专利名称：：无血清培养基及其在软骨细胞扩增中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及细胞和组织培养领域。更具体地，本发明涉及细胞离体增殖的方法和组合物，所述细胞能够形成软骨组织用于治疗或修复软骨缺陷。
背景技术：
：关节软骨由包围在由软骨细胞产生的复杂的细胞外基质中的软骨细胞组成。此基质独特的生物化学组成提供了光滑的、几乎无摩擦运动的关节连接表面。随年龄增长，由于生物化学的变化，人关节软骨的拉伸性质随之改变。三十岁以后，关节软骨的拉伸强度显著降低。由于创伤或疾病例如类风湿和骨关节炎而对软骨造成的损伤，能够导致严重的身体虚弱。由于软骨无法自身修复，于是人们研发了若干外科策略以减轻与软骨损伤相关的临床症状。仅在美国，每年就要进行多于500,000次关节造形术和关节置换术。自体软骨细胞移植是已经被批准用于治疗关节软骨缺陷的方法。该方法包括从股骨髁的非承重部位获取一块软骨，离体增殖分离的软骨细胞，然后植回同一患者的体内。Brittberg等人，NewEngl.J.Med.331:889-895(1994)。关节软骨细胞表达关节软骨特异性细胞外基质成分。关节软骨细胞一经收集并通过酶消化与组织分离后，就可以单层培养用于增殖扩增。然而在组织培养过程中，这些细胞形成成纤维细胞形态，不再产生透明样关节软骨特有的n型胶原和蛋白聚糖。这样的"去分化"细胞快速增殖，并产7生纤维组织特有的I型胶原。但是，当处于适当环境如体外悬浮培养基(Aulthouse等人，InVitroCell.&Devel.Biology25:659-668(1989))或体内软骨缺陷环境(Shortkroff等人，Biomaterials17:147-154(1996))时，细胞再分化，即再次表达关节软骨特异性基质分子。去分化的可逆性是用培养的自体软骨细胞成功修复关节软骨的关键。人软骨细胞通常在补加10%(v/v)胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco，sModifiedEagle'sMedium,DMEM)中培养。Aulthouse等人，InVitroCell.&Devel.Biology,25:659-668(1989);Bo,ent訓等人，Exp.CellRes.，212:97-104(1994)。然而，尽管血清广泛用于哺乳动物细胞培养，但使用血清却存在若干问题(l)血清含有许多未经确定的或非定量的成分，因此不是"确定的，，；(2)血清的组成依批次而有所变化，使得对于实验或细胞培养的其它用途来说，难以进行标准化；(3)许多血清成分影响细胞附着、增殖和分化，使得这些参数难以控制；(4)一些血清成分对于特定细胞的增殖是抑制性的，在一定程度上可能抵消其增殖效果，导致生长欠佳；及(5)血清可能含有病毒和其它病原体，可能影响实验结果，或如果培养细胞预期#^人体，则可能带来潜在的健康危害。Freshney(1994)Serum-freemedia.于CultureofAnimalCells,约翰威立公司(JohnWiley&Sons),纽约，91-99。因此，使用确定的无血清培养基对于用于治疗软骨缺陷的软骨细胞离体扩增特别有利。然而，这样确定的无血清培养基必须足以支持以低密度接种的成人关节软骨细胞的附着，支持增殖直到得到汇合培养物，并维持软骨细胞再表达关节软骨表型的能力。为研发生物化学上确定的培养基(DM)用于细胞培养已经付出了一些努力。DM通常包括营养素、生长因子、激素、附着因子和脂。对于设计为用于特定细胞类型的培养基，必须调整其精确组成。一些细胞类型包括成纤维细胞、角质细胞和上皮细胞在多种DM中实现了成功生长。Freshney,1994和ButlerM.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.68:283-91(2005)。8可以得到的用于自体软骨细胞移植的起始细胞材料的量通常是有限的。因此，期望以最小亚汇合密度接种关节软骨细胞。以亚汇合密度在DM中培养关节软骨细胞的尝试仅取得了部分成功。尽管已研发了能够支持以低密度接种的软骨细胞增殖能力的DM，但使用这些培养基时，接种之后细胞对组织培养瓶的初始附着仍需要血清。Adolphe等人，Exp.CellRes.155:527-536(1984)和美国专利号6,150,163。因此，为了用于医学用途，特别是用于人体，需要优化、标准化和控制能够再分化的软骨细胞附着、增殖和维持的条件。发明概述本发明提供化学上确定的培养基(DM)组合物，制备这样的培养基的方法，和使用这样的培养基例如培养细胞的方法，特别是培养用于修复软骨缺陷的人关节软骨细胞。本发明的DM的区别特征之一是具有一种或多种基本上纯的IL-6家族细胞因子，例如制瘤素M(OSM)、白介素-6(IL-6)和白血病抑制因子(LIF)。本发明的优点之一是可以在软骨细胞培养中避免使用血清，在无血清条件下增强细胞附着和增殖，和/或维持软骨细胞再表达软骨特异性表型的能力。一方面，本发明提供了足以支持细胞对培养基质的初始附着的DM,从而免除了细胞培养初期对于含血清培养基的需要。本发明另一方面提供了确定的无血清细胞培养基，其促进细胞如软骨细胞的增殖，在细胞培养的任何阶段都不需使用血清。本发明再一方面提供细胞培养基，可以用于在植入受试者之前准备软骨细胞，或纳入作为支持软骨细胞再分化的培养基，包埋在预期植入软骨缺陷的基质中。本发明另一方面提供培养软骨细胞直至其适合用于治疗患有软骨缺陷的患者的方法。本发明的其它优点一部分将在下文的说明书中阐明，一部分将通过说明书而显而易见，或可以通过本发明的实施而得到认识。本发明的DM包含补加了一种或多种补加物的基础培养基，补加物包括一种或多种IL-6家族的细胞因子，例如OSM、IL-6和LIF。9基础培养基可以是任何适合的培养基。在优选实施方案中，基础培养基为cDRF(表3)或cDRFm(表4)。cDRF和cDRFm是通过以1:1:1的比例混合DMEM、RPMI-1640和Ham'sF-12制备，或通过适当地组合预混合的培养基，并加入某些生长补加物以得到表3和4中分别定义的基础培养基。在其它优选实施方案中，基础培养基额外补加了血小板衍生生长因子(PDGF)和/或一种或多种脂。在一些实施方案中，脂为化学上确定的脂混合物(CDLM;表5)或一种或多种CDLM中的脂(例如硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、棕榈酸、棕榈油酸、花生四烯酸、亚麻酸、胆固醇和a-生育酚醋酸酯)。在一些实施方案中，本发明的DM可以包括基础培养基(例如cDRF或cDRFm)，所述^i^出培养基补加了(a)基本上纯的PDGF和CDLM其中之一或两者；和(b)基本上纯的OSM、基本上纯的IL-6和基本上纯的LIF中的一种或多种。例如，在优选实施方案中，本发明的DM可以包括(a)基础培养基；(b)0.1-100ng/mlPDGF;(c)0.05-5%CDLM;(d)0.01-10ng/mlOSM;和/或(e)0.01-10ng/mlIL-6。不是限制性所要求保护的发明。附图简述图1对比在(l)DMEM+10%FBS或(2)E93培养基(如表4中定义的cDRFm，补加了CDLM、PDGF、IL-6和OSM)中培养的原代人软骨细胞经三次传代的生长。图2对比在(l)DMEM+10%FBS或(2)E93培养基(如表4中定义的cDRFm,补加了CDLM、PDGF、IL-6和OSM)中培养的原代人软骨细胞经三次传代的细胞产率。图3在E93(泳道2、3、4)或DMEM+10。/。FBS(泳道5、6、7)中生10长的软骨细胞裂解物的RPA。在所有样品中均表达软骨标记物胶原2和聚集蛋白聚糖。发明详述本发明提供化学上确定的培养基(DM)组合物、制备这样的培养基的方法、和使用这样的培养基例如用于培养细胞的方法，如培养人关节软骨细胞用于修复软骨缺陷。本发明至少部分基于这样的发现称为cDRFm的基础培养基补加PDGF和CDLM及一种或多种IL-6家族的细胞因子后，足以支持能够再分化的软骨细胞培养中的附着、增殖和维持，并能够在细胞培养的所有阶段取代含血清培养基。IL-6家族的细胞因子包括例如OSM、IL國6和LIF。因此，一方面，本发明提供培养基，其包含补加了一种或多种补加物的基础培养基，补加物包括一种或多种IL-6家族的细胞因子，例如OSM、IL-6和LIF。术语"补加"表明在起始材料中加入了补加物以得到最终材料。除非特别说明，补加物不需要在特定时间或以特定顺序加入。术语"补加"不排除在任何时间点、在补加当前补加物之前或之后在起始材料中额外补加其它补加物。除非特别说明，补加物以"基本上纯的，，形式加入培养基中。术语"基本上纯的，，表明补加物基本上不含其在自然中天然共同存在的成分。例如，基本上纯的细胞因子可以是纯化的细胞因子或重组生产的细胞因子。i.制备^i^出培养基本发明的确定的、无血清培养基(DM)制备的第一步是得到基础培养基。基础培养基可以是任何适合的培养基。在举例说明性实施方案中，基础培养基为如表3中定义的cDRF。cDRF可以由下文所述的可商购的起始成分制备得到。cDRF是对DM的改良，由Adolphe等人(Exp.CellRes.155:527-536(1984))和McPherson等人(美国专利号6，150，163)研发。iicDRF的三种起始成分是DMEM、RPMI-1640和Ham，sF12(英骏公司(Invitrogen);卡尔斯巴德，加州)。起始成分以1:1:1的比例组合。全部三种培养基可以同时组合，或者任意两种培养基可以预混合，然后与适宜量的第三种培养基组合。起始成分的精确组成在表l中显示。得到的培养基(在表2中定义，称为DRF)而后补加ITS(10照/ml胰岛素、5.5照/ml转铁蛋白、7ng/ml硒和任选的2.0ng/ml乙醇胺；英-睃公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，力口州)、人纤连蛋白(碧迪公司(BDBiosciences);圣约瑟，加州)、人血清白蛋白(HSA)(格里福尔公司(Grifols);洛杉矶，加州；或百特公司(Baxter);西湖村市(WestlakeVillage),加州)、亚油酸(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich);圣路易斯，密苏里州)、人碱性胎儿生长因子(bFGF)(安迪生物科技有限公司(R&DSystems),明尼阿波利斯，明尼苏达州)、庆大霉素(英狻公司(Invitrogen);卡尔斯巴德，加州)和氢化可的松(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich);圣路易斯，密苏里州)以得到cDRF。所有材料经重构、稀释并依厂商建议储存。组合成分以得到最终培养基的精确顺序并不重要。可以用标准实验技术制备培养基，优选在2-8。C储存待用。在优选实施方案中，基础培养基基本上按上文制备，对人血清白蛋白、亚油酸和氢化可的松的量有所调整以得到如表4中定义的改良的cDRF(cDRFm)。在一些实施方案中，基础培养基是包含表3中列出的cDRF所有必需成分的培养基。对于表3中列出的成分或成分集合而言，如果当其浓度降低或消除该成分时，而培养基关于软骨细胞附着、增殖、和/或再分化的性质基本上保持相同，则该成分或成分集合是非必需的。对于特定的细胞培养条件，可以调整个别成分标明的浓度。本领域技术人员用常规技术能够容易地进行这样的调整。如果期望，并且对软骨细胞附着、增殖和再分化没有负面影响，可以在培养基添加额外成分。这样的成分包括但不限于生长因子、脂、血清蛋白质、维生素、矿物质和糖类。例如在培养基中补加促进软骨细胞再分化的生长因子或激素可能是有利的，如美国专利号6,150,163所述的TGF-j312(TGF-pi、-(32、-|33)、IGF和胰岛素。这样的生长因子和激素是可商购的。补加物的其它实例包括但不限于骨形态发生蛋白(BMP)，其至少有15种结构和功能相关的蛋白。BMP已显示参与多种细胞类型的生长、分化、趋化性和凋亡。例如重组BMP-4和BMP-6可以购自安迪生物科技有限公司(R&DSystems)(明尼阿波利斯，明尼苏达州)。可以用最少的实验确定本发明的DM中多种这样的补加物的浓度。例如，本发明的DM中BMP的浓度选自0.01-0.1ng/ml、0.1-1ng/ml、1-10ng/ml、100ng/ml、10-50ng/ml、50-100ng/ml和0.1-1照/ml。技术人员会认识到除了避免使用血清，本发明的DM还有其它的优点。而对于可以接受使用未确定成分的用途，也可能期望使用本发明的DM。因此，本发明的DM可以补加血清例如胎牛血清，或化学上未确定的成分例如动物或植物组织揭:取物。因此，在某些实施方案中，本发明的DM可以补加10%或更少、例如8%或更少、6%或更少、4%或更少、2%或更少、或1%或更少的血清。技术人员会认识到cDRF的等同物可以由多种已知培养基制备，例如伊格尔基础培养基(Eagle，Science,122:501(1955))、最低基础培养基(Dulbecco等人，Virology,8:396(1959))、Ham，s培养基(Ham，Exp.CellRes.29:515(1963))、L-15培养基(Leibvitz，Amer.J.Hyg.78:173(1963))、McCoy5A培养基(McCoy等人，Proc.Exp.Biol.Med.100:115(1959))、RPMI培养基(Moore等人，J.A.M.A.199:519(1967))，Williams培养基(Williams,Exp.CellRes.69:106-112(1971))，NCTC135培养基(Evans等人，Exp.CellRes.36:439(1968))，Waymouth培养基MB752/1(Waymouth,Nat.CancerInst.22:1003(1959))等。这些培养基可以单独使用，或作为混合物以适当比例制备成等同于cDRF的基础培养基。可选地，cDRF或其等同物可以用个别化学品、或用其它培养基和生长补加物制备。本发明不限于具有任何特定稠度(consistency)的培养基，包括使用从液体到半固体的培养基，并包括固化的培养基和适于重构的固体组合物。13表1.起始培养基的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>氨基酸L-丙氨酸4.45——L-精氨酸—200L-精氨酸盐酸盐147.5—L-天冬酰胺一水合物7.5—L-天冬酰胺(游离碱)—50L-天冬氨酸6.6520L-胱氨酸二盐酸盐31.2965L-半胱氨酸盐酸盐一水合物17.56—L-谷氨酸7.3520L-谷氨酰胺365300甘氨酸18.7510L-组氨酸盐酸盐一水合物31.48—L-组氨酸(游离碱)—L-羟脯氨酸—20L-异亮氨酸54.4750L-亮氨酸59.0550L-赖氨酸盐酸盐91.2540L-曱硫氨酸17.2415L-苯丙氨酸35.4815L-脯氨酸17.2520L-丝氨酸26.2530L-苏氨酸53.4520L-色氨酸9.02L-酪氨酸二钠盐一水合物55.7929L-缬氨酸52.8520维生素生物素0扁50.215D-泛酸4丐2.240.25氯化胆碱8.983叶酸2.651I-肌醇12.635烟酰胺2.021对氨基苯甲酸—1盐酸吡,醇2.0311盐酸吡喷醛——核黄素0.2190.2盐酸硫胺2.171维生素B120.680.005表2.DRF的组成1x液体，mg/L无机盐CaCl2(无水)77.7333Ca(N03)24H2033.3333CuS045H200.0009Fe(N03)29H200.0333FeS04.7H200.2780KCI341.2000MgS04(无水)48.8400MgCl2(无水)19.0933NaCl6663.6667NaHC031466.6667NaH2P04.H2041.6667Na2HP04(无水)314.013316ZnS04.7H200.2880其它成分D-葡萄糖2767.3333谷胱甘肽(还原型)0.3333次黄嘌呤钠盐1.5933亚油酸0.2800硫辛酸0扁0酚红7.0667腐胺盐酸盐1.7207丙酮酸钠36.6667胸苷0.2433HEPES1766.6667氨基酸L-丙氨酸2.9667L-精氨酸66.6667L-精氨酸盐酸盐98.3333L-天冬酰胺一水合物5.0000L-天冬酰胺(游离碱)16.6667L-天冬氨酸11.1000L-胱氨酸二盐酸盐42.5267L-半胱氨酸盐酸盐一水合物11.7067L-谷氨酸11.5667L-谷氨酰胺343.3333甘氨酸15.8333L-组氨酸盐酸盐一水合物20.9867L-组氨酸(游离碱)1.6667L-羟脯氨酸6.6667L-异亮氨酸52.980017L-亮氨酸56.0333L-赖氨酸盐酸盐74.1667L-甲硫氨酸16.4933L-苯丙氨酸28.6533L-脯氨酸18.1667L-丝氨酸27.5000L-苏氨酸42.3000L-色氨酸7.6800L-酪氨酸二钠盐一水合物46.8600L-缬氨酸41細0维生素生物素0細0D-泛酸钓1.5767氯化胆碱6.9867叶酸2.1000I-肌醇20馬7烟酰胺1.6800对氨基苯甲酸0.3333盐酸吡,醇1.6873盐酸吡喷醛—核黄素0.2127盐酸硫胺1.7800维生素B120.455018表3.cDRF的组成_lx液体DRF沐2)99%ITS-X补加物(胰岛素、转铁蛋白、硒、乙醇胺)1%补力口物亚油酸5|ng/ml庆大霉素50pg/ml氢4t可的;^40ng/ml纤连蛋白1pg/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ng/ml人血清白蛋白1mg/ml表4.cDRFm的组成_lx液体DRF(表2)99%ITS-X补加物(胰岛素、转铁蛋白、硒、乙醇胺)1%补力口物庆大霉素50jtg/ml氢4匕可的+>160ng/ml纤连蛋白1pg/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)10ng/ml人血;青白蛋白0.5mg/mlII.基础培养基的补充19A.血小板衍生生长因子(PDGF)在一些实施方案中，基础培养基中补加了基本上纯的PDGF。PDGF是主要的促有丝分裂因子，存在于血清而不是血浆中。PDGF是二聚体分子，包含两条结构上相关的链，命名为A和B。二聚体同工型PDGF-AA、AB和BB在多种细胞类型中差异表达。一般而言，所有的PDGF同工型均为结締组织细胞的有效促分裂原，结締组织细胞包括表皮成纤维细胞、神经胶质细胞、动脉平滑肌细胞、及一些上皮和内皮细胞。重组生产的PDGF可以从多种来源商购。下文实施例中4吏用的人重组PDGF-BB(hrPDGF-BB)购自安迪生物科技有限公司(R&DSystems)(明尼阿波利斯，明尼苏达州；目录号220-BB)，根据厂商说明书进行重构和操作。Johnson等人(EMBOJ.3:921(1984))描述了hrPDGF-BB的大肠杆菌表达和编码109氨基酸残基的成熟人PDGF-B链蛋白(C端加工，以前体序列中的苏氨酸残基l卯结束)的DNA序列。以二硫键连接的同型二聚体rhPDGF-BB包含两条109氨基酸残基的B链，分子量约为25kDa。Raines等人(Meth.Enzymol.109:749-773(1985))描述了通过PDGF刺激311-胸苦掺入静止NR6R-3T3成纤维细胞的能力来测量PDGF的活性。此测定法中PDGF的EDso通常为1-3ng/ml。PDGF的浓度选自0.1-1ng/ml、1-5ng/ml、5-10ng/ml、10ng/ml、10-15ng/ml、15-50ng/ml和50-100ng/ml。在某些实施方案中，cDRF中补力u1-25ng/ml、更优选5-15ng/ml、最优选约10ng/mlPDGF。在特定实施方案中，PDGF为PDGF-BB。可选地，PDGF可以是另一种类型，例如PDGF-AB、PDGF-BB或任何PDGF类型的混合。在相关实施方案中，本发明的DM还包含或可选地包含下述额外的补加物。B.脂在一些实施方案中，基础培养基补加了CDLM(表5)，或可选地补加了一种或多种CDLM中的脂。20脂作为结构成分和潜在的能量来源在活细胞中十分重要。多数细胞能够由培养基中存在的葡萄糖和氨基酸在体外合成脂。然而，如果可利用细胞外的脂，则脂的生物合成被抑制，细胞利用培养基中的游离脂肪酸，脂族酯和胆固醇。血清富含脂，是培养细胞的细胞外脂的主要来源。已发现基于海洋石油的化学上未确定的脂制品在若干系统中有效促进无血清培养基中的细胞生长。见例如Weiss等人，InVitro26:30A(1990);Gorfien等人，InVitro26:37A(19卯)；Fike等人，InVitro26:54A(1990)。因此，为无血清培养基补充多种脂来替换通常由血清提供的脂可能是期望的。适合在本发明的DM中使用的脂包括硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、棕榈酸、棕榈油酸、花生四烯酸、亚麻酸、胆固醇和a-生育酚醋酸酯。在一个实施方案中，基础培养基补加了表5所示的化学上确定的脂混合物(CDLM)。CDLM可从英骏公司(Invitrogen)购得。除了脂成分以外，英骏公司(Invitrogen)所提供的CDLM还包含乙醇(100g/L)及乳化剂PluronicF68(100g/L)和Tween80(2.2g/L)。实施本发明的方法时，表5中所示的CDLM中个别脂成分的浓度可以依特定的细胞培养条件有所调整。本领域技术人员用常规技术能够容易地进行这样的调整。此外，可能不是CDLM的所有成分均为必需的。对于某成分或成分集合而言，如果当其浓度降低或消除该成分时，而培养基关于软骨细胞附着、增殖、和/或再分化的性质基本上保持相同，则该成分或成分集合是非必需的。在某些实施方案中，本发明的DM包含CDLM的至少一种、两种、四种、六种、八种或全部脂成分。在一个实施方案中，DM包含PDGF和表5中定义的CDLM。在其它非限制性实施方案中，DM包含PDGF和表6中显示的脂组合。表5.化学上确定的脂混合物(CDLM)的组成脂成分mg/LDL-a-生育酚醋酸酯70硬脂酸10肉豆蔻酸10油酸10亚油酸10棕榈酸10棕榈油酸10花生四烯酸2亚麻酸10胆固醇220表6.举例说明性脂组合编号脂1胆固醇2胆固醇、花生四烯酸3胆固醇、花生四烯酸、亚油酸4胆固醇、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸5胆固醇、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、a-生育酚醋酸酯6胆固醇、花生四埽酸、亚油酸、亚麻酸、a-生育酚醋酸酯、硬脂酸7胆固醇、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、a-生育酚醋酸酯、硬脂酸8胆固醇、花生四烯酸、肉豆蔻酸亚油酸、亚麻酸、a-生育酚醋酸酯、硬脂酸、9胆固醇、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸亚油酸、亚麻酸、a-生育酚醋酸酯、硬脂酸、2210胆固醇、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、a-生育酚醋酸酯、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸11胆固醇、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、a-生育酚醋酸酯、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸12花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、a-生育酚醋酸酯、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸13花生四諦酸棕榈油酸14花生四烯酸15花生四烯酸16花生四烯酸17花生四烯酸18花生四烯酸19花生四烯酸20花生四烯酸21花生四烯酸22胆固醇23胆固醇24胆固醇25胆固醇26胆固醇27胆固醇28胆固醇榈油酸29胆固醇油酸、棕榈酸、棕榈油酸30亚油酸31胆固醇、亚油酸亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸亚油酸、亚麻酸、乙酸盐、硬脂酸亚油酸、亚麻酸、硬脂酸亚油酸、亚麻酸亚油酸亚油酸亚油酸、亚麻酸亚油酸、亚麻酸、硬脂酸亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕亚油酸、亚麻酸、a-生育酚醋酸酯、硬脂酸、肉豆蔻酸、2332胆固醇、花生四烯酸、亚油酸33胆固醇、花生四烯酸、亚油酸34胆固醇、花生四烯酸、亚油酸35胆固醇、花生四烯酸、亚油酸36胆固醇、花生四烯酸、亚油酸肉豆蔻酸37胆固醇、花生四烯酸、亚油酸肉豆蔻酸、油酸38胆固醇、花生四埽酸、亚油酸肉豆蔻酸、油酸39胆固醇、花生四烯酸、亚油酸亚麻酸亚麻酸、亚麻酸、亚麻酸、a-生育酚醋酸酯a-生育酚醋酸酯a-生育酚醋酸酯硬脂酸硬脂酸、亚麻酸、a-生育酚醋酸酯、硬脂酸、亚麻酸、a-生育酚醋酸酯、硬脂酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸a-生育酚醋酸酯、硬脂酸、40亚麻酸41胆固醇、亚麻酸42胆固醇、a-生育酚醋酸酯、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸榈油酸43胆固醇、a-生育酚醋酸酯44胆固醇、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸45硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸46胆固醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸47胆固醇、油酸、棕榈酸、棕榈油酸48胆固醇、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸49胆固醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸50胆固醇、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸、棕榈油酸在某些实施方案中，培养基中脂的浓度(v/v)选自0.05-0.1%、0.1-0.5%、0.5%、0.5-1%、1-2%、和2-5%。在某些其它实施方案中，DM额外补加了1到25ng/ml、更优选5到15ng/ml、最优选约10ng/mlPDGF。在特24定实施方案中，DM包含约0.5%(v/v)CDLM和10ng/mlPDGF。C.IL-6家族细胞因子IL-6家族的细胞因子的各成员可以利用共同的信号传导受体亚单位gpl30,其在许多细胞类型中均存在。见例如，Hirano等人(2001)IL-6LigandandReceptorFamily.于CytokineReference，学术出版社，圣地亚哥，523-535。IL-6家族细胞因子的实例包括但不限于制瘤素M(OSM)、白介素-6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、白介素-11(IL-ll)、心肌营养素1(CT-l)和神经营养素1/B细胞刺激因子3(NNT-l/BSF-3)。已发现IL-6家族的细胞因子在许多生物系统中调节细胞生长和分化，包括造血作用、神经发生和骨发生。Bruce等人，Prog.GrowthFactorRes.4:157-170(1992)。1.制瘤素M(OSM)人OSM是分泌的糖蛋白，最初翻译为252个氨基酸的多肽，N端具有25个残基的疏水信号序列，在分泌过程中被移除。额外的翻译后切割事件除去31个C端残基，留下192氨基酸的二硫键连接的成熟蛋白。Rose等人，Proe.Nat.Acad.Sci.USA88:8641-8645(1991);Robinson等人，Cell77:1101-1116(1994)。在人类中，OSM与两种不同的受体复合物结合并传导信号LIF受体(LIFR)/gp130异二聚体和OSM受体(OSMR)/gp130异二聚体。与任一受体复合物的结合导致janus激酶/信号转导和转录激活子(JAK/STAT)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导途径的活化。Heinrich等人，Biochem.J.374:1-20(2003)。已报道OSM抑制一些、但不是所有的人肿瘤细胞系的生长。相反，还报道OSM刺激一些正常成纤维细胞如人包皮成纤维细胞或WI-38细胞的生长。Zarling等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA83:9739-9743(1986)。因此，OSM可能对于刺激某些细胞的体外生长有用。对于OSM的更详细说明可以在美国专利号5,202,116和5,814,307中找到。25OSM可容易地从商业来源获得。在下文实施例中，在大肠杆菌中生产的196个氨基酸的重组OSM购自安迪生物科技有限公司(R&DSystems)(明尼阿波利斯，明尼苏达州)(目录号295-OM,也见Linsley等人，Mol.Cell.Biol.10:1882-18卯(19卯))。OSM的生物活性可以通过人红白血病细胞系增殖测定法测定，例如Kitamura等人，J.CellPhysiol.140:323-334(1989)对此有所描述。在优选实施方案中，人OSM用于生产本发明的培养基。然而，本领域技术人员会认识到其它物种的OSM、天然存在的突变体和工程化的突变体可以同样有效。2.白介素-6(IL-6)IL-6有很多互用名称，包括干扰素P2;B细胞分化因子；B细胞刺激因子2;肝细胞刺激因子；杂交瘤生长因子；和CTL分化因子。人IL-6为186个氨基酸的分泌糖蛋白，合成时是212个氨基酸的前体蛋白。Matsuda等人，(2001)IL-6。于CytokineReference,学术出版社，圣地亚哥，538-563。在人类中，IL-6与IL-6受体(IL-6R)和gpl30同型二聚体的复合物结合并传导信号。IL-6与IL-6R受体的结合导致Janus激酶/信号转导和转录激活子(JAK/STAT)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导途径的活化。Heinrich等人，Biochem.J.374:1-20(2003)。已报道IL-6诱导PC12神经元细胞的分化、诱导骨髓祖细胞的无性系成熟、及诱导T细胞的生长。相反，还显示IL-6抑制髓样白血病细胞和乳腺癌细胞的生长。因此，IL-6可能对于刺激某些细胞的体外生长有用。对于IL-6生物学更详细说明可以在美国专利号5，188，828中找到。1L-6可以从商业来源获得。在下文实施例中，在大肠杆菌中生产的184个氨基酸的重组IL-6购自安迪生物科技有限公司(R&DSystems)(明尼阿波利斯，明尼苏达州)(目录号206-IL，也见Hirano等人，Nature324:73-76(1986))。IL-6的生物活性通过浆细胞瘤增殖测定法测定，例如Nordan等人，J.Immunol.139:813(1987)对此有所描述。在优选实施方案中，人IL-6用于生产本发明的培养基。然而，本领域技术人员会认识到其它物种的IL-6、天然存在的突变体和工程化的突变体可以同样有效。3.白血病抑制因子(LIF)LIF有若干互用名称，包括胆碱能分化因子；DA细胞中的人白介素；分化刺激因子；MLPLI;和恩非勒明(Emfilermin)。人LIF是180个氛基酸的分泌糖蛋白。Kondera-Anasz等人，Am.J.Reprod.Immunol.52:97-105(2004)。在人类中，LIF与LIF受体(LIFR)/gp130异二聚体结合并传导信号。LIF与LIF受体的结合导致Janus激酶/信号转导和转录激活子(JAK/STAT)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导途径的活化。Heinrich等人，Biochem.J.374:1-20(2003)。已报道LIF抑制Ml髓样白血病细胞的增殖。见例如，美国专利号5,443,825。相反，还报道LIF刺激神经元的生长，以及促进神经元从肾上腺髓质表型向乙酰胆碱能表型的分化。见例如，美国专利号5,968,905。向已切断的神经加入LIF还能够增强神经再生。见例如美国专利号6,156,729。因此，LIF可能对于促进某些细胞的体外生长有用。LIF可以从商业来源获得。在下文实施例中，在大肠杆菌中生产的181个氨基酸的重组人LIF购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich);圣路易斯，密苏里州)(目录号L5283，也见Gearing等人，EMBOJ.6:3995(1987))。LIF的生物活性通过测试其刺激M1小鼠髓样白血病细胞分化的能力而测定，例如Gearing等人，EMBOJ.6:3995(1987)对此有所描述。在优选实施方案中，人LIF用于生产本发明的培养基。然而，本领域技术人员会认识到其它物种的L1F、天然存在的突变体和工程化的突变体可以同样有效。在某些实施方案中，本发明的DM为cDRF，补加了PDGF，一种或多种脂选自硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、棕榈酸、棕榈油酸、花生四烯酸、亚麻酸、胆固醇和a-生育酚醋酸酯，及一种或多种细胞因子。在特定实施方案中，本发明的DM为cDRF，补加了PDGF,—种或多种脂选自石更脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、棕榈酸、棕榈油酸、花生四27烯酸、亚麻酸、胆固醇和a-生育酚醋酸酯，及OSM、IL-6和LIF中的一种或多种。细胞因子的浓度选自0.01-0.1ng/ml、0.1-1ng/ml、1-5ng/ml、5-10ng/ml、10-15ng/ml、15-50ng/ml和50-100ng/ml。在某些实施方案中，cDRF补加了0.01-10ng/ml、更优选0.1-2ng/ml、最优选0.5-1ng/mlOSM、IL-6和/或LIF。在优选实施方案中，cDRF补加了约10ng/mlPDGF、0.5%CDLM、1ng/mlIL-6和0.5ng/mlOSM。在相关实施方案中，本发明的DM还包含下述额外补加物。在某些实施方案中，本发明的DM包含OSM、IL-6和LIF中的至少一种、两种或全部三种。在其它非限制性实施方案中，DM包含表7中列出的OSM、IL-6和LIF组合。在另外的非限制性实施方案中，DM包含表7中列出的OSM、IL-6和LIF的任意组合、PDGF和表5中定义的CDLM。在另外的非限制性实施方案中，DM包含表7中列出的OSM、IL-6、LIF、PDGF和脂的任意组合。在优选实施方案中，DM包含OSM、IL-6、PDGF和如表5中定义的CDLM。在另外的优选实施方案中，DM为如表4中定义的cDRFm。例如，培养基可包含cDRFm、OSM、IL-6、PDGF和CDLM。表7.OSM、IL-6和LIF的举例说明性组合补加IL-6-家族细胞因子补力口PDGF补加CDLM或表6的脂1OSM否否2OSM是否3OSM否是4OSM是是IL-6否否6IL-6是否7IL國6否是8IL-6是是9LIF否否2810LIF是否11LIF否是12LIF是是13OSM、IL-6否否14OSM、IL-6是否15OSM、IL-6否是16OSM、IL-6是是17OSM、LIF否否18OSM、LIF是否19OSM、LIF否是20OSM、LIF是是21IL画6、LIF否否22IL画6、LIF是否23IL-6、LIF否是24IL-6、LIF是是25OSM、IL-6、LIF否否26OSM、IL-6、LIF是否27OSM、IL-6、LIF否是28OSM、IL國6、LIF是是D.额外补力口物本发明的DM可以任选地补加促进培养细胞生长所需的任意数目的额外补加物。这样的补加物可以包括但不限于BMP家族成员、TGF-P家族成员、IGF和胰岛素。本发明的培养基可以用于能够再分化的软骨细胞在培养中的接种、生长和维持，而不使用血清。对于特定的细胞培养条件，可能需要调整PDGF、脂、OSM、IL-6和LIF所标明的浓度范围。本领域技术人员用常规技术29能够容易地进行这样的调整。在一些实施方案中，本发明的培养基不补加基本上纯的jagged1(JAGl)和/或基本上纯的白介素-13(IL-13)。在一些实施方案中，本发明的培养基不补加美国专利申请发明者B·西摩,S·迪盖申请人:建新公司