专利名称：血管及炎性疾病中半胱氨酸蛋白酶豆荚蛋白的表达的制作方法
技术领域：
00021本发明涉及豆荚蛋白(legumain)以及豆荚蛋白在调节血 管疾病和炎性疾病中的用途。本发明另外涉及被指定为ZB-1的豆 荚蛋白的新剪接变体。本文公开的方法和药学组合物用于诊断、预 测、监测、治疗、减轻和/或预防血管疾病和炎性疾病。
相关
背景技术：
半胱氨酸蛋白酶(CPs)是哺乳动物中基于酶活性位点 的结构组织被分类为蛋白家族的普遍存在的酶的相关类(Dickinson (2002) O". T ev. (9ra/说o/. MW.13:238-75)。哺乳动物CP家族包 括，尤其是由与木瓜蛋白酶具有结构和进化共性的蛋白酶成员组成 的CA家族，以及含有半胱氨酸蛋白酶和豆荚蛋白(W.)的CD家 族。豆荚蛋白也称为天冬酰胺酰基内肽酶(AEP)或破骨细胞抑制肽 2 (OIP-2) (Choi et al. (2001)丄5o"eMz打er.i 仏16(10):1804隱11)，是 由尸7^C7基因编码的(Tanaka et al. (1996) CW/ 74:120-23),是CD家族相对新的成员，具有对底物序列Pl位点的 天冬酰胺酰基键水解的严格特异性(Chen et al. (1997) /说o/. C/zem. 272:8090-98)。豆荚蛋白属于包括半胱氨酸蛋白酶和分离酶 (separase)的半胱氨酸蛋白酶的C13家族(Ishii (1994)齒g 五^ymo/. 244:604-15)。豆荚蛋白是独特的溶酶体半胱氨酸蛋白酶，
5与组织蛋白酶所属的溶酶体蛋白酶的木瓜蛋白酶家族没有同源性。 在生理条件下，豆荚蛋白出现在酸性核内体/溶酶体区室，并在细
胞内蛋白质降解中起作用(Shirahama-Nodaetal. (2003)/. Wo/. CAem. 278:33194-99)。豆荚蛋白可以在抗原提呈中发挥作用(Manoury et al. (1998) A^ww 396:695-99),虽然豆荚蛋白缺陷小鼠在恒定链的抗原 提呈或II类MHC产物的成熟中没有表现出缺陷(Maehr et al. (2005) /./應画/. 174:7066-74)。豆荚蛋白寻皮某些某些胱抑蛋白(cystatin)(例如 ovocystatin和胱抑蛋白C和M (参见例如PCT公开No. WO 00/064945和Vigneswaran et al. (2006) Life Sciences 78:898-907))， 以及巯基依赖性酶抑制剂(例如石典乙酸、石典乙酰胺和马来酰亚 胺)，但不受木瓜蛋白酶抑制剂E64 (反式-环氧基琥珀酰-L-亮氨 酰基_(4_胍基)丁烷)、亮抑酶肽和Z-Phe-Ala-CHN2 (/丄；Rozman-Pungercar et al. (2003) CW/"e"//2 _Dz# 10:881-88; Vigneswaran et al" 犯pra; Chen et al. (1998)犯; m)的影响。某些氟代和氯代曱基酮肽半 胱氨酸蛋白酶抑制剂(如在Rozman-Pungercar et al., ra; ra中z〉开的 那些)，和抗豆荚蛋白抗体(Choi et al. (1999) 也抑制豆荚蛋 白活性。,和卣代曱基酮，如Niestroj et al., w; ra中公 开的那些),以及其他合成物(参见例如U.S.专利No. 6,004,933; PCT/^开No. WO 03/016335和WO 99/048910; Yamane et al. (2002) 5/oc/ 'm.说op/^. Jcto 1596:108-20 (,>开了对氯汞苯石黄酸、Hg2+ 和Cu2+抑制豆荚蛋白)；以及Li et al., w/ ra (公开了可逆AEP抑 制剂F,-AENK酰胺))。斑块破裂可能导致由破裂部位血小板聚集引起的血栓形 成，血管的部分或完全闭塞，以及由血栓掺入粥样斑块引起的动脉 粥样硬化性病变的发展。动脉中血栓的形成和累积使已由粥样斑块 的存在所诱发的动脉狭窄加剧，从而阻碍血流(即缺血或中风)到 下游组织，如心脏病或肾脏(W.)。血小板^f汙生生长因子(PDGF)、 胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF) a和(3 、巨噬细胞集 落刺激因子(M-CSF)、凝血酶、巨噬细胞趋化蛋白l(MCP-l)以及血 管紧张素II是表征早期动脉粥样硬化、血管炎症以及动脉粥样硬化 血栓形成)的内皮细胞破裂部位的活化血小板、巨噬细胞和激 活的内皮细胞产生的促分裂素。本发明提供了各种与哺乳动物豆荚蛋白如人、小鼠、和 猪豆荚蛋白，以及哺乳动物豆荚蛋白剪接变体，尤其是新型剪接变 体ZB-1有关的方法和组合物。在本研究中，本发明人记载了动脉 粥样硬化的小鼠模型中豆荚蛋白的基因和蛋白表达，并在人动脉粥 样硬化组织中进一步表征豆荚蛋白表达。此外，本发明人报道巨噬 细胞表达的豆荚蛋白通过蛋白酶依赖以及非依赖机理，对动脉粥样 硬化起作用。在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了包含 SEQIDNO:12氨基酸序列、SEQ ID NO:12的氨基酸21至323，或 SEQ ID NO:12的氨基酸25至323的多肽。在另一实施方案中，本 发明提供了 SEQ ID NO:ll核酸序列编码的多肽。在另一实施方案
10中，本发明提供了由高严格条件下与SEQ ID NO:ll核酸序列的互 补序列杂交的核酸序列编码的多肽。在其它实施方案中，提供了与 这些序列的 一种或多种具有高序列 一致性的多肽。在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了特异 性结合哺乳动物ZB-1多肽或哺乳动物ZB-1多肽片段的抗体或其抗 原结合片段。在另一实施方案中，所述哺乳动物ZB-1多肽或哺乳 动物ZB-1多肽片段来自人。在另一实施方案中，所述人ZB-1多肽 包含SEQ ID NO:12氨基S吏序列或SEQ ID NO:12氨基酸序列的活 性片段。在另一实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是拮抗的 或激动的。
0017]在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供包含治 疗有效量的ZB-1和药学上可接受载体的药物组合物。在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了降低 细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌水平的方 法，其包含使所述细胞或细胞群与足以降低细胞或细胞群中豆荚蛋 白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌水平的量的豆荚蛋白拮抗剂和/ 或ZB-1拮抗剂接触。在另一实施方案中，所述细胞或细胞群包括 巨噬细胞、单核细胞、血管内皮细胞、泡沫细胞，或单核细胞、巨 喧细胞、血管内皮细胞和/或泡沫细胞的混合物。在另一实施方案 中，所述细胞或细胞群分泌豆荚蛋白和/或ZB-1。在另一实施方案 中，所述细胞或细胞群包含动脉内皮细胞或肾近端小管细胞。在另 一实施方案中，所述细胞或细胞群来自炎性细胞浸润到动脉内膜中 的部位。在另一实施方案中，所述细胞或细胞群来自动脉新内膜病 变区域。在至少一个实施方案中，此处公开的本发明提供了监测
患者血管疾病或炎性疾病的方法，其包含于第一时间点测量患者 的细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水 平；以及于第二时间点测量患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平，其中与第一时间点患者细^^或细胞 群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平相比，第二时 间点患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌 的水平更低，表明血管疾病或炎症疾病的严重程度已降低。
本发明的或相关的分离多核苷酸可用作鉴别和分离具有 编码与所述公开多核苦酸同源多肽的序列的DNA的杂交纟笨针以及
引物。这些同源物是从与所述公开多肽或多核苷酸不同种，或是相 同种，分离得到的多核苷酸和多肽，但与所述公开多核苷酸和多肽 具有大量序列相似性。优选地，多核苷酸同源物与所述^^开的多核 苷酸具有高序列一致性，例如至少50%序列一致性(更优选地， 至少75%—致性，如80%或85%—致性；最优选地，至少90% — 致性，如92%、 94%、 96%、 98%或99%—致性)，而多肽同源物 与所述公开的多肽具有高序列一致性，例如至少30%序列一致性 (更优选地，至少45%—致性，如50%或55%—致性；最优选 地，至少60%—致性，如65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%或99%—致性)。优选地，所述^^开的多核苷酸和多肽的同源 物是从哺乳动物中分离的。这样的同源物涵盖在本发明的范围内。
31[0071两个序列间"同源性"或"序列一致性"的计算可通过本领 域熟知的比较方法进行。例如关于一致性，为最优比较目的比对序 列(例如为最优比对，空位可引入第一和第二氨基酸之一或两者 中，或引入核酸序列中，为比较目的可不考虑非同源序列)。在一 个实施方案中，为比较目的比对的参考序列的长度是所述参考序列 长度的至少30%，优选至少40%，更优选至少50%,甚至更优选
至少60%，甚至更优选至少70%、 80%、 90%、 100%。然后比举交 相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列 中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核普酸占据 时，则所述分子在该位置是相同的。考虑到为所述两个序列最优比 对需要引入的空位的数量和每个空位的长度，两个序列的 一致性百 分比是所述序列共有的相同位置数量的函数。靶向本发明的或相关多核苷酸的siRNA可基于本领域众所周知的标准设计(e.g., Elbashir et al. (2001)五MSO 乂 20:6877-88;Aronin (2006) rAera;^ 13:509-16)。例如，所述輩巴mRNA的草巴部分应该以AA (最优选)、TA、 GA或CA开始；所述siRNA分子的GC比优选应为45-55%;所述siRNA分子优选应不含有排成一列的三个相同核香酸；所述siRNA分子优选不应含有排成一列的七个混合的G/C;所述靶部分优选应在靶mRNA的ORF区，并优选起始ATG后应该至少75bp，终止密码子前至少75bp。基于这些标准或其它已知标准(如Reynolds et al. (2004)淑訓万z'ofec/mo/.22:326-30),与本发明相关的靶向本发明的或相关mRNA多核苷酸的siRNA分子可由本领域技术人员设计。本发明的或相关分离的多核苷酸还可以可操作地连接到表达控制序列和/或连接到表达载体，以重组制备本发明的或相关多肽(包括其活性部分和/或融合多肽)。表达重组蛋白的一般方法在本领域是众所周知的。
00841本文所用的表达载体是核酸，该核酸能够转运其已与之连接的另一核酸。载体的一种类型是质粒，质粒指另外的DNA片段可连接到其中的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在其已被导入的宿主细胞中自主复制(例如具有复制细菌起点的细菌载体或附加型哺乳动物载体)。其它载体(如非附加体哺乳动物载体)可以通过导入宿主细胞，整合到宿主细胞基因組中，因此与宿主基因组一起复制。此外某些载体能引导与其可操作连接的基因的表达。这样的载体本文被称为重组表达载体(或简单地说是表达载体)。 一般来说在重组DNA技术中有用的表达载体通常都是质粒的形式。在本说明书中，质粒和载体可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是该发明旨在于包括其他形式的表达载体，如起相当作用的病毒载体(例如复制缺陷反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
0085在一个实施方案中，本发明的或相关多核苷酸用于创建重组豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂。豆荚蛋白拮抗剂的一个例子包括酶非活性的豆荚蛋白(多肽或多核香酸)及其酶非活性片段。ZB-1拮抗剂的例子包括酶非活性的ZB-1(多肽或多核苷酸)及其酶
非活性片段。酶非活性的豆荚蛋白和/或ZB-1包括含有全部或部分N-端和/或C-端前肽(例如序列N端到氨基酸位置21或25和/或序列C-端到氨基酸位置323 )的分子。这样的拮抗剂可用于调节天冬酰胺酰基蛋白酶活性，因此可用于治疗动脉粥样硬化或其他血管和炎性疾病，其中可取的是减少天冬酰胺酰基键水解。在另一实施方案中，本发明的或相关的多核苷酸用于创建其他豆荚蛋白和ZB-1拮抗剂，如豆荚蛋白和/或ZB-1抑制性多核苷酸，豆荚蛋白和/或ZB-1抑制性多肽(包括其片段和融合蛋白)，拮抗性抗豆荚蛋白抗体及其片段，拮抗性抗ZB-1抗体及其片段，以及拮抗性小分子。第二多肽部分优选可溶的。在一些实施方案中，第二多肽部分增加连接多肽的半衰期(如血清半衰期)。在一些实施方案中第二多肽部分包括促进融合多肽与豆荚蛋白或ZB-1多肽结合的序列。在一个实施方案中，第二多肽包括至少免疫球蛋白多肽的域。免疫球蛋白融合多肽在本领域是已知的，并在例如美国专利号5,516,964 、 5,225,538 、 5，428，130 、 5，514，582 、 5,714,147和5,455,165中有描述，因此其全部都在此引作参考。融合蛋白还可包括将第一多肽部分，如人豆荚蛋白或ZB-1，包括其片段，连接
37到第二部分的接头序列。这样的接头序列的使用在本领域是众所周知的。例如所述融合蛋白可包括肽接头，例如氨基酸长度约2至20个的肽接头，更优选氨基酸长度少于10个。在一个实施方案
中，所述肽接头可以是2个氨基酸长度。在其它实施方案中，本发
明的或相关融合蛋白包括超过两个多肽部分，例如三联融合蛋白可
包含两个豆荚蛋白多肽(或其片段)，两个ZB-1多肽(或其片
段)，或被有助于所述两个豆荚蛋白多肽(或其片段)结合的第三
部分连接的其组合，两个ZB-1多肽(或其片段)，或其组合。本发明的融合蛋白可以通过标准重組DNA技术制备。例如，编码不同多肽序列的DNA片段依据常规技术，通过采用例如平末端或粘性末端进行连接，限制性内切酶消化提供合适的末端，视情况而定补平粘性末端，避免不需要的连接的碱性磷酸酶处理以及酶连接，而符合读框地连接在一起。在另一实施方案中，所述融合基因可通过常规技术包括DNA自动合成仪合成。或者基因片段的PCR扩增可使用锚定引物进行，该锚定引物产生两个能随后退火并再扩增产生嵌合基因序列的连续基因片段间的互补突出段(参见例嗦口 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (eds.)John Wiley & Sons, 1992)。此外，许多编码融合部分的表达载体(例如免疫球蛋白重链的Fc区)可从商业获得。豆荚蛋白编码或ZB-1编码核酸可克隆到这样的表达载体中，/人而所述融合部分符合读框地与所述免疫球蛋白蛋白连接。[OO卯本发明的所述重组表达载体可携带另外的序列，如调控 宿主细胞中载体复制的序列(如复制起点)和选择性标记基因。所 述选择性标记基因有助于筛选所述载体已导入其中的宿主细胞。例 如典型地所述选择性标记基因赋予所述载体已导入其中的宿主细胞 对例如G418、潮霉素或曱氨蝶呤的抗药性。优选的选择性标记基
因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于曱氨喋呤筛选/扩增的 dhfr-宿主细胞)和neo基因(G418筛选)。可以选择或构建合适的载体，含有合适的调控序列，视 情况而定包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子 序列、标记基因和其它序列，如调控宿主细胞中载体复制的序列 (如复制起点)。i见情况而定载体可以是质粒或病毒，例如噬菌 体、嗟菌粒。进 一 步的详情参见例如Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd ed.， Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。许多已知的核酸操作技术和方案，例如核 酸构建物的制备，突变，测序，DNA导入细胞和基因表达，以及 蛋白分并斤在Current Protocols in Molecular Biology, 2nd ed.， Ausubel et al. (eds.) John Wiley & Sons, 1992中详细描述。细菌中的表达可能会导致形成包涵体掺入所述重组蛋白。因此为了制备活性或活性更高的细菌，重组蛋白的重折叠是需要的。从细菌包涵体获得正确折叠的异源蛋白的几种方法是本领域已知的。这些方法一般涉及溶解来自包涵体的蛋白，然后使用离液剂使蛋白完全变性。当半胱氨酸残基出现在所述蛋白的一级氨基酸序列中时，通常需要在允许二硫键正确形成的环境(氧化还原体系)中完成重折叠。重折叠的一般方法在例如Kohno (1990) MeA.^z矽wo/. 185:187-95中公开。其它合适的方法在例如EP 0433225和U.S.专利号5,399,677中公开。或者所述多肽也可以以有助于纯化的形式重组表达。例如，所述多肽可与例如麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-&转移酶
(GST)或硫氧还蛋白(TRX)的蛋白融合表达。表达和纯化这样的融合蛋白的试剂盒从商业获得，分别来自New England BioLabs(Beverly, MA)、 Pharmacia (Piscataway, NJ)和Invitrogen。重纟且蛋白也可用小的表位标记，之后用表位的特异性抗体鉴别或纯化。优选的表位是从Eastman Kodak (New Haven, CT)商业获得的FLAG表位。在一些实施方案中，本发明提供了单域抗体。单域抗体可以包括其CDRs是单域多肽的一部分的抗体。例子包括但不限于重链抗体，轻链天然缺失的抗体，来自常规四链抗体的单域抗体，基因工程抗体以及除了来自抗体的单域支架。单域抗体可以是任意本领域已知的，或任意将来知道的单域抗体。单域抗体可来自任何物种，包括但不限于小鼠、人、駱驼、美洲鸵、山羊、兔、牛。才艮据本发明的一个方面，本文所用的单域抗体是已知为轻链缺失的重链抗体的自然产生的单域抗体。这样的单域抗体在例如WO 94/04678中^Hf。源于天然轻链缺失的重链抗体的此可变域此处被称为VHH或纳米体，以区别于常规的四链免疫球蛋白的VH。这样的VHH分子可来自驼科种中产生的抗体，例如駱駝、美洲鴕、单峰驼、羊驼和原駝。除了驼科的其他种可以产生天然轻链缺失的抗体；这样的VHH分子在本发明范围内。
0108本发明的或相关多肽的抗体分子，例如豆荚蛋白和/或ZB-1抗体，可通过本领域技术人员众所周知的方法制备。本发明的豆荚蛋白和/或ZB-1蛋白还可用于免疫动物，获得与豆荚蛋白和/或ZB-1蛋白反应，并抑制底物和豆荚蛋白和/或ZB-1相互作用的的多克隆和单克隆抗体。本发明的全长多肽可作为免疫原，或者可使用多肽的抗原肽片段。本发明多肽的抗原肽包括至少7个连续氨基酸残基，并涵盖了表位，因此产生的针对所述肽的多肽形成了特定的与多肽的免疫复合物。优选地，所述抗原肽包含至少10个氨基酸残基，更优选15个氨基酸残基，甚至更优选至少20个氨基酸残基，最优选至少30个氨基酸残基。
0109在制备抗体方法的进一步改进中，鉴别免疫原临床相关表位的方法，以及筛选高亲和力免疫特异性结合相关表位的抗体的相关方法，在例如美国公开专利申请号2002/0029391中公开，因此此专利申请在此全部引作参考。 一般用于靶向脂类天冬酰胺酰基肽酶和其他半胱氨酸肽酶的典型表位在Coleman and Lee (2004)
5,"中讨论。单克隆抗体可通过其它重组DNA技术领域技术人员已知的方法生成。作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的另选，本发明多肽的单克隆抗体可通过用本发明的或相关多肽(例如小鼠和人豆荚蛋白和/或ZB-1及其片段)筛选重组的組合免疫球蛋白库(例如抗体噬菌体展示文库)鉴别和分离，从而分离与本发明的或相关多肽结合的免疫球蛋白库成员。"组合的抗体展示"方法是众所周知的，并被发展为鉴别并分离具有特定抗原特异性的抗体片段，可用于制备单克隆抗体。
01111多克隆血清和抗体可通过用本发明的或相关多肽免疫合适的受试者制备。免疫的受试者中抗体效价可随时间进行监测，针对本发明的多肽的抗体分子可从受试者或培养基分离，并通过众所周知的技术进一 步纯化。功能改变的抗体，例如对效应物配体如细胞上的FcR,或补体的Cl组分的亲和力改变，可通过用不同残基取^C所述抗体恒定部分中至少 一个氨基酸残基制备(参见例如EP388,151、 U.S.专利号5,624,821和5,648,260，所有上述内容因此在此全部引作参考)。所述豆荚蛋白和ZB-1多核苷酸和多肽可用于筛选分 析，以鉴别能调节细胞或生物体中豆荚蛋白和/或ZB-1活性的药物 或药物的先导化合物，并因此是与例如天冬酰胺酰基肽酶活性失调相关的血管或炎性疾病的可能调节剂。例如，含有豆荚蛋白和/或 ZB-1的样本可与许多测试化合物(或者生物制剂或者有机小分 子)中的一种接触，每个经处理的样本中豆荚蛋白和/或ZB-1活性 可与未处理的样本，或与不同测试化合物接触的样本中的豆荚蛋白
和/或ZB-1活性比较。这样的比较将决定任何所述测试化合物是否 会导致(1 )豆荚蛋白和/或ZB-1表达和/或活性(和/或分泌，如 果所述样本由完整细胞组成)水平大幅降低，则表明是豆荚蛋白和 /或ZB-1的拮抗剂；或(2)豆芙蛋白和/或ZB-1表达和/或活性 (和/或分泌，如果所述样本由完整细胞组成)水平大幅增加，则 表明是豆荚蛋白和/或ZB-1的激动剂。在一个实施方案中，能够调 节豆荚蛋白和/或ZB-1活性的测试化合物的鉴别是使用高通量筛选 试验，如BIACORE (Biacore International AB, Uppsala， Sweden)、 BRET (生物发光共振能量转移)和FRET (荧光共振能量转移)分析， 以及ELISA和基于细胞的分析进行的。本发明人已证明了以下(1)相对于健康动脉样本， 豆荚蛋白在人动脉粥样硬化患者样本中高表达；(2)动脉粥样硬 化病发展过程中，ApoE KO小鼠主动脉窦和主动脉弓中豆荚蛋白 表达增加；(3 ) ApoE-/-小鼠主动脉弓和主动脉窦动脉粥样硬化病 变中豆荚蛋白是强阳性的；(4) ApoE-/-小鼠主动脉窦动脉粥样硬 化病变中豆荚蛋白的表达发生在炎性细胞浸润的区域；(5)动脉 粥样硬化斑块中ApoE-/-小鼠冠状动脉中豆荚蛋白表达增加； (6)动脉粥样硬化病变加速的ApoEV-小鼠模型中颈动脉新内膜病 变区域内发现豆荚蛋白表达；(7)豆荚蛋白在ApoEV-小鼠主动脉 窦的动脉内皮细胞中表达；(8)豆荚蛋白在肾脏，例如肾动脉的 内皮细胞和近端小管细胞中表达；(9)分化的THP-1巨噬细胞和 M-CSF激活的原代人巨噬细胞中豆荚蛋白蛋白水平、mRNA水平 和活性增加；(10)豆荚蛋白在M-CSF-激活的原代人巨噬细胞的 条件培养基中发现；(11)豆荚蛋白蛋白通过在CHO或HEK293 细胞中重组超表达出现在细胞表面，HEK293细胞表达的细胞表面 豆荚蛋白是酶活性的；(12)豆荚蛋白在动脉粥样硬化患者的冠状 动脉中表达；(13)豆荚蛋白刺激诱导人单核细胞迁移；U4) 豆荚蛋白刺激诱导HEK293和HUVEC培养物伤口愈合模型中内皮 细胞迁移和增殖，以及HUVEC培养物中内皮细胞侵袭；(15)关 节炎的胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型的患病爪中豆荚蛋白表达 增加；以及(16 )豆荚蛋白新剪接变体ZB-1分泌到重组ZB-1超表 达的HEK293细胞的培养基中。当治疗有效量的豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂口服给药 时，所述黏合剂会是片剂、胶嚢、粉剂、溶液剂或酏剂的形式。当 以片剂形式施用时，本发明的所述药物组合物可另外含有固体载体 如明胶或佐剂。片剂、胶嚢和/或粉剂含有约5至95%的黏合剂， 优选约25至90 %的翁合剂。当以液体形式施用时，可添加液体载 体如水，石油，动物或植物来源的油如花生油(花生过敏谨慎运 用)，矿物油，大豆油或麻油，或合成油。液体形式的药物组合物 可进一步含有生理盐水溶液，葡萄^唐或其他并唐溶液或二醇，如乙二 醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式给药时，以黏合剂重量计所 述药物组合物含有约0.5至90 % ，以黏合剂重量计优选1至50 % 。
01421当治疗有效量的豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂通过静脉内、皮肤或皮下注射给药时，豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂是无热 原，胃肠外可接受的水溶液。这样的胃肠外可接受的，充分考虑到 pH、等渗性、稳定性等等的蛋白溶液的制剂在本领域技术人员的 技能范围内。静脉内、皮肤或皮下注射的优选药物组合物应含有除
豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂外的等渗溶剂，如氯化钠注射液、林格
注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液、乳酸盐4木格注射液 或其他本领域已知的溶剂。本发明的所述药物组合物还可含有稳定 剂、防腐剂、緩冲剂、抗氧剂或其它本领域技术人员已知的添加 剂。与豆荚蛋白和/或ZB-1拮抗剂联合使用的优选治疗剂是 调节血管和炎性疾病不同方面的那些物质，例如干扰促炎细胞因子 活性的物质。双链cDNA使用SUPERSCRIPT Choice试剂盒 (Invitrogen, Carlsbad， CA)和含有T7 RNA聚合酶启动子(Proligo, LLC, Boulder, CO)的33pmol寡脱氧胸腺核苷酸引物，从3-5 |iig总 RNA制备。第一链cDNA的合成加入下列试剂盒组分引发1 X 第 一 链緩冲液、10 mM DTT 、 500 mM dNTP 、 400 U的 SUPERSCRIPT RT II和40 U的RNase抑制剂。反应47。C进行1 小时。第二链合成加入下列试剂盒组分进行IX第二链緩冲液、 200mM附加dNTP、 40 U的大肠杆菌DNA聚合酶I 、 2U的大肠 杆菌RnaseH、 10 U的大肠杆菌DNA连接酶。反应15.8。C进行2 小时。第二链反应的最后5分钟加入T4 DNA聚合酶(New England Biolabs, Beverly, MA)，终浓度6 U (每毫升原液2 pi, 3000 U)。双 链cDNA用如制造商(Affymetrix, Santa Clara, CA)描述的 GENECHIP Sample Cleanup Module纟屯化。纯化的cDNA(10 (al)依 据制造商的流程(Enzo, Farmingdale， NY)，用Bioarray High Yield RNA TRANSCRIPT LABELING KIT (T7) TM转录。生物素标记的反 义cRNA用如制造商(Affymetrix, Santa Clara, CA)描述的GENECHIP Sample Cleanup Module纯化。260 nm测量紫外吸收 确定cRNA得率。
实施例2.2.3:寡核普酸微阵列杂交步骤免疫组织化学染色表明，豆荚蛋白蛋白在ApoEA小鼠 主动脉窦病变中表达(数据未显示)。在主动脉窦，豆荚蛋白表达 首次在2月龄ApoE-A小鼠中检测到(数据未显示)。在老年小鼠 的发展的动脉粥样硬化斑块中检测到表达增加。在1年龄ApoE-A 小鼠中，被浸润的炎性细胞区域中动脉粥样硬化病变内发现豆荚蛋 白(数据未显示)。豆荚蛋白在成年C57BL/6对照小鼠的主动脉窦 中没有4企测到(数据未显示)。
实施例3:豆荚蛋白在加速动脉粥样硬化ApoEV-小鼠模型中表
达
0189为确定豆荚蛋白表达是否限于ApoE-/-小鼠中自然形成 的动脉粥样硬化病变中，在血管损伤后加速动脉粥样硬化模型中分 析了豆荚蛋白的表达模式。
实施例3.1:加速动脉粥样硬化小鼠模型的制备 P-选择素的免疫检测使用与生物素(R&D Systems)结合
的山羊抗小鼠P选择素第一抗体，而后是与Alexafluor488
(Molecular Probes, Eugene， OR)结合的链霉亲和素进行。对于双重免
疫荧光染色，在使用第二抗体和链霉亲和素前，使用豆荚蛋白和P-选择素第 一抗体的混合物。
实施例5.2:结果
0197免疫荧光染色显示，豆荚蛋白是2月到1年龄的 ApoE-A小鼠主动脉窦的动脉内皮细胞表达的，包括覆盖早期炎性 病变的内皮细胞(数据未显示)。
78实施例6:豆荚蛋白在ApoE-A小鼠肾动脉的肾近端小管细胞 和内皮细胞内表达
01981由于血管功能异常和炎性过程参与肾脏病理，所以测量 豆荚蛋白在ApoEKO和C57BL / 6小鼠肾脏中的表达。
实施例6.1:材料
0199如上所述收集雄性ApoEKO和C57BL/6小鼠的肾，制 备并进行免疫组织化学操作，以评估豆荚蛋白在肾和肾动脉中的表 达。P-选择素用作内皮细胞的标记。
实施例6.2:结果用力洗贴壁细胞，在有或没有20 ng/ml重组人巨噬细胞 集落刺激因子(M-CSF) (R&D Systems, Minneapolis, MN)存在的含 0.25 %FBS的RPMI中培养72小时。收集上清，离心使澄清，-80°C保存。细胞加入含Complete Mini蛋白酶抑制剂(Roche, Nutley: NJ)的0.5ml改良RIPA(50 mM Tris、 150 mM NaCl、 1 mM EDTA、 1%NP40、 0.25%脱氧胆酸)中裂解，冰上孵育15分钟。不溶性物 质离心除去，上清-80。C保存。
实施例8.3:蛋白质印迹分析清洗一次，含 有10nM底物Z-AAN-MCA (Peptide Institute, Louisville, KY)的50 pi分析緩冲液加到每个孔里。分析緩沖液包括蛋白酶抑制剂胱抑蛋 白C (R&D Systems, Minneapolis,丽)或E64 (Sigma),浓度为 100nM。培养板37。C孵育10分钟，使用360nm激发滤光片和460 nm发射滤光片，在VICTOR 3 焚光板阅读仪(PerkinElmer, Wellesley, MA)测量荧光。室温下重复测量每隔5分钟一次，测20 分钟。荧光随时间增加作图。
实施例10.3:结果 ， Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)冲几才成损伤单细月包 层，得到2.0 x 1.7 cii^矩形棵露区域。受伤细胞随后在添加0.05% 脱脂BSA (BD Biosciences, Bedford, MA)和VEGF (10 ng/mL, R&D Systems, Minneapolis,画)或豆荚蛋白(10 ng/mL或25 ng/mL, R&D Systems, Minneapolis, MN)的无血清培养基中培养24小时(HEK293 细胞)或20小时(HUVEC)。伤口愈合通过使用发光法细胞活力检 测(CellTiter-Glo Assay, Promega， Madison, WI),通过测量出现在 最初损伤区域中细胞数量进行定量。
实施例11.2:结果
[0222图8和9的数据表明，相对于对照(5% FBS和VEGF),
84响应10 ng/mL和25 ng/mL豆芙蛋白刺激，细胞迁移增加。因此， 豆荚蛋白似乎参与内皮细胞迁移；这种迁移发生在动脉粥样硬化形 成过程中，并可能参与血管生成。经设计用于诊断、预测、监测、 治疗、减轻和/或预防涉及血管生成的疾病(包括但不限于癌症和 炎性疾病)的方法和疗法等等都设想在本发明中。
实施例12:豆荚蛋白介导的内皮细胞侵袭
0223为确定豆荚蛋白是否也参与内皮细胞侵袭，如涉及血管 生成，在改良Boyden小室分析中4企测HUVEC。
实施例12.1:改良Boyden 'J、室分析
0224在改良Boyden小室分析中，响应加到下层小室的纯化 豆荚蛋白，加到上层小室的25000个血清饥饿的HUVEC被允许侵 袭涂Matrigel的PET膜(3.0pm孔径，Becton Dickinson, BioCoat Angiogenesis System:内皮细胞侵袭)。Matrigel基质侵袭的细胞用发 光法细胞活力4企测(CellTiter-Glo Assay, Promega, Madison, WI)定 量。VEGF用作阳性对照。
实施例12.2:结果
0225在改良Boyden小室分析中检测HUVECs的侵袭性质 时，检测到侵袭涂Matrigel膜的细胞响应豆荚蛋白，细胞数量剂量 依赖性增加，22小时内25ng/mL豆荚蛋白诱导的应答与 10ng/mLVEGF类似(
图10 )。
实施例13:豆荚蛋白在胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型的患 病爪中高表达
0226为确定豆荚蛋白是否在其它以增加的巨噬细胞和单核细 胞活性为标志的疾病如结核病和类风湿关节炎中起作用，检测豆荚 蛋白在胶原诱导关节炎(CIA)模型中的表达。
实施例13.1:胶原诱导关节炎(CIA)模型
[0227雄性DBA /1小鼠从Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine获得。关节炎用溶解于0.1M乙酸，并在含有1 mg/ml结核(H37RA菌才朱)的同体积完全
弗氏佐剂(Sigma)中乳化的II型牛胶原(Chondrex， Redmond, WA)诱 导。小鼠尾根部皮下注射100ng胶原混合物。21天时小鼠尾根部 另外皮下注射与同体积不完全弗氏佐剂(Sigma)混合的含100 pg牛 胶原的0.1M乙酸。未曾测试过的动物(Naive animal)没有注射胶 原。小鼠至少一周三次监测病情。四肢被指定基于指数的临床分 值0 =正常；P-以趾尖病灶红斑为特点的关节炎前；1 =伴有1-2 个肿胀脚趾的可见红斑；2=明显红斑，爪子肺胀和/或多脚趾肿 胀；3 =大规模肿胀延伸到踝关节或腕关节；4=肢体活动困难或关 节僵硬；结果最高的总躯体分值为16。不同时间间隔于疾病发作 后处死动物，收集组织，爪子在pH 7.47的4%多聚甲醛中固定， 20% EDTA (pH 8.0)中脱钙，石蜡包埋进^f亍原位杂交。 实施例13.2:结果
[0228CIA小鼠中豆荚蛋白信号在患病爪(临床分值3)中为 强阳性，但正常对照爪没有，表明豆荚蛋白表达在此关节炎模型中 随疾病上调(数据未显示)。这些结果表明豆荚蛋白参与炎性疾 病，其中巨噬细胞和单核细胞与之长期有关。
实施例14:豆荚蛋白剪接变体ZB-1的鉴别和表征
[0229为确定额外的豆荚蛋白的蛋白或转录物是否可能促进血 管疾病和炎性疾病，篩选人肾上腺cDNA，以确定蛋白与人豆荚蛋 白有高同源性。
实施例14.1:从人肾上腺分离ZB-1
[0230人肾上腺cDNA被亚克隆到Adori表达载体中。有了 Adori载体，表达由巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子和增强子 调控。Ad5 Ela缺失的重组腺病毒通过人胚肾细胞系293(HEK293, ATCC, Manassas, VA)中同源重组产生。重组腺病毒邱皮分离，随后 在293细胞上扩增。经过3个冻融循环，病毒从感染的293细胞释 放。病毒经两次氯化铯梯度离心和4QC下对pH7.2的磷酸盐緩冲液
86(PBS)透析进一步纯化。透析后，加入甘油至浓度10%,病毒画
80。C存放至使用。病毒通过评估下列参数进行表征；转基因的表 达，293细胞上噬斑形成单位，颗粒/毫升，内毒素测定，病毒的 PCR分析和病毒中豆荚蛋白或ZB-1编码区的序列分析。通过放射 标记病毒感染的HEK293细胞并监测蛋白表达，检测腺病毒重组蛋 白的表达。
[0231为监测蛋白合成，细胞用"S-蛋氨酸和"S-半胱氨酸标 记6小时。HEK293细胞置于P60培养板中，4 ml完全培养基 (Dulbecco's Modified Eagle's Media (DME) + 10%热失活胎牛血清 (FBS) +青霉素/链霉素(Penn/Strep) + 2 mM谷氨酰胺)中密度为7.5 x 105细胞/板。24小时后，培养基用2ml含有MOI为20-100腺病毒 的减少血清培养基(DME + 2%FBS + Penn/Strep +谷氨酰胺)替代。 板孵育2小时，然后补料3 ml完全培养基再聘育24小时。第二天 去除培养基，用2ml无血清、无蛋氨^/半胱氨酸-DME替代。细胞 培养l小时，然后去除培养基，用添加-"S蛋氨酸和"S-半胱氨酸 的无血清-DME代替。细胞赙育15分钟，加入lml含有蛋氨酸和 半胱氨酸+ 2% FBS +抑肽酶(l :100抑肽酶；Sigma-6279)的DME。 细胞再培养4小时，之后收集2ml培养基，低速离心去除标记过程 中可能已分离的细胞。澄清的培养基转移到含有大豆胰蛋白酶抑制 剂(lmg/ml)和20 |Lil苯曱磺酰氟(l mM)的干净管中。放射标记的 条件培养基-2。C储存，为以后SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和力文射自 显影分析之用。
实施例14.2:结果
[0232如图ll所示，ZB-1编码在人肾上腺表达的新型分泌蛋 白。ZB-1似乎是人豆荚蛋白的剪接变体，与人豆荚蛋白有100% — 致性，除了所述57个氨基酸残基缺失(相当于豆荚蛋白的氨基酸 341-397) 。 ZB-1是在用超表达ZB-1的腺病毒感染的HEK293细 胞培养物培养基中发现的分泌蛋白(数据未显示)。
权利要求
1.多核苷酸，其包含SEQ ID NO11的核酸序列。
2. 多肽，其包含SEQIDNO:12的氨基酉拼列，SEQIDNO:12 的氨基酸21至323,或SEQ ID NO: 12的氨基酸25至323。
3. 特异性结合哺乳动物ZB-1多肽或哺乳动物ZB-1多肽片段 的抗体或其抗原结合片段。
4. 权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述哺乳 动物ZB-1多肽或所述哺乳动物ZB-1多肽的片段来自人。
5. 豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-l拮抗剂在制备用于治疗、减轻或 预防血管疾病或炎性疾病的方法的药物组合物中的用途，其中所述 药物组合物包含治疗有效量的所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗 剂，以及药学上可接受的载体。
6. 权利要求5所述的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂的用 途，其中所述豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷 酸、抑制性多肽、小分子、拮抗性抗体及其抗原结合片段。
7. 治疗、减轻或预防哺乳动物血管疾病或炎性疾病的方法， 其包含将治疗有效量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于所 述哺乳动物。
8. 权利要求7所述的方法，其中所述豆荚蛋白拮抗剂和/或 ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗性抗 体及其抗原结合片段。
9. 治疗、减轻或预防哺乳动物血管疾病或炎性疾病的方法， 其包含将哺乳动物细胞或细胞群与治疗有效量的豆荚蛋白拮抗剂和/ 或ZB-1拮抗剂"I妄触。
10. 权利要求9所述的方法，其中所述细胞或细胞群包含巨噬 细胞、单核细胞、血管内皮细胞、泡沫细胞，或单核细胞、巨噬细 胞、血管内皮细胞和/或泡沫细胞的混合物。
11. 权利要求IO所述的方法，其中所述细胞或细胞群分泌豆荚蛋白和/或ZB-l。
12. 降低哺乳动物豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌水 平的方法，其包含将足以降低哺乳动物豆荚蛋白和/或ZB-1活性、 表达和/或分泌水平的量的豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于 哺乳动物。
13. 监测患者血管疾病或炎性疾病治疗过程的方法，其包含(a) 测量患者细胞或细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-l活性、表达和 /或分泌的水平；(b) 将豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-l拮抗剂施用于患者；以及(c) 施用豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-l拮抗剂后，测量患者细胞或 细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平，其中与施用豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂前患者细胞或 细胞群中豆荚蛋白和/或ZB-1活性、表达和/或分泌的水平相比，施 用豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂后患者细胞或细胞群中豆荚蛋 白和/或ZB-l活性、表达和/或分泌的水平更低，表明患者血管疾病 或炎症疾病的治疗有积极效果。
14. 抑制哺乳动物细胞迁移的方法，其包含将豆荚蛋白拮抗剂 和/或ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。
15. 权利要求14所述的方法，其中所述豆荚蛋白拮抗剂和/或 ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗性抗 体及其抗原结合片段。
16. 促进哺乳动物伤口愈合的方法，其包含将豆荚蛋白激动剂 和/或ZB-1激动剂施用于哺乳动物。
17. 抑制哺乳动物血管生成的方法，其包含将豆荚蛋白拮抗剂 和/或ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。
18. 权利要求17所述的方法，其中所述豆荚蛋白拮抗剂和/或 ZB-1拮抗剂选自抑制性多核苷酸、抑制性多肽、小分子、拮抗性抗<formula>formula see original document page 4</formula>
19. 抑制哺乳动物内皮细胞增殖的方法，其包含将豆荚蛋白拮抗剂和/或ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。
20. 抑制哺乳胂瘤转移的方法，其包含将豆荚蛋白拮抗剂和/或 ZB-1拮抗剂施用于哺乳动物。
全文摘要
本发明提供与哺乳动物(例如小鼠和人)豆荚蛋白和新型豆荚蛋白剪切变体ZB-I有关的，分离和纯化的多核苷酸、多肽和抗体。本发明进一步涉及这些分离和纯化的多核苷酸、多肽和抗体，以及其它豆荚蛋白和ZB-I激动剂和拮抗剂在调节细胞或细胞群，例如单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞、血管内皮细胞、肾近端小管细胞、动脉内皮细胞、炎性细胞侵袭到血管内膜里的部位和动脉新内膜病变区域中豆荚蛋白和/或ZB-I活性、表达和/或分泌中的用途。本发明还提供豆荚蛋白和ZB-I拮抗剂，例如豆荚蛋白和ZB-I的拮抗性小分子、抗体和抗体片段，豆荚蛋白和ZB-I抑制性多肽和豆荚蛋白和ZB-I抑制性多核苷酸。本发明还涉及新的诊断、预测、监测、治疗、减轻和/或预防血管疾病和炎性疾病的方法。
文档编号C12N9/64GK101495628SQ200780027982
公开日2009年7月29日 申请日期2007年5月25日 优先权日2006年5月25日
发明者D·D·皮特曼, G·T·赫伯特, H·H·希, J·费尔德曼, K·希尔兹, N·D·邓, V·克莱林 申请人:惠氏公司