专利名称：用于生产重组蛋白质的高细胞密度补料-分批发酵方法
技术领域：
概括来说，本申请案是关于可提高细菌系统中的蛋白质表达的新颖补料-分批发酵方法，以及高密度蛋白质组合物和所述新颖补料-分批发酵方法中所用的组合物。
背景技术：
已利用多种发酵策略来生产供实验室、临床或商业使用的足量蛋白质。利用补料-分批发酵所提供的蛋白质产量比通过简单分批发酵方法所提供的产量高。补料-分批发酵方法在最初分批阶段后进行将一或多种营养物通过补加补充到培养物中的阶段。
通常，在分批阶段期间，细胞最初生长到期望浓度。在此阶段，细胞生长旺盛且通常不产生靶蛋白质，除非我们视启动子添加诸如阿拉伯糖、乳糖或异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等诱导物或启动子有些泄漏。在补料期期间，通常将碳源和其它必需物质以相对浓缩的液体流形式以一定补料速度补加到发酵罐中。在达到目标细胞密度后，开始补加诱导物或诱导物和其它营养物。在此阶段期间，重点是由所培育的细胞产生蛋白质。补加到发酵罐中的底物(即，营养物和诱导物)在此阶段通常用于细胞生长和产物合成。通过补料速度来控制细胞生长以获得最佳细胞生长和蛋白质产生。在蛋白质产生阶段期间，必须为重组生物体添加诱导物。
在于补料期结束时出现限制条件以前包含常见碳源(例如葡萄糖或另一种基于糖的碳源)和诱导物的培养基上的蛋白质表达令人满意。限制条件的实例包括生长培养基中的氧浓度降低、诸如维生素、碳、氮等营养物减少和累积毒性化合物。
补料-分批发酵策略通常涉及不同反馈控制形式，包括控制营养物补充的间接和直接反馈。一种所述补料-分批发酵方法涉及应用通过补加营养物以将过程参数控制在规定设定点的反馈控制算法。例如，补料的直接控制可基于营养物浓度的量度。随后在整个发酵期间反馈控制与细胞活性直接相关。已用于发酵反馈控制的控制参数包括pH值、在线测量的细胞密度或溶解氧张力(DOT)。
然而，应用反馈算法会伴随许多缺点。一个所述缺点是补料速度依赖于当前的过程参数。对过程的任何干扰都可能影响参数，由此歪曲补料速度和所得蛋白质产量。当将所述方法按比例放大以生产增量蛋白质时，所述缺点被扩大。
先前所用补料-分批策略的另一个缺点是当使用反馈控制时，不能准确地预先确定或控制具体生长速度，导致在产物形成依赖于生长的情况下方法产量达不到最佳。
此外，当进入到中心代谢途径中的碳通量(例如，高葡萄糖浓度)超过三羧酸(TCA)循环的最大容量后，可能累积副产物。副产物累积可能抑制发酵期间的细胞生长和蛋白质产生。
另外，补料-分批发酵方法的所述多个缺陷通常会导致营养物组份利用效率低。因此，这些方法在经济上不利，尤其在大规模商业生产蛋白质时。
如上所述，通过补料-分批发酵表达重组蛋白质的先前途径具有多个缺陷。考虑到以成本有效方式生产用于各种用途的足量蛋白质的重要性，当前需要可达成较高细胞生长、增多的产物形成(即，蛋白质产量较高)和较少的副产物累积的有效补料-分批发酵方法。
发明内容
本发明是关于可达成出乎意料高的重组蛋白质产量的新颖补料-分批发酵方法。
本发明实施例提供生产重组蛋白质的方法，其包含培养表达重组蛋白质的重组细菌细胞，此包含向包含重组细菌细胞的培养物中连续添加碳源并在培养物达到阈值参数后向培养物中连续添加诱导物；和自细胞培养物中分离重组蛋白质。
本发明的又一实施例提供生产重组蛋白质的方法，其包含(a)在诱导型启动子控制下将编码重组蛋白质的表达载体引入到细菌宿主细胞中以形成重组细菌细胞；(b)将所述重组细菌细胞引入到培养基中以形成细胞培养物；(c)将碳源以连续补料形式添加到细胞培养物中；(d)监测细胞培养物中的细胞生长是否达到阈值光密度(OD600)；(e)在达到阈值光密度(OD600)后，将诱导型启动子的诱导物以连续补料形式添加到细胞培养物中；和(f)自细胞培养物收获重组蛋白质。
本发明的再一实施例提供生产重组蛋白质的方法，其包含培养表达重组蛋白质的重组细菌细胞，其是通过在包含所述细菌细胞的培养物达到阈值参数后向所述培养物中连续添加诱导物来培养，其中所述细菌细胞包含对应于脑膜炎奈瑟菌血清群B(N.meningitidis serogroup B)基因的核酸序列。
根据再一实施例，本发明提供生产重组2086蛋白质(rP2086)的方法，其包含(a)在诱导型启动子控制下将编码重组脑膜炎球菌(meningococcal)2086蛋白质的表达载体引入到细菌宿主细胞中以形成重组细菌细胞；(b)将所述重组细菌细胞引入到培养基中以形成培养物；(c)向培养物中添加碳源；(d)监测培养物中的细胞生长是否达到阈值光密度(OD)；(e)在培养物的细胞密度达到约70至110的光密度后，向培养物中连续添加诱导型启动子的诱导物；和(f)在开始连续添加诱导物后约3小时至约6小时后，自培养物收获重组脑膜炎球菌2086蛋白质。
根据另一实施例，本发明提供一种包含细菌培养物的组合物，所述细菌培养物包含基于细菌培养物的总体积，密度为至少约1.5g/L的重组2086蛋白质(rP2086)。
根据再一实施例，本发明提供一种包含细菌培养基的组合物，所述细菌培养基包含按照本发明方法所制备的重组脑膜炎球菌2086蛋白质(rP2086)。
图1无诱导时不同恒定补料速度下的补料-分批发酵。
图2无诱导时不同恒定补料速度下的补料-分批发酵。
图3在不同光密度下进行诱导。
图4用不同量的阿拉伯糖进行诱导。
图5阿拉伯糖添加方法对rLP2086产量的影响。
图6阿拉伯糖补料速度对rLP2086产量的影响。
图7诱导时间对表达的影响。
图8用于生产亚科B rLP2086的补料-分批发酵。
图9a和9b分别为rLP2086亚科B诱导的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western Blot)。
图10用于生产亚科A rLP2086的补料-分批发酵。
图11a和11b分别为rLP2086亚科A诱导的SDS-PAGE和蛋白质印迹。
图12a、12b和12c在诱导期间双重补加葡萄糖和阿拉伯糖。
图13a100L规模的rLP2086亚科B大肠杆菌补料-分批发酵。
图13b100L规模的rLP2086亚科A大肠杆菌补料-分批发酵。
图14a100L规模的葡萄糖和阿拉伯糖双重补料的rLP2086亚科B大肠杆菌补料-分批发酵。
图14b100L规模的葡萄糖和阿拉伯糖双重补料的rLP2086亚科A大肠杆菌补料-分批发酵。
具体实施例方式 本发明方法是基于以下惊人发现通过在诱导期间向培养基中连续补加诱导物的补料-分批发酵可获得出人意料高的蛋白质产量。任选地，碳源是在连续诱导物补料之前和/或期间连续补加。当由阿拉伯糖诱导时，按照本发明实施例可产生约2-3g/L的重组2086脂蛋白(rLP2086)(其由具有对应于脑膜炎奈瑟菌血清群B中的2086基因的序列的微生物所表达)。此表示与相当分批发酵方法相比通过补料-分批发酵2086蛋白质的亚科A和B二者的rLP2086产量均有2-3倍增加。而且，本发明方法可容易地适应所述和其它蛋白质的商业规模生产。
为促进对本文所述实施例的理解，可参考多个实施例且将使用特定语言来阐述其。本文所用的术语仅用于阐述具体实施例，而不意欲限制本发明的范围。除非上下文另外明确说明，否则在整篇揭示内容中所用的单数形式“一”和“所述”包括多个指示物。同样，诸如“培养基(medium)”等术语的单数形式包括“培养基”的复数形式指示物，且反之亦然。因此，例如，“培养基(culture medium)”指示物包括多种所述培养基以及单一培养基；且“培养基”指示物包括多种培养基以及单一培养基。
本文所用的术语“诱导物”是指可诱导、增强或促进重组蛋白质表达的任何试剂，由此在诱导型启动子控制下的基因表达可由所述试剂的浓度直接调节。
本文所用的术语“碳源”是指用于细胞的碳和能量来源。
术语“补料(feed)”、“补料(fed)”、“补加(feeding)”或“连续添加”在本文中可交换使用，其是指经一段时间连续地而非同时添加物质。此术语涵盖在发酵过程期间用于连续添加物质的单个开始和/或终止或多个起点和/或终点。
本文所用的术语“重组蛋白质”是指不为自编码氨基酸的重组遗传物质所表达的报道基因或标记基因(例如，绿色荧光蛋白)的任何蛋白质或其生物活性部分(例如，保留完整蛋白质的生物活性的部分)，其包括肽、多肽、蛋白质、寡聚蛋白质和/或融合蛋白质。重组蛋白质产物可包括治疗性、预防性或诊断性产物。
本发明方法 本发明方法可通过涉及在培养物达到阈值参数后向培养基中连续添加诱导物(例如阿拉伯糖)的新颖补料-分批发酵方法提供出人意料高的蛋白质产量。通常在诱导期之前将诸如葡萄糖等碳源添加到包含重组细菌细胞的培养物中。可将碳源与诱导物一起补加。诱导物也可作为第二碳源。
按照本发明实施例，在向培养基中连续补加诱导物之前和/或期间向培养基中连续添加诸如葡萄糖等碳源。因此，根据一实施例，连续补加碳源与连续补加诱导物交叠。连续补加碳源可在连续补加诱导物的全部持续时间段期间或仅在所述持续时间段的一部分期间继续。在另一实施例中，连续补加碳源与连续补加诱导物不交叠。根据本发明一实施例，可以恒定速度将诱导物和/或碳源补加到培养物中。
按照本发明实施例，所述补料-分批发酵方法涉及可产生期望蛋白质的数个步骤。在起始步骤中，制备在诱导型启动子控制下编码重组蛋白质产物的表达载体并随后将其引入到细菌宿主细胞中。将细菌宿主细胞引入到培养基中。将诱导型启动子的诱导物补加到培养物中(即，将诱导物经一段时间连续添加到培养物中)。可以恒定速度将诱导物补加到培养物中。随后，自培养物收获重组蛋白质产物。随后可将以此方式产生的重组蛋白质视需要进行纯化和/或以任何适宜方式(例如以预防性、治疗性或诊断性调配物形式)使用。
通过以恒定速度补加诱导物的补料-分批发酵可出乎意料地达成高细胞密度和增加的蛋白质产量，如下文提供实例中所阐释，与分批发酵相比所述补料-分批发酵使重组蛋白质产物的产量增加约2-3倍。本发明方法适于大规模发酵以及小规模发酵。本文所用的“大规模”发酵是指在体积容量(即，工作体积)至少为约1,000L的发酵罐中进行发酵，其中已留出足够的顶部空间。“小规模”发酵通常是指在体积容量通常不大于约100L(例如5L、10L、50L或100L)的发酵罐中进行发酵。本发明补料-分批发酵方法的证实优点是其可用于以5-10L发酵罐规模生产重组蛋白质产物且可按比例缩放到任何体积，例如(但不限于)100L、150L、250L、500L、1000L或更大。
诱导物 本文所述方法是关于生产重组蛋白质，其中重组蛋白质的表达是在诱导型启动子的转录控制下进行，由此在诱导型启动子控制下的基因表达可由存在于培养基中的诱导物的浓度直接调节。将诱导物任选地以恒定速度连续提供到培养基中。在达到阈值参数后，将诱导物添加到培养基中。例如，重组蛋白质可受araB启动子(例如，ParaB)的控制，此可由以恒定速度添加到培养基中的阿拉伯糖的浓度直接调节。适于与本发明结合使用的诱导物已为所属领域的技术人员所熟知。下文提供本发明诱导物的实例，此并不具有限制意义。
碳源 如所属领域的技术人员所了解，本发明涵盖使用诸如甘油、琥珀酸酯、乳酸酯或基于糖的碳源(例如，葡萄糖、乳糖、蔗糖和果糖)等任何适宜碳源。例如，可用于本发明的基于糖的碳源包括(但不限于)具支链或非具支链多糖，其包含糖类单体D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(例如，聚甘露糖醛酸或海藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸，包括同多糖和杂多糖，例如，乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、葡聚糖硫酸酯、葡聚糖、糊精、糖原、或酸性粘多糖的多糖亚单元(例如，透明质酸)；糖醇的聚合物，例如聚山梨醇和聚甘露醇；肝素或类肝素；或其任何组合，此并不具有限制意义。葡萄糖是本发明实施例的第一碳源。当阿拉伯糖用作诱导物时，其也作为第二碳源，尽管其也可作为第一碳源。根据一实施例，所述碳源包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、蔗糖、L-肌醇、D-甘露醇、β-D-果糖、α-L-鼠李糖、D-木糖、纤维素、或其任何组合中的任何一种。本发明可使用一种或多于一种碳源。
细菌表达系统和质粒 本发明也提供包含表达载体(例如质粒)的重组细菌细胞，所述表达载体包含具有启动子序列和起始子序列的表达控制序列和编码期望多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于所述启动子和起始子序列的3′端。所属领域的技术人员基于本文所提供的揭示内容应了解，本发明涵盖任何适宜表达控制序列和宿主细胞/克隆载体。
适宜表达控制序列和宿主细胞/克隆载体组合已为所属领域的技术人员所熟知，且阐述于(例如)萨姆布鲁克(Sambrook，J.)，弗里奇(E.F.Fritsch)和玛尼蒂斯(T.Maniatis)，1989，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约(NY)。通常，重组DNA技术涉及通过合成或分离获得编码所关注重组蛋白质的DNA序列并将其引入到合适载体/宿主细胞表达系统(所述序列在其中表达)中，优选地在阿拉伯糖诱导型启动子的控制下。所述用于将DNA插入到表达载体中的任何方法都可用于将启动子和其它调节控制元件连接到所选重组载体内的特异性位点中。随后通过习用技术用所述载体或质粒将适宜宿主细胞转化、感染、转导或转染。
多种宿主细胞-载体(质粒)系统可用于表达所关注的重组蛋白质。载体系统(例如包括阿拉伯糖诱导型启动子的系统)与所用宿主细胞相容。将编码所关注重组蛋白质产物的DNA插入到表达系统中，并将启动子(优选为阿拉伯糖诱导型启动子)和其它控制元件连接到载体内的特异性位点中，以使当将载体插入到宿主细胞(视所用宿主细胞-载体系统通过转化、转导或转染进行)中时编码所关注重组蛋白质产物的DNA被宿主细胞表达。
载体可选自上文所述病毒载体或非病毒载体中的一种，但必须与所用宿主细胞相容。可通过转化、转导或转染等(视载体/宿主细胞系统而定)将重组DNA载体引入到合适宿主细胞(细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞或其类似物)中。宿主载体系统包括但不限于经噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。
所关注重组蛋白质产物在原核生物中的表达可在任何适宜细菌种类或菌株(例如大肠杆菌)中用含有引导融合或非融合蛋白质表达的组成型或诱导型启动子的载体来实施。
融合载体添加多个氨基酸到在其中编码的蛋白质上，到重组蛋白质的氨基或羧基末端上。所述融合载体通常用于三个目的1)增强重组蛋白质的表达；2)提高重组蛋白质的溶解性；和3)通过在亲和纯化中作为配体帮助重组蛋白质纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分与重组蛋白质的连接点处引入蛋白水解切割位点以使在融合蛋白质纯化后重组蛋白质能够与融合部分分开。所述酶和其同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。
典型融合表达载体包括Pgex(法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech Inc)；史密斯(Smith)和约翰逊(Johnson)，1988)、Pmal(新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)，贝弗利(Beverly)；马萨诸塞州(Mass.))和Prit5(法玛西亚(Pharmacia)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州(N.J.))，其分别使谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白质或蛋白质A融合到靶重组蛋白质上。
适宜诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(阿曼(Amann)等人，(1988)可用于在大肠杆菌中表达非融合和融合蛋白的紧密调节的tac启动子载体(Tightlyregulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins inEscherichia coli)，基因(Gene)，69，301-315)和Pet lid(斯达迪尔(Studier)等人，(1990)使用T7RNA聚合酶引导克隆基因表达(Use of T7 RNA polymerase to direct expressionof cloned genes)，酶学方法(Methods in Enzymology)，185，60-89)。由pTrc载体表达靶基因依赖于杂合体trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。由Pet lid载体表达靶基因依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶J7gnl介导的T7gnl 0-lac融合启动子转录。此病毒聚合酶是在lacUV5启动子的转录控制下由宿主菌株BL21(DE3)或HMS I74(DE3)自含有T7gnl基因的驻留原噬菌体提供。
根据一实施例，载体构建体的调节序列是诱导型启动子。使用诱导型启动子允许在常规培养和扩展添加期间由细胞产生较低基本量的激活蛋白质。随后，可对细胞进行诱导以在产生或筛选期间表达大量期望蛋白质。诱导型启动子可自细胞或病毒基因组分离。
可由外源提供的化合物调节的诱导型启动子包括(但不限于)阿拉伯糖启动子、锌诱导型羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(dexamethasone)(Dex)诱导型小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(诺(No)等人，1996，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，933346-3351)、四环素抑制型系统(高森(Gossen)等人，1992，美国国家科学院院刊，895547-5551)、四环素诱导型系统(高森等人，1995，科学(Science)，2681766-1769，也可参见哈维(Harvey)等人，1998，化学生物学新观点(Curr.Opin.Chem Biol)，2512-518)、RU486诱导型系统(王(Wang)等人，1997，自然生物技术(Nat.Biotech.)，15239-243和王(Wang)等人，1997，基因治疗(Gene Ther.)，4432-441)和雷帕霉素(rapamycin)诱导型系统(玛噶瑞(Magari)等人，1997，临床研究期刊(J.Clin.Invest.)，1002865-2872)。根据本发明一实施例，启动子是阿拉伯糖诱导型启动子。
所属领域的技术人员基于本文所提供的揭示内容应了解，本发明涵盖使用任何适宜细菌宿主细胞。例如，适用于此目的的细菌包括(但不限于)埃希氏杆菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、副球菌属(Paracoccus)或其组合。本发明也涵盖任何所述适宜细菌的任何适宜菌株。此外，所属领域的技术人员应认识到，本发明也涵盖使用适宜突变细胞。所属领域的技术人员基于本文所提供的指导能够容易地选择适于在特定环境中使用的宿主细胞。
适宜诱导型大肠杆菌表达载体的实例包括但不限于pTrc(阿曼(Amann)等人，1988，基因(Gene)，69301-315)、阿拉伯糖表达载体(例如，Pbad18，古兹曼(Guzman)等人，1995，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，1774121-4130)和pETIId(斯达迪尔(Studier)等人，1990，酶学方法(Methods in Enzymology)，18560-89)。由pTrc载体表达靶基因依赖于杂合体trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。由pETIId载体表达靶基因依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶T7gn1介导的T7gn10-lac融合启动子转录。此病毒聚合酶是在lacUV5启动子的转录控制下由宿主菌株BL21(DE3)或HMS I74(DE3)自含有T7gn1基因的驻留原噬菌体提供。PBAD系统依赖于由araC基因调节的诱导型阿拉伯糖启动子。可在阿拉伯糖存在下诱导所述启动子。
本发明的其它实施例使用阿拉伯糖调节的表达载体或其中所关注重组蛋白质的表达是在阿拉伯糖启动子(例如，用于大肠杆菌阿拉伯糖操纵子的启动子)控制下进行的载体PBAD或PARA，此并不具有限制意义。
本发明涵盖编码任何期望蛋白质的核酸(核苷酸)序列。核苷酸序列可为完整或部分天然存在的核苷酸序列或完整或部分经改变的核苷酸序列、或在严格条件下与其杂交的任何序列。本文中提及对应于基因的核酸序列是指可以期望蛋白质表达的任何核酸序列。
例如，所述经改变的核酸序列包括一个核苷酸缺失、取代(包括转换和颠换)、或插入，且其中所述改变可能发生在参考核苷酸序列的5′或3′末端位置或介于所述末端位置之间的任何地方，其各散布于参考序列中的核苷酸中或散布于参考序列内的一或多个邻近基团中。核苷酸改变的数量是通过以下来测定将任何序列中核苷酸的总数与各自一致性百分比的数值百分比(除以100)相乘并从所述序列中的所述核苷酸总数中减去乘积。
例如，本发明涵盖使用与某一核酸序列具有至少70％一致性的核苷酸序列；其简并变体或其片段，其中所述序列在核酸序列的整个聚核苷酸区域内可包括至多nn个核酸改变，其中nn是改变的最大数且通过下式来计算 nn＝xn-(xn·y)， 其中xn是任何序列的核酸总数且y值为0.70，其中在将xn和y的任何非整数乘积四舍五入到最接近的整数之后从xn中减去所述乘积。当然，y值也可为0.80(对于80％)、0.85(对于85％)、0.90(对于90％)、0.94(对于94％)、0.95(对于95％)、0.96(对于96％)、0.97(对于97％)、0.98(对于98％)、或0.99(对于99％)等。序列改变可在所述编码序列中产生无义、误义或移码突变且在所述改变后由此改变聚核苷酸所编码的多肽。
本发明涵盖使用其简并变体或片段。本文所定义的“简并变体”是由遗传密码的简并性所产生的不同于核苷酸序列(及其片段)但仍编码相同蛋白质的聚核苷酸。
所述核酸可包含DNA、染色体DNA、cDNA和RNA且可进一步包含异源核苷酸。按照各个实施例，所述核酸可在高度严格杂交条件下与某一核酸、其补体、其简并变体、或其片段杂交。在再一些实施例中，聚核苷酸可在中等严格杂交条件下杂交。
应了解，所述核酸可自天然、合成或半合成来源获得；而且，核苷酸序列可为天然存在的序列，或可通过突变(包括单或多碱基取代、缺失、插入和倒位)与所述天然存在的序列相关联。核酸分子可为RNA、DNA、单链或双链、线性或共价闭环形式。
严格条件的实例显示于下表严格条件中高度严格条件是至少如(例如)条件A-F一样严格者；严格条件是至少如(例如)条件G-L一样严格者；且降低的严格条件是至少如(例如)条件M-R一样严格者。
严格条件 bpI杂合体长度是杂交聚核苷酸的杂交区的预计长度。当将聚核苷酸与未知序列的靶聚核苷酸杂交时，杂合体长度假定为杂交聚核苷酸的长度。当杂交已知序列的聚核苷酸时，杂合体长度可通过比对聚核苷酸序列并识别出具有最佳序列互补性的一或多个区域来测定。
缓冲液H可用SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mMEDTA，pH值为7.4)代替杂交和洗涤缓冲液中的SSC(1xSSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后实施洗涤15分钟。
TB至TR长度预计小于50个碱基对的杂合体的杂交温度应较所述杂合体的解链温度(Tm)低5-10EC，其中Tm可根据以下等式确定。对于长度小于18个碱基对的杂合体来说，Tm(EC)＝2(A+T碱基的数量)+4(G+C碱基的数量)。对于长度介于18与49个碱基对之间的杂合体来说，Tm(EC)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是所述杂合体中碱基的数量，且[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于1×SSC来说，[Na+]＝0.165M)。
用于聚核苷酸杂交的严格条件的额外实例提供于萨姆布鲁克(Sambrook，J.)，弗里奇(E.F.Fritsch)和玛尼蒂斯(T.Maniatis)，1989，分子克隆实验室手册(MolecularCloningA Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(NY)，第9和11章和最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)，1995，奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人，编辑，约翰威立父子(John Wiley & Sons)公司，第2.10和6.3-6.4部分，其以引用方式并入本文中。
本发明涵盖使用与所述聚核苷酸完全互补的聚核苷酸以及反义序列。反义序列也称为反义寡核苷酸，其包括阻断编码本发明多肽的聚核苷酸表达的内部产生和外部投与的序列二者。本发明的反义序列包含(例如但不限于)约15-20个碱基对。可对反义序列进行设计以(例如)通过阻止启动子与上游非转译序列结合或通过阻止编码本发明多肽的转录物转译(通过阻止核糖体结合)抑制转录。
所属领域的技术人员应了解，所述聚核苷酸可以任何适宜方式(例如，通过化学合成、自DNA库、自生物体本身)制备或获得且可采取多种形式(例如，单链、双链、载体、探针、引物)。术语“聚核苷酸”包括DNA和RNA、以及其类似物，例如含有经修饰主链者。随着本发明的进一步实施，所述聚核苷酸包含DNA库，例如cDNA库。
2086蛋白质表达系统 本发明实施例提供能够表达脑膜炎奈瑟菌血清群B(Neisseria meningitidisserogroup B)2086多肽的重组微生物。所述重组微生物包含具有启动子序列和起始子序列的表达控制序列和编码2086多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于启动子和起始子序列的3′端。又一方面，本发明提供包含如本文和WO 03/063766和WO04/094596中所述的重组2086聚核苷酸的宿主细胞，所述专利案的全部内容均以引用方式并入本文中。因此，本发明提供产生如(例如但不限于)WO 03/063766和WO04/094596中所述的重组2086蛋白质的方法。
在通过用含有对应2086聚核苷酸的质粒转化、转染或感染宿主细胞以构建表达本发明期望蛋白质或多肽的宿主细胞后，按照本发明方法在可表达多肽的条件下对宿主细胞进行培养。随后可通过所属领域的技术人员所熟知的技术将多肽分离出来，所分离出来的多肽基本上不含杂质宿主细胞组份。
阈值参数 可使用数个参数来监测和控制培养进程的细胞生长和重组蛋白质表达。所述参数包括(但不限于)光密度(OD)、溶解氧(DO)、pH值、营养物/能量消耗(例如碳源)、代谢副产物(例如，乙酸)累积、收获时间、和温度。所属领域的技术人员基于本文所提供的指导应了解，本发明涵盖使用任何适宜参数或参数的组合。
确立阈值参数以确定将诱导物连续添加到培养物中的时间(即，经一段时间补加到培养物中)。阈值参数是预定参数。所属领域的技术人员基于本文所提供的指导按照本发明的各个实施例可容易地确定合适阈值参数(例如预定光密度)。可使用一个阈值参数或阈值参数的组合。
可在培养期间以任何适宜时间间隔对参数或参数的组合予以监测。例如，OD600和葡萄糖浓度可以一小时、半小时或四分之一小时间隔予以监测，此并不具有限制意义。
按照本发明实施例，光密度可用作开始连续补加诱导物的阈值参数。当培养物的细胞密度达到预定阈值参数(例如光密度为约70至约110)时，则如本文所述向培养物中补加诱导物。可确立较为狭窄的阈值参数范围。例如，按照本发明实施例，本发明涵盖当培养物的细胞密度达到约70至约105、约75至约100、约75至约95、约75至约85、约76至约84、约78至约82、或约80的光密度时我们开始向培养物中连续添加诱导物。
本发明也涵盖使用可指示开始和/或结束补加碳源的阈值参数。
所属领域的技术人员应了解，本发明涵盖使用任何适宜装置或装置的组合来监测一或多个阈值参数。例如，可以任何适宜方式将用于测量阈值参数的探针或探针组合安装在发酵装置(“发酵罐”)上，此并不具有限制意义。
恒定补料速度 恒定补料速度是指以此速度将一或多种诱导物和/或一或多种碳源添加到培养物中。在达到阈值参数后，将诱导物添加到培养物中。也可在达到阈值参数后将碳源添加到培养物中(且同样，在达到阈值参数后停止添加碳源)。这些阈值参数包括(但不限于)光密度(OD)、溶解氧(DO)、pH值、培养基中营养物的浓度、添加到培养基中的第一碳源的总浓度、或其任何组合。
所属领域的技术人员基于本文所提供的指导应了解，可使用任何适宜恒定速度将诱导物和/或碳源添加到培养物中。按照本发明的各个实施例，如下文实例中所述，通过DO恒定来确定适宜恒定速度。例如，可通过每小时添加足量葡萄糖使浓度高达15和24g/L来选择等效于DO恒定控制器的补料速度，此并不具有限制意义。
例如，可将诱导物和/或碳源以恒定速度添加到培养物中直到已将一定量的诱导物和/或碳源添加到培养物中，例如基于培养物的总体积约4g/L至约40g/L，例如，4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、9.5g/L、9.75g/L、10g/L、10.25g/L、10.5g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L.25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、31g/L、32g/L、33g/L、34g/L、35g/L、36g/L、37g/L、38g/L、39g/L、40g/L，此并不具有限制意义。根据各个实施例，补加到培养物中的诱导物和/或碳源的总量为约5g/L至约20g/L、7g/L至约15g/L、8g/L至约14g/L、9g/L至约11g/L、或约10g/L。
拟添加到培养物中的诱导物的总量可被已添加到培养物中的碳源的总量抵消。例如，当碳源是葡萄糖且诱导物是阿拉伯糖时，添加葡萄糖可使所添加诱导物的量减小。例如，在实施例中，向培养物中总共添加10g/L诱导物(即，例如阿拉伯糖)且添加11g/L碳源(例如葡萄糖)。以此方式获得的蛋白质产量近似于使用总量为20g/L的阿拉伯糖(即，在1,000L培养物中总共20,000g或20kg阿拉伯糖)且不使用葡萄糖时的产量。因此，考虑到相对于葡萄糖来说阿拉伯糖价格较高，本发明方法提供的此抵消甚为有利。
根据本发明的各个实施例，将诱导物和/或碳源添加到培养物中的恒定速度可设定在每小时约1.5g/L至约24g/L范围内。例如，在碳源是葡萄糖的情况下，用于添加葡萄糖的恒定速度可包括(但不限于)1.8g葡萄糖/L/h、3.3g葡萄糖/L/h、6.7g葡萄糖/L/h、15g葡萄糖/L/h、16.4g葡萄糖/L/h、18g葡萄糖/L/h、24g葡萄糖/L/h等。根据各个实施例，可以约1.5g/L/h至约16g/L/h的恒定速度添加诸如阿拉伯糖等诱导物。
根据各个实施例，在达到阈值参数后，可继续、停止或暂时中断碳源补加。在其中在达到开始补加的阈值后将重新开始以恒定速度补加的情况下可能中断碳源补加。因此，根据一实施例，可利用开始阈值和停止阈值来调节碳源到培养物中的补加。根据另一实施例，基于阈值参数以恒定速度补加葡萄糖和阿拉伯糖二者而没有停止或重新开始补加的情况。
所属领域的技术人员基于本文所提供的指导可容易地确定拟添加到任何特定培养物中的碳源的合适总量。根据本发明一实施例，添加到培养物中的碳源的总量可在约1g/L至约100g/L(基于以升计培养物的总体积)范围内。例如，根据一实施例，在生长期期间添加50g/L葡萄糖，此以培养基中的10g/L开始，在葡萄糖含量达到零时开始以恒定速度补加葡萄糖，并继续以恒定速度补加葡萄糖直到OD达到80，此时除开始的10g/L葡萄糖外已补加约40g/L葡萄糖。根据一实施例，以浓缩形式提供总量碳源以便于衡量。可容易地将这些量转化成拟在特定环境中使用的碳源的总质量。例如，当拟向1,000L培养物中添加10g/L碳源时，拟添加的碳源的总量可容易地确定为10g/LX1.000L＝10,000克(或10kg)总碳源。按照本文所述的各个实施例，所添加碳源的总量可作为阈值参数。
所属领域的技术人员基于本文所提供的指导可容易地确定拟添加到任何特定培养物中的诱导物的合适总量。按照各个实施例，添加到培养物中的诱导物的总量可在约4g/L至约40g/L(基于以升计培养物的总体积)范围内。根据各个实施例，基于培养物的总体积，添加到培养物中的碳源的总量为约5g/L至约20g/L、7g/L至约15g/L、8g/L至约14g/L、9g/L至约11g/L、或约10g/L。根据一实施例，以浓缩形式提供总量诱导物以便于衡量。可容易地将这些量转化成拟在特定环境中使用的诱导物的总质量。例如，当拟向1,000L培养物中添加10g/L诱导物时，拟添加的诱导物的总量可容易地确定为10g/L X 1.000L＝10,000克(或10kg)总诱导物。
新鲜培养基在接种宿主细胞时通常含有起始量的第一碳源，由此产生培养物。可监测此起始浓度且第一碳源的浓度用作阈值参数。
也可将合适量的除碳源之外的任何适宜补充物或营养物补加到培养物中。可对其它营养物或补充物予以监测并适当设定阈值。本发明涵盖使用诸如氮或无机磷酸盐来源等补充物。本发明方法所涵盖使用的化合物的非限制性实例包括KH2PO4、K2HPO4、柠檬酸钠二水合物、(NH4)2SO4、MgSO4、(Na)2SO4、CaCl2、FeSO4、氯霉素或其任何组合。也涵盖使用其它碳源或来源。
光密度和对数生长期 将细菌宿主细胞引入到新鲜培养基中可产生通常经历以下四个或多或少不同的生长期的培养物(i)滞后期，(ii)对数(对数或指数)期，(iii)静止期，和(iv)衰亡(死亡)期。对数期本身又可分成多个阶段，例如对数生长期早期、对数生长期中期和对数生长期晚期。光密度与对数生长期有关。对数生长期和光密度也可用作指示开始和/或停止连续补加碳源和/或诱导物的阈值参数。
例如，诱导或连续添加诱导物可开始于对数生长期早期、对数生长期中期和对数生长期晚期。对数生长期晚期可在OD为约70至约110时发生。在本发明实施例中，按照各个实施例，以恒定速度补加诱导物开始于培养基的对数生长期晚期或OD为约70至约110、约70至约105、约75至约85、或约80时。
可在所属领域的技术人员通常使用的多个波长下测量OD。通常，OD600用作培养物中细胞生长和细胞密度的指标。除非另外说明，否则本文所用的“OD”是指OD600。
溶解氧 可用作用于开始和/或停止补料控制器的触发因素的另一参数是溶解氧(DO)(即，DO恒定补料分批发酵)。DO可通过调节搅动、空气流、氧气补充和含有培养基的容器中的压力予以控制。可将DO的阈值设定在5％至80％DO范围内，例如，20％、40％或80％。在达到阈值后，开启碳源或诱导物的补料控制器，直到达到指示停止控制补加的阈值。所述停止阈值可为另一DO阈值或另一参数，例如碳源或诱导物的量。例如，按照本发明的各个实施例，每当培养基中的DO上升到30％或40％以上时，补料控制器即开启，直到DO降到20％，或另一选择为，直到新近添加了0.5g/L或1g/L碳源或诱导物。
pH值 可用作用于开始和/或停止补料控制器的触发因素的另一参数是pH值(即，pH值恒定补料-分批发酵)。pH值可通过向培养基中添加碱或酸来控制。可将pH值的阈值设定在6.8至7.2范围内，例如7.0。在达到阈值后，开启碳源或诱导物的补料控制器，直到达到指示停止控制补加的阈值。所述停止阈值可为另一pH值阈值或另一参数，例如碳源或诱导物的量。例如，按照本发明的各个实施例，每当培养基的pH值上升到6.97时，补料控制器即开启，直到pH值降到6.95，或另一选择为，直到新近添加了1g/L碳源或诱导物。
收获时间 收获时间代表在开始诱导或添加诱导物后经历时间的量。本发明涵盖任何适宜收获时间。按照本发明的各个实施例，收获时间可在约2小时至约10小时、约2小时至约8小时、约2.5小时至约7小时、约3小时至约6小时等范围内。使用所述恒定补料速度、收获时间和诱导物总量，所属领域的技术人员应了解如何对每个参数进行调节以达成期望结果。因为所属领域的技术人员基于补料速度和时间段可容易地确定补料的量，所以他们应了解基于所补加的阿拉伯糖的量何时收获。以此方式，在3小时内补加的诱导物的最终浓度可达到(例如但不限于)5、10、20、30和40g/L。
诱导物的浓度 本发明涵盖诱导物的任何适宜浓度。可用于诱导宿主细胞的诱导物的浓度可在约0.00001％至约20％(v/v)范围内，此并不具有限制意义。
温度 本发明实施例的培养物可在允许细胞生长的任何温度下进行培育。与充足生长有关的培育培养物的多个温度包括(但不限于)22℃、28℃、37℃、或其任何组合。
发酵装置 所属领域的技术人员应了解，本发明涵盖使用任何适宜发酵装置(即，“发酵罐”)。例如，发酵罐可含有任何数量的桨叶(例如，鲁施顿(Rushton)桨叶)、进口和/或测量探针。按照一实施例，发酵罐经构造以包括三片鲁施顿桨叶和用于将空气引入到发酵罐中的环式或管式分布器。本发明涵盖使用手动和/或基于计算机的系统。因此，发酵系统可与计算机化系统连接以监测和控制发酵。以此方式，按照本发明实施例，所述系统可完全或部分自动化。
本发明组合物 按照本发明实施例，本发明提供包含重组蛋白质的组合物，例如按照本发明方法所制备的组合物。本发明组合物在培养物中包含高密度的重组蛋白质，例如(并不意欲限于此)按照本发明方法制备的重组蛋白质。
所述组合物包含一种培养物，所述培养物具有基于培养物的总体积，密度为至少约1.5g/L的重组蛋白质。根据本发明的又一实施例，基于培养物的总体积，重组蛋白质的密度为至少约1.7g/L。根据本发明的另一实施例，基于培养物的总体积，重组蛋白质的密度为至少约2.0g/L。根据本发明的另一实施例，基于培养物的总体积，重组蛋白质的密度为至少约3.0g/L。
本发明实施例提供包含重组2086蛋白质的组合物。如本文所提及的2086蛋白质是由对应于脑膜炎奈瑟菌血清群B中的2086基因的聚核苷酸表达的蛋白质，包括其任何片段、衍生物或突变体。非限制性实例性2086蛋白质和聚核苷酸阐述于WO03/063766和WO 04/094596中。
所述重组2086蛋白质组合物包含培养物中的重组2086蛋白质，其中基于培养物的总体积，重组2086蛋白质的密度为至少约1.5g/L。根据本发明的又一实施例，基于培养物的总体积，重组2086蛋白质的密度为至少约1.7g/L。根据本发明的另一实施例，基于培养物的总体积，重组2086蛋白质的密度为至少约2.0g/L。根据本发明的另一实施例，基于培养物的总体积，重组2086蛋白质的密度为至少约3.0g/L。
本发明组合物可包含任何蛋白质，例如按照本发明方法所制备的蛋白质。重组蛋白质可为脂化或未脂化蛋白质。在本发明实施例中，重组蛋白质是脂化或未脂化重组2086蛋白质。重组2086蛋白质可为2086亚科A或亚科B蛋白质、或其组合。本发明组合物可包括一种蛋白质或多于一种蛋白质。所述蛋白质可为相关或无关蛋白质。例如，本发明组合物可包括对应于一或多种亚科A菌株和/或一或多种亚科B菌株的2086蛋白质。
本发明也提供包含可用于实施本发明方法的物质的组合物。按照本发明实施例，所述组合物包括培养物的必需组份，必需组份包括重组细胞和营养物。按照本发明实施例，多种组合物可以试剂盒形式一起提供。例如，可方便地将所需量的用以形成培养物的组份进行预先包装以便于在实验室或工业环境中使用，此并不具有限制意义。按照本发明的各个实施例，所述试剂盒也可包括有助于使用每一组份和合并组份方式的标签、标记和说明书。
本发明包括以下实例以阐释本发明的各个实施例。所属领域的技术人员应了解，下列实例中所揭示的技术代表本发明的发明者发现的可良好用于实施本发明的技术，且因此可认为这些技术构成用于实施本发明的多种模式。然而，所属领域的技术人员根据本揭示内容应了解，在所揭示具体实施例中可实施许多改变且仍可获得类似或同样结果，此并不背离本发明的精神和范围。
实例 实例1恒定补料速度的补料-分批发酵 大肠杆菌(pPW62)亚科B用作补料-分批发酵方法的模型菌株。基于结果，此方法适用于亚科A大肠杆菌(pPW102)。
使用下表中所列示的组份来制备用于补料-分批发酵的培养基和补料溶液。
培养基和补料溶液 表1基础培养基
表21000x痕量金属贮存液
表3葡萄糖浓缩物补料溶液
表4阿拉伯糖浓缩物补料溶液
方法 利用恒定补料速度的补料-分批发酵来达成高细胞密度大肠杆菌发酵。培养基中的起始葡萄糖浓度是10g/L。将发酵培养基中的(NH4)2SO4浓度增加到3g/L，但种子培养基中保持在1g/L。为确定补料速度，首先实施DO恒定的补料-分批发酵。借助可使搅动速度增加到最大并随后利用氧气补充的级联控制器将DO含量控制在20％下。当葡萄糖耗尽时，DO急剧上升(大于40％)并将葡萄糖浓缩物添加到发酵罐中使其最终浓度为1g/L。在每次添加葡萄糖后，在允许进行下一次添加之前，使泵保持不工作达设定时间段。当实施DO恒定补料-分批发酵时，OD最大值可达到约160。随后通过每小时添加足量葡萄糖使浓度高达18g/L或24g/L来选择等效于DO恒定控制器的恒定速度。在以恒定速度补料的补料-分批发酵期间，当DO急剧上升到40％时开始以期望恒定速度补加葡萄糖。
使用1小瓶大肠杆菌(pPW62)/升基础培养基+15μg/mL氯霉素在2800mL冯巴赫烧瓶(Fernbach flask)中开始种子培养。将烧瓶在32℃、150rpm下培育过夜(约16hr)。最终的OD600一般约等于3。使用10％接种量来接种每个发酵罐。每个发酵罐使用3片鲁施顿桨叶和环式分布器。起始设定点温度36℃，pH值7.00±0.05(用7.4N NH4OH控制)，空气流约1vvm，DO20％。DO是由搅动(最小值150rpm，最大值1000rpm)和经由气体混合单元添加O2的级联来控制。如果需要，通过手动添加PPG-2000来控制泡沫。在灭菌之前向培养基中添加0.35mL/L AF。在发酵期间，每小时取样一次以监测葡萄糖、pH值和OD600离线值。自1mL样品制备上清液并储存用于以后通过HPLC分析有机酸。
结果 恒定补料速度的补料-分批发酵 图1显示恒定补料速度下OD、葡萄糖消耗和乙酸累积的时间进程。在24g葡萄糖/L/h和18g葡萄糖/L/h恒定补料速度下获得的OD最大值分别为158和150。当使用24g/L/h补料速度时，实验期间葡萄糖累积较多，为28g/L。当使用18g/L/h补料速度时，葡萄糖累积到12g/L。在两种情况下均产生较少乙酸(即，小于1.5g/L)。指数生长期结束时OD接近100。在两种情况下具体生长速度约为0.60(hr-1)。
为减少葡萄糖累积，对16.4g/L/h和15g/L/h的低恒定补料速度进行研究。图2显示上文提及恒定补料速度下OD、葡萄糖消耗和乙酸累积的时间进程。OD的最大值分别为142和147。与先前实验一样，补料速度较快的培养物葡萄糖累积较多，尽管葡萄糖累积的量比先前实验少很多。在16.4g/L/h期间累积约8g/L葡萄糖，而在15g/L/h发酵期间累积5.4g/L葡萄糖。在两种情况下均产生较少乙酸(例如小于1.5g/L)(参见图2)。在两种情况下具体生长速度约为0.60(hr-1)。因此，具体生长速度不受介于15g/L/h与24g/L/h之间的补料速度影响。
在不同生长OD下进行诱导 因为15g葡萄糖/L/h的恒定补料速度达成较高细胞密度和较低葡萄糖和乙酸累积，所以使用其进行阿拉伯糖诱导研究。在此实验中，将在对数生长期中期OD约为55时和在对数生长期晚期OD约为80时实施诱导进行比较。通过简单地用阿拉伯糖补料代替葡萄糖补料并以13.4g/L/h的恒定速度补加阿拉伯糖来诱导培养物。经3小时时间段将总共40g/L阿拉伯糖添加到每一培养物中。诱导后，每小时取样一次以用于通过SDS-PAGE分析rLP2086、通过HPLC分析有机酸和阿拉伯糖。
图3显示在OD约为55和约为80下诱导时OD和rLP2086产生的时间进程。在OD约为80下诱导细胞时，OD的最大值和rLP2086产量二者均较高(OD的最大值101相对于84；最大产量1.8g/L相对于1.2g/L)。
用不同量的阿拉伯糖进行诱导 以下实验的目的是对补加到培养物中的阿拉伯糖的总量进行评价并检验降低补加到培养物中的阿拉伯糖的总量是否仍然达成较高的rLP2086表达。将阿拉伯糖浓缩物分别以不同补料速度经3小时时间段补加到4份不同的培养物中，使最终阿拉伯糖浓度为10、20、30和40g/L。所有培养物都在OD600约为80下进行诱导。图4显示OD和rLP2086产生的时间进程。表5概述四种条件中每一种条件的OD和rLP2086产量。其显示，添加总共10g/L阿拉伯糖时rLP2086的最大产量为1.2g/L；添加总共20g/L阿拉伯糖时为1.6g/L；添加总共30g/L阿拉伯糖时为1.7g/L；添加总共40g/L阿拉伯糖时为2.0g/L。介于20g/L与40g/L之间的阿拉伯糖补料达成类似的rLP2086产量，然而，10g/L阿拉伯糖产生很少rLP2086(即，1.2g/L)。这些结果表明，添加用于诱导的阿拉伯糖的总量可自40g/L降低到20g/L，此并不会降低rLP2086的生产量。因此，尤其考虑到阿拉伯糖的价格较高(约为500美元/kg US)，阿拉伯糖使用量降低将更具成本有效性。
表5在不同阿拉伯糖含量下进行诱导
阿拉伯糖添加方法的比较 实施以下实验以检验当使用阿拉伯糖进行诱导时连续补加策略是否优于简单分批添加策略。在X-BRN05-039实验中，当OD为约80时，将20g/L阿拉伯糖同时添加到发酵罐中，而非经一段时间补加。图5显示OD、葡萄糖和阿拉伯糖消耗、和rLP2086产生的时间进程。最多获得1.3g/L rLP2086。虽然分批添加阿拉伯糖的操作较为简单，但其较连续补加产生较少rLP2086。因此，连续阿拉伯糖补加策略优于简单分批添加。
为检验通过降低阿拉伯糖补料速度能否使阿拉伯糖的使用更加有效，对3.3g阿拉伯糖/L/h和6.7g阿拉伯糖/L/h补料速度进行比较。图6显示OD和rLP2086产生的时间进程。将阿拉伯糖浓缩物经3小时时间段以6.7g/L/h补料速度补加到一份培养物中，并经6小时时间段以3.3g/L/h速度补加到第二份培养物中。对于两份培养物，所添加阿拉伯糖的总量均为20g/L。如图6中所示，两种条件能够产生的rLP2086的最大量相同(即，2.2g/L)，但其产生动力学有所差异。较高的补料速度达成较高的产生速度。分别在6.7g/L/h和3.3g/L/h补料速度诱导后3小时和6小时时达到rLP2086的最大量。使用较高补料速度(即，6.7g/L/h)的优势在于使用较高补料速度比使用较低补料速度生产成本(例如，效用成本)低。
诱导时间对rLP2086表达产量的影响 为确定最佳收获时间，将通常的补料分布(经3小时补加20g/L阿拉伯糖)延长到经6小时补加40g/L。在实验X-BRN05-028和X-BRN05-029中，分别在OD约为55和OD约为80时诱导细胞。图7显示OD和rLP2086产生的时间进程。尽管阿拉伯糖补加自3小时延长到6小时，但有趣的是，仍在诱导后约3小时时获得峰值效价。在较高OD下诱导的培养物中，产物效价略微较高。在OD约为55下诱导时rLP2086的最大产量为2.0g/L(X-BRN05-028)，而在OD约为80下诱导时最大产量为2.4g/L(X-BRN05-029)。此结果表明，应在诱导后3小时收获细胞。
含盐和不含盐补料溶液的比较 为检验所添加的盐在葡萄糖和阿拉伯糖补料溶液中是否必需，将普通葡萄糖和阿拉伯糖补料与标准葡萄糖+盐(即，K2HPO4/KH2PO4+(NH4)2SO4)和阿拉伯糖+盐补料进行比较。对于两种培养物，均经3小时时间段补加20g/L阿拉伯糖。生长分布和rLP2086产量分布非常类似。当向补料中添加盐时rLP2086的最大产量为1.8g/L，且当所制备的葡萄糖和阿拉伯糖补料不含盐时最大产量为2.0g/L。这些结果表明，没有必要向葡萄糖和阿拉伯糖补料溶液中添加盐。
亚科B菌株的恒定补料速度的补料-分批发酵 通过用1ml已解冻的工作种子接种含有15μg/mL氯霉素的1L基础培养基开始种子培养。使培养物在2.8L冯巴赫烧瓶中生长并在32℃和150rpm下培育约16小时。最终OD600约为3.0。在无菌条件下将350mL种子培养物转移到含有3g/L(NH4)2SO4但不含氯霉素的3.15L基础培养基中。发酵物控制如下pH值为7.0±0.05(借助7.4N NH4OH控制)，温度为36℃，DO为20％，且空气流为1vvm。通过搅动(最小值150rpm，最大值1000rpm)和氧气添加的级联来控制DO。自动添加消泡剂PPG-2000以控制泡沫。在发酵期间，每小时取样一次以监测葡萄糖和OD离线值。接种后，DO自约100％降低到20％且随后保持在20％。当DO自20％急剧上升到大于40％时(通常为6小时耗用发酵时间(EFT))，葡萄糖(不含盐)补料泵开启为15g/L/h速度。如图8中所示，经6小时EFT葡萄糖完全耗尽，导致DO急剧上升。当OD达到约40时每半小时取样一次。在OD为90时停止葡萄糖补加并开始以13.4g/L/h速度补加阿拉伯糖。在补加3小时阿拉伯糖(不含盐)(即，总共添加20g/L阿拉伯糖)后，停止补加阿拉伯糖并再继续发酵1小时。如图8中所示，所达成的OD为102且基于SDS-PAGE分析2.0g/L MnB rLP2086被表达(参见图9)。在诱导后3小时(即，约12小时EFT)出现峰值。SDS-PAGE和蛋白质印迹显示所表达的蛋白质确实为亚科B rLP2086。
补料-分批发酵方法应用于MnB rLP2086亚科A菌株 为测试用于rLP2086亚科B的所述补料-分批发酵方法是否适用于rLP2086亚科A，利用对于亚科B菌株所确立的程序实施此方法。图10显示OD、葡萄糖和阿拉伯糖消耗、和rLP2086产生的时间进程。亚科A的生长分布和rLP2086产量分布与亚科B所获得者类似(与图8相比)。SDS-PAGE和蛋白质印迹显示所表达的蛋白质确实为亚科A rLP2086(参见图11)。表6列示六个不同亚科A实验的OD最大值和rLP2086的最大表达产量。rLP2086的最大表达产量的范围是1.5-2.1g/L(平均最大产量1.8±0.2g/L)，与来自用于生产rLP2086亚科B的补料-分批发酵的结果接近。因此，提出用于亚科B菌株的所述补料-分批发酵也适用于亚科A菌株。
表6亚科A rLP2086的最大表达产量和OD最大值
在阿拉伯糖诱导期间双重补加葡萄糖和阿拉伯糖 为在不降低rLP2086产量的情况下降低所需阿拉伯糖的量，对诱导阶段期间双重补加葡萄糖和阿拉伯糖进行研究。策略为经3hr补加10g/L阿拉伯糖(通常量的一半)，同时在诱导期期间以标准葡萄糖补料速度的25％(3.75g/L/h)、50％(7.5g/L/h)和100％(15g/L/h)继续补加葡萄糖。所制备的所有补料(葡萄糖和阿拉伯糖)均不含添加剂。
图12a、12b和12c显示亚科B细胞生长、葡萄糖、阿拉伯糖、乙酸浓度、和rLP2086产生的时间进程。所有三个实验均在OD约为80时进行诱导。如图12a中所示，100％葡萄糖补料实验的OD在诱导后继续上升，峰值为117，而50％实验的峰值为106(图12b)且25％实验的OD在诱导后保持在100左右(图12c)。100％葡萄糖补料实验在诱导后3小时时开始累积葡萄糖和阿拉伯糖。50％葡萄糖实验仅在最后样品中显示微量葡萄糖(读数为0.21g/L)。在25％葡萄糖实验中无葡萄糖累积。三个实验中均无任何阿拉伯糖累积。100％(图12a)和50％(图12b)葡萄糖补料实验分别产生约1.5和1.7g/L rLP2086，而25％(图12c)实验产生超过2.1g/L的rLP2086。在阿拉伯糖用尽之前100％实验产量达到峰值，表明rLP2086表达可能被葡萄糖和乙酸累积所抑制。50％实验产量约在阿拉伯糖用尽时达到峰值且25％实验产量在阿拉伯糖用尽之后达到峰值，此表明只要将葡萄糖浓度控制在最低水平(在图12b和12c中无葡萄糖累积)2086表达可不受抑制。尽管仅10g/L阿拉伯糖补加到这些培养物中，但其rLP2086产量与补加20g/L时所获得者接近。当在诱导期间将葡萄糖浓度控制在较低水平时，同时补加葡萄糖和阿拉伯糖可使阿拉伯糖消耗降低50％且仍然达成相同rLP2086产量。因此，可显著降低化学品的成本。
为检验我们能否进一步降低阿拉伯糖消耗并提高rLP2086产量，对不同葡萄糖补料速度、阿拉伯糖补料的总量、和诱导OD进行研究。表7列示这些条件的不同组合。已显示葡萄糖补料速度介于2.25与7.5g/L/h之间和阿拉伯糖补料速度介于1.7和6.7g/L/h之间不会显著影响rLP2086的产量。诱导OD介于80与105之间获得的rLP2086产量接近。
表7在不同葡萄糖补料速度、不同阿拉伯糖添加量、和于不同OD下进行诱导时OD的最大值和rLP2086的最大量
实例3按比例放大到100L规模的补料-分批发酵 通过用1ml(即，1小瓶)已解冻的工作种子接种含有15μg/mL氯霉素的2X1L基础培养基开始种子培养。将2.8L冯巴赫烧瓶中的培养物在32℃和150rpm下在旋转振荡器中培育约16小时。
在无菌条件下将两份1L过夜冯巴赫烧瓶种子培养物转移到含有70L基础培养基但不含氯霉素的150L发酵罐中。基础培养基中的150L发酵物控制如下pH值为7.0±0.05(借助7.4N NH4OH控制)，温度为36℃，DO为20％，且空气流为1vvm。通过搅动和氧气添加的级联来控制DO。自动添加消泡剂PPG-2000以控制泡沫。在发酵期间，DO自约100％降低到20％且保持在20％下。当DO自20％急剧上升到大于40％(通常在OD约为20下)时，指示葡萄糖已耗尽，开动补料泵以用15g葡萄糖/L发酵液/h的速度递送葡萄糖浓缩物(即，500g/L)。在发酵期间，每小时取样一次以监测葡萄糖和OD离线值。当OD达到约40时，每半小时取样一次。在OD达到约80后，停止补加葡萄糖并开始以6.7g阿拉伯糖/L发酵液/h的速度补加阿拉伯糖(例如，500g/L阿拉伯糖浓缩物)，持续3小时。
图13a显示100L规模时亚科B细胞生长、葡萄糖消耗、乙酸累积、和rLP2086产生的时间进程。100L规模的发酵分布与所观察到的小规模的发酵分布类似。所获得OD的最大值为99且rLP2086的最大产量为1.9g/L。这些结果表明补料-分批发酵可按比例缩放。
图13b显示100L规模时亚科A细胞生长、葡萄糖消耗、乙酸累积、和rLP2086产生的时间进程。100L规模的发酵分布与所观察到的小规模的发酵分布类似。所获得OD的最大值为96且rLP2086的最大产量为2.0g/L。这些结果表明补料-分批发酵可按比例缩放并且切实可行。
图14a显示100L规模时葡萄糖和阿拉伯糖双重补料下亚科B细胞密度、葡萄糖、阿拉伯糖、乙酸浓度、和rLP2086产量的时间进程。在诱导期间，对于葡萄糖和阿拉伯糖补料，补料速度分别控制在3.75和1.67g/L/h。经5小时双重补加阿拉伯糖和葡萄糖。所获得OD的最大值为90且rLP2086的最大产量为1.8g/L。在诱导4小时后rLP2086达到最大产量。对于亚科B来说，OD的平均最大值和rLP2086的平均最大产量分别为84.8±6.8和1.6±0.3g/L。这些结果表明，在诱导期期间双重补加葡萄糖和阿拉伯糖的补料-分批发酵可按比例缩放。
图14b显示100L规模时亚科A细胞生长、葡萄糖消耗、乙酸累积、和rLP2086产生的时间进程。在与上一段落相同的条件下进行发酵并将细胞诱导6小时。所获得OD的最大值为89且rLP2086的最大产量为1.8g/L。在诱导4小时后rLP2086达到最大产量。对于亚科A来说，OD的平均最大值是87.9±10.5且rLP2086的平均最大产量是1.8±0.2g/L。这些结果表明所述补料-分批发酵可按比例缩放并且切实可行。
尽管已参照多个实施例和实例对本发明予以阐述，但所属领域的技术人员应认识到，可在不背离本发明精神和范围下对其进行各种修改。
权利要求
1、一种生产重组蛋白质的方法，其包含
培养表达重组蛋白质的重组细菌细胞，此包含向包含所述重组细菌细胞的培养物中连续添加碳源并在所述培养物达到阈值参数后向所述培养物中连续添加诱导物，和自所述培养物中分离所述重组蛋白质。
2、如权利要求1所述的方法，其中所述阈值参数是光密度(OD)、溶解氧(DO)、培养基中营养物的浓度、添加到培养基中的碳源的总浓度、或其任何组合。
3、如权利要求2所述的方法，其中所述阈值参数是所述培养物的光密度(OD)。
4、如权利要求3所述的方法，其包含当所述培养物的所述细胞密度达到约70至约110OD600时向所述培养物中连续添加所述诱导物。
5、如权利要求4所述的方法，其包含当所述培养物的所述细胞密度达到约70至约105OD600时向所述培养物中连续添加所述诱导物。
6、如权利要求5所述的方法，其包含当所述培养物的所述细胞密度达到约75至约85OD600时向所述培养物中连续添加所述诱导物。
7、如权利要求6所述的方法，其包含当所述培养物的细胞密度达到约80OD600时向所述培养物中连续添加所述诱导物。
8、如权利要求1所述的方法，其包含以恒定速度将所述诱导物添加到所述培养物中、通过DO恒定补料将所述诱导物添加到所述培养物中或通过pH值恒定补料将所述诱导物添加到所述培养物中。
9、如权利要求1所述的方法，其包含以约3.35g/L/h至约16g/L/h的恒定速度将所述诱导物添加到所述培养物中、通过DO恒定补料或通过pH值恒定补料将所述诱导物添加到所述培养物中。
10、如权利要求1所述的方法，其中添加到所述培养物中的所述诱导物的总量为约4g/L至约40g/L。
11、如权利要求10所述的方法，其中在诱导物补料期间添加到所述培养物中的所述诱导物的总量为约5g/L至约20g/L。
12、如权利要求11所述的方法，其中在诱导物补料期间添加到所述培养物中的所述诱导物的总量为约7g/L至约15g/L。
13、如权利要求12所述的方法，其中在诱导物补料期间添加到所述培养物中的所述诱导物的总量为约10g/L。
14、如权利要求1所述的方法，其包含在所述方法开始后将所述诱导物连续添加到所述培养物中达约2至约8小时。
15、如权利要求14所述的方法，其包含在开始后将所述诱导物连续添加到所述培养物中达约3至约6小时。
16、如权利要求1所述的方法，其包含在开始将所述诱导物添加到所述培养物中之后约2至约8小时分离所述重组蛋白质。
17、如权利要求16所述的方法，其包含在开始将所述诱导物添加到所述培养物中之后约3至约6小时分离所述重组蛋白质。
18、如权利要求1所述的方法，其中所述诱导物是阿拉伯糖。
19、如权利要求1所述的方法，其包含在诱导之前将所述碳源连续添加到所述培养物中。
20、如权利要求1所述的方法，其包含在诱导之前和期间将所述碳源连续添加到所述培养物中。
21、如权利要求1所述的方法，其包含在将所述诱导物连续添加到所述培养物中的同时将所述碳源连续添加到所述培养物中。
22、如权利要求1所述的方法，其包含将所述碳源连续添加到所述培养物中直到所述培养物的所述细胞密度达到约70至约110OD600。
23、如权利要求1所述的方法，其中所述碳源是基于糖的碳源。
24、如权利要求23所述的方法，其中所述基于糖的碳源是葡萄糖。
25、如权利要求24所述的方法，其中所述诱导物是阿拉伯糖。
26、如权利要求25所述的方法，其包含在将所述阿拉伯糖连续添加到所述培养基中的同时将所述葡萄糖连续添加到所述培养基中。
27、如权利要求25所述的方法，其包含连续添加所述葡萄糖直到所述培养物的所述细胞密度达到约80OD600。
28、一种生产重组蛋白质的方法，其包含
a)在诱导型启动子控制下将编码重组蛋白质的表达载体引入到细菌宿主细胞中以形成重组细菌细胞；
b)将所述重组细菌细胞引入到培养基中以形成细胞培养物；
c)以连续补料形式将碳源添加到所述细胞培养物中；
d)监测所述细胞培养物中的细胞生长是否达到阈值光密度(OD600)；
e)在达到所述阈值光密度(OD600)后，以连续补料形式将所述诱导型启动子的诱导物添加到所述细胞培养物中；和
f)自所述细胞培养物中分离所述重组蛋白质。
29、如权利要求28所述的方法，其包含在所述培养物的所述细胞密度达到约70至约110OD600时向所述培养物中连续添加所述诱导物。
30、如权利要求29所述的方法，其包含在所述培养物的所述细胞密度达到约70至约105OD600时向所述培养物中连续添加所述诱导物。
31、如权利要求30所述的方法，其包含在所述培养物的所述细胞密度达到约75至约85OD600时向所述培养物中连续添加所述诱导物。
32、如权利要求31所述的方法，其包含在所述培养物的所述细胞密度达到约80OD600时向所述培养物中连续添加所述诱导物。
33、如权利要求28所述的方法，其中所述诱导物是以恒定速度添加到所述培养物中、所述诱导物是通过DO恒定补料添加到所述培养物中或所述诱导物是通过pH值恒定补料添加到所述培养物中。
34、如权利要求33所述的方法，其中所述诱导物是以约3.35g/L/h至约16g/L/h的恒定速度添加到所述培养物中、所述诱导物是通过DO恒定补料添加到所述培养物中或所述诱导物是通过pH值恒定补料添加到所述培养物中。
35、如权利要求28所述的方法，其中添加到所述培养物中的诱导物总量为约4g/L至约40g/L。
36、如权利要求35所述的方法，其中添加到所述培养物中的诱导物总量为约5g/L至约20g/L。
37、如权利要求36所述的方法，其中添加到所述培养物中的诱导物总量为约7g/L至约15g/L。
38、如权利要求37所述的方法，其中添加到所述培养物中的诱导物总量为约10g/L。
39、如权利要求28所述的方法，其包含在开始诱导物补料后约2小时至约8小时自所述培养物中分离所述重组蛋白质。
40、如权利要求39所述的方法，其包含在开始诱导物补料后约3小时至约6小时自所述培养物中分离所述重组蛋白质。
41、如权利要求28所述的方法，其中在所述碳源和所述诱导物二者的恒定速度补料期间、在所述碳源和所述诱导物二者的DO恒定补料期间或在所述碳源和所述诱导物二者的pH值恒定补料期间将所述碳源添加到所述细胞培养物中。
42、如权利要求28所述的方法，其中所述诱导物是阿拉伯糖。
43、如权利要求28所述的方法，其中所述碳源是基于糖的碳源。
44、如权利要求43所述的方法，其中所述基于糖的碳源是葡萄糖。
45、如权利要求28所述的方法，其中所述碳源是葡萄糖且所述诱导物是阿拉伯糖。
46、如权利要求45所述的方法，其包含在将所述阿拉伯糖连续添加到所述细胞培养物中的同时将葡萄糖连续添加到所述细胞培养物中。
47、如权利要求45所述的方法，其包含向所述细胞培养物中连续添加葡萄糖直到所述细胞培养物的所述细胞密度达到约80OD600。
48、一种生产重组蛋白质的方法，其包含
培养表达重组蛋白质的重组细菌细胞，其是通过在包含所述细菌细胞的培养物达到阈值参数后向所述培养物中连续添加诱导物来培养，其中所述细菌细胞包含对应于脑膜炎奈瑟菌血清群B(N.meningitidis serogroup B)基因的核酸序列。
49、如权利要求48所述的方法，其中所述阈值参数是光密度(OD)、溶解氧(DO)、pH值、培养基中营养物的浓度、添加到培养基中的碳源的总浓度、或其任何组合。
50、如权利要求49所述的方法，其中所述阈值参数是所述培养物的光密度(OD)。
51、如权利要求50所述的方法，其中当所述培养物的所述细胞密度达到约70至约110OD600时开始所述诱导物连续补料。
52、如权利要求51所述的方法，其中当所述培养物的所述细胞密度达到约70至约105OD600时开始所述诱导物连续补料。
53、如权利要求52所述的方法，其中当所述培养物的所述细胞密度达到约75至约85OD600时开始所述诱导物连续补料。
54、如权利要求53所述的方法，其中当所述培养物的所述细胞密度达到约80OD600时开始所述诱导物连续补料。
55、如权利要求48所述的方法，其中所述诱导物是以约3.35g/L/h至约16g/L/h的恒定速度添加到所述培养物中、所述诱导物是通过DO恒定补料来添加或所述诱导物是通过pH值恒定补料来添加。
56、如权利要求48所述的方法，其中在诱导期间添加到所述培养物中的诱导物总量为约4g/L至约40g/L。
57、如权利要求56所述的方法，其中在诱导期间添加到所述培养物中的诱导物总量为约5g/L至约20g/L。
58、如权利要求57所述的方法，其中在诱导期间添加到所述培养基中的诱导物总量为约7g/L至约15g/L。
59、如权利要求58所述的方法，其中在诱导期间添加到所述培养物中的诱导物总量为约10g/L。
60、如权利要求48所述的方法，其中在所述方法开始后所述诱导物补料持续约2小时至约8小时。
61、如权利要求60所述的方法，其中在所述方法开始后所述诱导物补料持续约3小时至约6小时。
62、如权利要求48所述的方法，其中在开始诱导物补料后约2小时至约8小时收获所述重组蛋白质。
63、如权利要求62所述的方法，其中在开始诱导物补料后约3小时至约6小时分离所述重组蛋白质产物。
64、如权利要求48所述的方法，其中在将诱导物补加到所述培养物中期间继续将所述碳源补加到所述培养基中。
65、如权利要求48所述的方法，其中所述诱导物是阿拉伯糖。
66、如权利要求48所述的方法，其中所述碳源是基于糖的碳源。
67、如权利要求66所述的方法，其中所述基于糖的碳源是葡萄糖。
68、如权利要求67所述的方法，其中所述诱导物是阿拉伯糖。
69、如权利要求68所述的方法，其中在将阿拉伯糖以恒定速度补加到所述培养物中期间、在所述葡萄糖和所述诱导物二者的DO恒定补料期间或通过所述葡萄糖和所述诱导物二者的pH值恒定补料，将葡萄糖以恒定补料速度补加到所述培养物中。
70、如权利要求68所述的方法，其中在将阿拉伯糖以恒定速度补加到所述培养物中期间，通过所述葡萄糖和所述诱导物二者的DO恒定补料直到所述培养物中的所述细胞密度达到约80OD600或通过所述葡萄糖和所述诱导物二者的pH值恒定补料直到所述培养物中的所述细胞密度达到约80OD600，将葡萄糖以恒定补料速度补加到所述培养物中。
71、如权利要求68所述的方法，其中所述重组脑膜炎球菌2086蛋白质包含脂蛋白(rLP2086)。
72、如权利要求68所述的方法，其中所述蛋白质包含未脂化蛋白质。
73、如权利要求68所述的方法，其中所述蛋白质包含脑膜炎球菌2086亚科A蛋白质。
74、如权利要求68所述的方法，其中所述蛋白质包含脑膜炎球菌2086亚科B蛋白质。
75、一种生产重组脑膜炎球菌2086蛋白质(P2086)的方法，其包含
(a)在诱导型启动子控制下将编码重组2086蛋白质的表达载体引入到细菌宿主细胞中以形成重组细菌细胞；
(b)将所述重组细菌细胞引入到培养基中以形成培养物；
(c)向所述培养物中添加碳源；
(d)监测所述培养物中的细胞生长是否达到阈值光密度(OD)；
(e)在所述培养物的所述细胞密度达到约70至110的光密度后，将所述诱导型启动子的诱导物连续添加到所述培养物中；和
(f)在开始连续添加所述诱导物后约3小时至约6小时后，自所述培养物中分离所述重组脑膜炎球菌2086蛋白质。
76、一种组合物，其包含
细菌培养物，所述细菌培养物包含基于所述细菌培养物的总体积，密度为至少约1.5g/L的重组脑膜炎球菌2086蛋白质。
77、如权利要求76所述的组合物，其中所述重组脑膜炎球菌2086蛋白质是脂化蛋白质。
78、如权利要求76所述的组合物，其中所述重组脑膜炎球菌2086蛋白质是未脂化蛋白质。
79、如权利要求76所述的组合物，其中所述重组脑膜炎球菌2086蛋白质是2086亚科A蛋白质。
80、如权利要求76所述的组合物，其中所述重组蛋白质是2086亚科B蛋白质。
81、如权利要求80所述的组合物，其中所述培养物包含第二重组脑膜炎球菌2086蛋白质。
82、如权利要求81所述的组合物，其中所述第二2086重组脑膜炎球菌蛋白质是2086亚科A蛋白质。
83、如权利要求76所述的组合物，其中基于所述细菌培养物的总体积，所述重组脑膜炎球菌2086蛋白质的密度为至少约1.7g/L。
84、如权利要求76所述的组合物，其中基于所述细菌培养物的总体积，所述重组脑膜炎球菌2086蛋白质的密度为至少约2.0g/L。
85、如权利要求76所述的组合物，其中基于所述细菌培养物的总体积，所述重组脑膜炎球菌2086蛋白质的密度为至少约3.0g/L。
86、一种组合物，其包含
细菌培养物，所述细菌培养物包含按照如权利要求1-75中任一权利要求所述的方法所制备的重组脑膜炎球菌2086蛋白质。
全文摘要
本发明提供生产蛋白质(例如，重组脑膜炎球菌2086蛋白质)的方法、以及高密度蛋白质组合物和用于本发明方法的组合物，所述方法利用补料-分批发酵并在达到阈值参数后连续投入诱导物且任选地连续投入碳源(例如，恒定速度投入)以提高蛋白质产量。
文档编号C12P21/06GK101535493SQ200780027778
公开日2009年9月16日 申请日期2007年7月21日 优先权日2006年7月27日
发明者卫强·威利·孙, 厄尔·珀塞尔 申请人:惠氏公司