眼内液体发生泄露。贻贝粘蛋 白具有和眼角膜近似的折射率，不会干扰光线到达视网膜。另外，贻贝粘蛋白的生物降解性质使其对环境很友好，也可用于其他领域，如通 用的生化粘接试剂、医用组织粘接及密封剂，医用愈伤基质，牙医粘接和密封剂，医 用设备表面涂层试剂，水下作业设备涂层等。
盐析和透析是利用蛋白质的物理化学性质，以非色谱的方法进行纯化，设备成本 低、实验材料成本低、耗时少、获得的目标产品浓度高勿需浓縮。
发明内容
本发明的目的在于克服色谱方法纯化贻贝粘蛋白设备和材料成本高的问题，采用 盐析和透析的方法，提供一种快速、低成本、高浓度的贻贝粘蛋白分离纯化方法。 本发明的目的是通过如下的技术方案实现的。
本发明提供的使用盐析和透析为核心的分离纯化贻贝粘蛋白的方法，包括如下步
骤
1) 以0.5-2.5%高氯酸或/和1-10%乙酸为提取溶剂，100 g贻贝足丝加300-1000 ml 提取溶剂，10-25。C浸提10-20 min，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其均匀 悬浮于提取溶剂中；
2) 以10000-16000 r/min离心30-50 min或以45 pm滤膜过滤去除残渣，保留上
清；
3) 用1-6倍体积的6-12 M的氯化钠在15-25 。C F盐析1-6 h;
4) 4°C， 10000-15000 rpm下离心3-10 min，收集沉淀，用1-3%的乙酸溶解;
5) 4。C， 10000-15000 rpm离心3-10min去除其中不溶成分用1-3%的乙酸再次溶
解；
6) 用0.5-3。/。的乙酸4。C透析(透析袋截留分子量12000) 3-10 h， 4 。C保存；
7) 从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白采用12-20%浓度十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，硝酸银染色，10-25 。C染色2-4 h，以高分子量标准蛋 白质标记，确认目标蛋白质分子量为130kD;
8) 四氮唑蓝(NBT)特异性染色鉴定贻贝粘蛋白采用12-20%浓度乙酸-尿素 (Acetic acid-Urea)聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE),染色液采用四氮唑蓝-氨基
乙酸溶液(pH10)， 10-25 。C染色1-3 h，贻贝粘蛋白将被特异性显色；
9) 用C8反相键合相硅胶色谱柱或Source聚苯乙烯柱分析贻贝粘蛋白纯度以 乙腈-水为流动相等度洗脱，280 nm检测。本发明提供的使用以盐析和透析为核心的分离纯化贻贝粘蛋白的方法，提供了一 种快速、低成本、高浓度的贻贝粘蛋白分离纯化方法。
具体实施例方式
实施例l、以高氯酸提取、盐析和透析分离贻贝粘蛋白
1) 以0.5%高氯酸为提取溶剂，100 g贻贝足丝加300 ml提取溶剂，25°C浸提10 min，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其均匀悬浮于提取溶剂中；
2) 以10000 r/min离心30 min去除残渣，保留上清；
3) 用2倍体积的6-12 M的氯化钠在15-25 。C下盐析1-6 h;
4) 4'C， 10000rpm下离心3min，收集沉淀，用2%的乙酸溶解；
5) 4°C，10000 rpm离心3 min去除其中不溶成分用2%的乙酸再次溶解；
6) 用2。/。的乙酸4。C透析(透析袋截留分子量12000) 5 h， 4。C保存；
7) 从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白采用15%浓度十二烷基磺酸钠(SDS)-聚 丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，硝酸银染色，25。C染色2h，以高分子量标准蛋白质标 记，确认目标蛋白质分子量为130kD;
8) 四氮唑蓝(NBT)特异性染色鉴定贻贝粘蛋白采用15%浓度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea)聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE),染色液采用四氮唑蓝-氨基乙酸溶液
(pH10)， 25。C染色2h，贻贝粘蛋白将被特异性显色-,
9) 用C8反相键合相硅胶色谱柱分析贻贝粘蛋白纯度C8色谱柱4.6x250 mm， 5pm， 300A，以乙腈-水(10-90)为流动相等度洗脱，280nm检测。
实施例2、以乙酸提取、盐析和透析分离贻贝粘蛋白
1) 以10%乙酸为提取溶剂，100 g贻贝足丝加1000 ml提取溶剂，25°C浸提，20 min，使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其均匀悬浮于提取溶剂中；
2) 以45pm滤膜过滤去除残渣，保留上清；
3) 用3倍体积的10 M的氯化钠在25 。C下盐析6 h;
4) 4'C， 15000rpm下离心3 min，收集沉淀，用3%的乙酸溶解；
5) 4'C， 15000 rpm离心3 min去除其中不溶成分用3%的乙酸再次溶解；
6) 用3。/。的乙酸4。C透析(透析袋截留分子量12000) 10 h， 4。C保存；7) 从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白采用12%浓度十二烷基磺酸钠(SDS)-聚 丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),硝酸银染色，25。C染色2h，以高分子量标准蛋白质标 记，确认目标蛋白质分子量为130kD;
8) 四氮唑蓝(NBT)特异性染色鉴定贻贝粘蛋白采用12%浓度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea)聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE),染色液采用四氮唑蓝-氨基乙酸溶液
(pH10)， 25。C染色2h，贻贝粘蛋白将被特异性显色；
9) Source聚苯乙烯柱分析贻贝粘蛋白纯度以乙腈-水(15-85)为流动相等度洗 脱，280nm检测。
权利要求
1、一种使用盐析和透析分离纯化贻贝粘蛋白的方法，提供一种快速、低成本、高浓度的贻贝粘蛋白分离纯化方法。
2、 如权利要求1所述的使用盐析和透析分离纯化贻贝粘蛋白的方法，包括如下的 步骤1) 以0.5-2.5%高氯酸或/和1-10%乙酸为提取溶剂，100 g贻贝足丝加300-1000 ml 提取溶剂，10-25。C浸提10-20 min,使用搅拌器将冷冻的贻贝足丝高速打碎使其均匀 悬浮于提取溶剂中；2) 以10000-16000 r/min离心30-50 min或以45 pm滤膜过滤去除残渣，保留上清；3) 用1-6倍体积的6-12 M的氯化钠在15-25 。C下盐析1-6 h;4) 4°C， 10000-15000 rpm下离心3-10 min，收集沉淀，用1-3%的乙酸溶解；5) 4°C， 10000-15000 rpm离心3-10min去除其中不溶成分用1-3%的乙酸再次溶解；6) 用0.5-3。/。的乙酸4。C透析(透析袋截留分子量12000) 3-10 h， 4。C保存-，7) 从分子量的角度鉴定贻贝粘蛋白采用12-20%浓度十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，硝酸银染色，10-25 。C染色2-4 h，以高分子量标准蛋 白质标记，确认目标蛋白质分子量为130 kD;8) 四氮唑蓝(NBT)特异性染色鉴定贻贝粘蛋白采用12-20%浓度乙酸-尿素 (Acetic acid-Urea)聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE),染色液采用四氮唑蓝-氨基乙酸溶液(pH10)， 10-25。C染色l-3h，贻贝粘蛋白将被特异性显色；9) 用C8反相键合相硅胶色谱柱或Source聚苯乙烯柱分析贻贝粘蛋白纯度以 乙腈-水为流动相等度洗脱，280 nm检测。
全文摘要
本发明涉及一种使用盐析和透析分离纯化贻贝粘蛋白的方法。盐析和透析是利用蛋白质的物理化学性质，以非色谱的方法进行纯化，克服色谱方法纯化贻贝粘蛋白设备和材料成本高的问题，提供一种快速、低成本、高浓度的贻贝粘蛋白分离纯化方法。采用强酸提取，以盐析和透析进行纯化，采用乙酸-尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过四氮唑蓝特异性显色鉴别贻贝粘蛋白，以反相色谱定量纯度。
文档编号C07K14/435GK101585874SQ20091008756
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者孟桂凤, 邢思亮 申请人:北京康铭优盛生化技术有限公司