专利名称：一类针对半胱氨酸蛋白酶c1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针及其合成、纯化的方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物分子学领域。
背景技术：
基于酶活性的化学小分子探针(activity-based probes, ABPs)是近年来兴起的新一代功能蛋白检测探针，主要是用有机化学的方法人工合成靶向小分子探针与特定酶蛋白结合，实现对特定酶家族的标识和研究。这类小分子探针通常包括3个部分一个可以和酶共价交联的反应基团；一个可探测的标签基团；及一个能够把反应基团和标签基团连接在一起的联接基团。ABPs的工作原理是带有反应基团和标签基团的小分子探针与待研究的蛋白质组作用，利用小分子探针中的反应基团能够特异性共价结合蛋白质组中的某类特定酶家族的特性，将化学小分子连接到感兴趣的特定靶酶上。由于探针的反应基团是根据特定酶家族的普遍反应催化机理设计，因此它们能够识别酶是否具有活性，可以选择性地只标记具有活性的特定酶家族成员，而与其它类酶或那些没被激活的特定酶家族成员都不能反应。根据标签基团的不同，基于酶活性的化学小分子探针(ABPs)还可以分为含有荧光的荧光小分子探针、含有放射性的放射性探针和含有特定亲合基团的探针。其中，基于酶活性的荧光小分子探针因其所带的荧光基团具有检测方便、快速，ng级的检测灵敏度，环境污染小等优点在近几年来愈来愈受到人们的关注基于酶活性的化学小分子探针(ABPs)与其它蛋白质组学研究技术相比，其的优点主要表现在1)直接从功能角度切入蛋白质研究，而不是仅对蛋白质进行定性定量鉴定。2)可实现基于活性，而不是基于丰度的蛋白质检测。3)分子量小，避免体积过大而有可能影响其在细胞内的分布及与蛋白质的相互作用的问题。目前，基于酶活性的化学小分子探针(ABPs)已成功用于针对多种靶酶家族的功能蛋白质组学研究。其中组织蛋白酶家族是一个重要的研究对象。组织蛋白酶绝大多数成员属于半胱氨酸蛋白酶Cl家族蛋白酶，现有的研究表明组织蛋白酶家族在恶性肿瘤的形成，转移和发展过程中有多重生理效应，并在多种恶性肿瘤中高表达，因此近些年来成为研究的热点之一。利用基于酶活性的小分子探针对组织蛋白酶家族的研究还处于起步阶段， 很多地方有待改进，主要表现在现有的大多数ABPs因本身所含的标识基团比较大，不能够穿透细胞膜进入细胞内，因此只能实现细胞外(inVitro)如细胞或组织勻浆中对组织蛋白酶的检测。而细胞或组织的化学和/或物理降解可能改变内生酶和酶阻 遏物的浓度及其在亚细胞的分布，降解后获得的细胞或组织勻浆中的蛋白质组最多只能接近活细胞内蛋白质的功能状态，丢失了很多重要信息。目前已有的能够实现活细胞内(in Vivo)的组织蛋白酶标记的荧光探针只有采用氟硼荧(BODIPY)染料或者Cyanine染料系列(CY3，CY5)探针，但是其透膜速度慢，不能够实现实时成像，同时因为染料种类的限制，检测光谱受限，使用的范围小，并且Cyanine 5染料的价格非常昂贵，严重限制其推广应用。另外，因这种探针也不能携带生物素等标记物实现对目标蛋白的富集和蛋白质组学研究。
发明内容
本发明的目的是解决上述问题而提供了一类针对半胱氨酸蛋白酶Cl家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针及其合成，纯化方法和应用，这一类透膜荧光小分子探针可以在活细胞中实现对半胱氨酸蛋白酶家族Clfamily蛋白酶的实时标记成像，并且能够目标蛋白酶进行蛋白质组学研究。本发明所采用的技术方案是一类针对半胱氨酸蛋白酶Cl家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针，具有式I所示的结构
权利要求
1.一类针对半胱氨酸蛋白酶Cl家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针，其特征在于，具有式I所示的结构
2.一类针对半胱氨酸蛋白酶Cl家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针，其特征在于，具有式II所示的结构
3.根据权利要求1所述的一类针对半胱氨酸蛋白酶Cl家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针，其特征在于，所述R荧光基团为罗丹明或者5-羧基荧光素。
4.根据权利要求1所述的一类针对半胱氨酸蛋白酶Cl家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针的合成方法，包括以下步骤a)从连接部分2开始，采用N-[(9H-芴-9-甲氧基)羰基]-N'_[(2_丙烯氧基)羰基]-L-赖氨酸为起始物，将赖氨酸连接上固相肽合成树脂，运用Fmoc固相合成法，在氨基端依次连接侧链为Pbf保护八个精氨酸，氨基己酸，连接罗丹明或者5-羧基荧光素；b)去掉连接部分2的侧链保护基，运用Fmoc固相合成法，依加上酪氨酸，异亮氨酸；c)反应基团的Epoxide的合成以及连接上探针，反应基团的Epoxide合成，从L(+)-酒石酸二乙酯开始合成环氧琥珀酰对硝基苯酯，将环氧琥珀酰对硝基苯酯连接到探针的骨架分子上。
5.权利要求2所述的一类针对半胱氨酸蛋白酶Cl家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针的合成方法，包括以下步骤a)从连接部分2开始，将赖氨酸连接上固相肽合成树脂，运用Fmoc固相合成法，在氨基端依次连接侧链为Pbf保护八个精氨酸，氨基己酸，侧链联结有Biotin的赖氨酸，5-羧基荧光素；b)去掉连接部分2的侧链保护基0ALLYL，运用Fmoc固相合成法，依次加上酪氨酸，异亮氨酸；c)反应基团的Epoxide的合成以及连接上探针，反应基团的Epoxide合成，从L(+)-酒石酸二乙酯开始合成环氧琥珀酰对硝基苯酯，将环氧琥珀酰对硝基苯酯在DIEA的情况下连接到探针的骨架分子上。
6.权利要求1或2任意一项所述的一类针对半胱氨酸蛋白酶Cl家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针的纯化方法，包括以下步骤a)在上述合成步骤完成之后，用TFA EDT TIS H2O = 95 2 1 2处理，去掉精氨酸的Pbf侧链保护，并且将探针从树脂上切下来；b)反应体系中加入NMM，调PH至中性，用冰乙醚沉淀产物，将产物再用冰乙醚洗涤两次；c)得到的粗产物用C18反相硅胶柱进行柱层析，洗脱液使用含0.01%醋酸的H2CVMeOH体系，通过质谱分析确定产物，收集产物组分后冷冻干燥，浓缩得到所需的产物晶体。
7.权利要求1或2任意一项所述的一类针对半胱氨酸蛋白酶Cl家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针的应用，其特征在于，所述一类针对半胱氨酸蛋白酶Cl家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针I、II用于活细胞内的目标蛋白酶的标记和检测以及对活细胞内标记后的目标蛋白酶的纯化和质谱鉴定。
全文摘要
本发明公开了一类针对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的透膜荧光小分子探针的合成，纯化以及应用，属于生物分子学领域。这一类透膜荧光小分子探针可以在活细胞中实现对半胱氨酸蛋白酶C1家族蛋白酶的实时标记成像，并且能够对目标蛋白酶进行蛋白质组学研究。
文档编号C07D407/12GK102174319SQ20111003705
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月13日 优先权日2011年2月13日
发明者张玉慧, 樊锋凯, 骆清铭 申请人:华中科技大学