专利名称：：制备无谷蛋白烘焙产品的乳酸菌混合物的制作方法制备无谷蛋白烘焙产品的乳酸菌混合物本发明涉及一种制备无谷蛋白烘焙产品的乳酸菌混合物。具体地说，本发明涉及使用基于所选乳酸菌的"天然酵母"作为"发酵剂"，来制造供乳糜泻患者食用的无谷蛋白面包。与采用酿酒酵母或化学发酵获得的无谷蛋白产品相比，利用所选乳酸菌和提出的制造方法能改善产品的感官、营养和储藏性能。谷蛋白不耐性或乳糜泻流行病学在持续发展。对欧洲和美国人群进行的最新研究显示其发病率为1/100(Revers，2005.Epidemiologyofceliacdisease:whataretheprevalence,incidence,andprogressionofceliacdisease(乳糜泻流行病学乳麋泻的流行性、发病率和进展如何？)Gfl欲oe"^o/ogy.128:47-51)。根据目前的了解，抵御这种食物不耐性的唯一有效治疗方法是严格维持终身摄入完全缺乏谷蛋白(无谷蛋白)的饮食(Hamer，2005.Celiacdisease:Backgroundandbiochemicalaspects(乳麋泻的背景和生化基础).A/w"c23:401-408)。多数情况下，执行严格饮食方案(零耐受)乳糜泻患者能恢复正常肠隐窝形态(Hamer，2005.Celiacdisease:Backgroundandbiochemicalaspects(乳麋汚的背景和生化基础).5/o&c/mo"<iva"c23:401-408)。根据世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)采用的标准规则(StandardCodex)，无谷蛋白食品的定义如下(i)从原本就不含小麦成分(小麦(7Wfe謂)属的所有种类)、斯佩耳特小麦、凯麦特小麦(kamut)、黑麦、大麦、燕麦或它们的杂交品种的原料制备，且谷蛋白浓度低于20ppm;(ii)采用从小麦、斯佩耳特小麦、黑麦、大麦、燕麦或它们的杂交品种提取的成分制备且谷蛋白浓度不高于200卯m;和(iii)从(i)和(ii)的混合物制备且谷蛋白浓度不高于200ppm。可购得许多无谷蛋白产品面包、匹萨、饼干和意面(Gallagher等，2004.Recentadvancesintheformulationofgluten-freecereal-basedproducts(无谷蛋白的谷物基产品配方的新进展).7>ew<^FoodW/Tec/mo/15:143-152)。就口感和流变学特性而言，无谷蛋白面包的品质通常不如从面粉或黑麦制备的面包(Gallagher等，2004.Recentadvancesintheformulationofgluten-free4cereal-basedproducts(无谷蛋白的谷物基产品配方的新进展)7>e"&Foot/说/TecA"o/15:143-152)。产量较低的主要原因是缺少谷蛋白和由此造成的难以替代的结构特性，以及采用了适合非常规成分的制造方法(Gallagher等，2004.Recentadvancesintheformulationofgluten-freecereal-basedproducts(无谷蛋白的谷物基产品配方的新进展)rm^Food双/Tec/mo/15:143-152)。大多数最近的文献报道显示进行了各种研究以改进流变学和储存特性。具体地说，报道了采用不同来源的淀粉(Gallagher等，2002.Novelricesstarchesingluten-freebread(无谷蛋白面包中的新型大米淀粉)，7Vocee^"g5o//"fer"a"owa/Jxsociflf/owo/Ce,ea/C7zewisfeCo"/ew"ce卩谷欽众^^/^y^薪合会会议记^^).24-26;Demiate等，2000.RelationshipbetweenbakingbehaviourofmodifiedcassavastarchesandstarchchemicalstructurebyFTIRspectroscopy(改性木薯淀粉烘焙行为和FTIR光谱测得的淀粉化学结构之间的关系).O^60/z>y/Po/;;m42:149-158)，橡胶和其他水胶体(例如羟丙基甲基纤维素、角叉菜胶、苍耳烷(xanthane))(Kang等，1997.FooafSA;/Tec/zw/29:700-704;Schwarzlaff等，1996.Guarandlocustbeangumsaspartialreplacersofall-purposeflourinbread:anobjectiveandsensoryevaluation(用瓜耳胶和刺槐豆胶代替面包中的部分面粉目的和感官评价)./Food19:217-229)，大豆蛋白(Ranhorta等，1975.Preparationandfortificationofsoy-fortifiedgluten-freebread(大豆弓虽化无谷蛋白面包的制备和营养强化).JFoWSd40:62-64)以及奶粉及大米(Gallagher等，2003.Theeffectofdairyandpowderadditiononloafandcrumbcharacteristics,andonshelflife(intermediateandlong-term)ofgluten-freebreadsstoredinamodifiedatmosphere(加入牛奶和奶粉对于在改良环境下储存的无谷蛋白面包的质地和保存期(中期和长期)的影响).五wFooc/及mTec/mo/218:44-48)，其中的各种配方都能改进无谷蛋白产品的结构和保存期。由于已经证实，与摄入正常饮食的个体相比，乳糜泻患者对纤维、矿物质和其他营养素吸收较低(Grehn等，2001.DietaryhabitsofSwedishadultceliacdiseaseparitentstreatedbytogluten-freedietforlOyears(用无谷蛋白饮食治疗10年的瑞典成年乳麋泻患者的膳食习惯).Sc。"(iJM^45:178-182;Mariani等，1998.Thegluten-freediet:anutritionalriskfactorforadolescentswithceliacdisease(无谷蛋白膳食乳麋泻青少年的营养风险因素).J尸ecfcWGa败oe"&ro/27:519-523)，各种研究小组已经考虑过用各种来源的纤维(例如安茴酰牛扁碱)增加无谷蛋白产品的营养(Gibson禾口Roberfroid，1995.Dietarymodulationofthehumancolonicmicrobiota:introducingtheconceptofprebiotics(人结肠微生物群的膳食调节益生元概念的引入).J胸125:1401-1412;Taylor和Parker,2002.Quinoa(奎奴亚藜).尸sew(iocere^awe/fewcommowcereals,wAec^pro/eWesawe/^7&加'o"尸0加"<錄谷激浙梦少正常吝激，V、茇游特丝浙W带谱徵93-122;Tosi等，1996.Utilisationofwholeamaranthus(Jwora齒51crwe"to)flourinthemanufactureofbiscuitsforceliacs(将觅属植物全粉用于制造乳麋泻患者食用的饼干).j//meton'a34:49-51)。无谷蛋白产品的制造技术主要基于发酵化学或酿酒酵母(Sacc/zaromycescez-e由'ae)的应用(Gallagher等，2004.Recentadvancesintheformulationofgluten-freecereal-basedproducts(无谷蛋白的谷物基产品配方的新进展)7>eAFoodSyb'rec/mo/15:143-152)。根据目前的了解，已知专利申请WO02065842涉及一种用于制造面包和烘焙产品，尤其是无谷蛋白产品的发酵剂，其中所述发酵剂基于发酵乳杆菌。还了解一项研究(未公开，见Katina等，2005.Potentialofsourdoughforhealthiercerealproducts(通过发酵得到更加健康的谷物产品的潜能).rm^尸ooc/Sc/rec/mo/16:104-112)，其中描述了采用"天然酵母"作为基于大米、大豆、撒拉逊小麦和苍耳烷的无谷蛋白面包产品的生物和天然发酵剂，以提升味道和香味并延长保存期。所得结果证实，在无谷蛋白产品中采用"天然酵母"在技术上也是可行的，尤其，与采用酿酒酵母或化学发酵获得的相同产品相比，储存能力和味道得到了改善。"天然酵母"是一种源自于天然物质的乳酸菌和酵母的混合物，通常被用于发酵烘焙产品。过去十年已经进行了各种研究(Gobbetti等，2005.BacteriaBiochemistryandphysiologyofsourdoughlacticacidbacteria(乳酸菌的细菌生物化学和生理学).7>rwfeFoodTec/mo/16:57-69)证实，天然酵母中乳酸菌的酸化过程和肽酶活性适于改善烘焙发酵产品的味道、流变学、营养和储存特性。最近的研究(DiCagno等，2002.Proteolysisbysourdoughlacticacidbacteria:Effectsonwheatflourproteinfractionsandgliadinpeptidesinvolvedinhumancerealintolerance(孚L酸菌的蛋白水解作用对涉及人类谷物不耐性的小麦面粉蛋白质成分和麦醇溶蛋白肽的影响).^;p/五"wVow^WcroWo/68:623-633;DiCagno等，2004.Asourdoughbreadmadefromwheatandnon-toxicfloursandstartedwithselectedlactobacilliistoleratedinceliacsprue(脂肪便症患者能够耐受用小麦和无毒粉末并用经选择的乳酸菌发酵制得的发酵面包).^//￡"v!>owM/cra6/o/70:1088-1096;DeAngelis等，2005.VSL#3probioticpreparationhasthecapacitytohydrolysegliadinpolypeptidesresponsibleforceliacsprue(VSL#3益生元制品能够水解造成脂肪便症的麦醇溶蛋白多月太).5〖op/^sJcto-A/b/ecw/are5os/>yo/￡fee<xse1762:80-93)证实，当对"天然酵母"中乳酸菌的蛋白水解活性进行选择时，它们能够显著降解造成乳麋泻的谷蛋白成分。本文中，对北欧市售产品进行的一些石if究(St0rsrud等，2003.Glutencontaminationinoatproductsandproductsnaturallyfreefromgluten(燕麦产品和天然即不含谷蛋白产品的谷蛋白污染).￡wFoodAmTec/mo/217:281-485)证实，大量(约30%)无谷蛋白产品含有痕量(100-300ppm)谷蛋白，这能够构成个体不耐性的风险因素。基于披露的文献和上述数据，就无谷蛋白产品的质量而言，下述问题比较突出(i)因为与常规产品有太多不同，因此需要改善感官质量；(ii)提高营养价值以减少乳麋泻患者的吸收缺陷；(iii)降低制造地点或转移过程中可能发生的谷蛋白污染风险；和(iv)延长储存期。鉴于上述原因，显然需要提供用于制备没有已知缺陷的烘焙产品的材料和方法。本发明的作者现在发现了一种由所选乳酸菌的混合物构成的"天然酵母"，并提供了一种适合提升口感和营养特性的制造方法，其可被视为适合解决有关无谷蛋白面包质量的现有问题的技术手段。本发明所述乳酸菌属于乳酸杆菌(丄"加^"7/^)属，且之前已从"天然酵母"中分离，用于制造意大利中部和南部的典型面包。已在55种被隔离的面包中进行选择，隔分离过程基于蛋白水解、酸化、植酸酶活性，更通常是基于最佳感官特性的评定。本发明的乳酸菌已于2006年7月11日保藏于DSMZ认可的保藏中心，该保藏中心为每种细菌指定了以下对应的保藏编号.-旧金山乳杆菌(丄a"o6"c/〃wsra"/ra"c^ce"57'力LS40=DSM184267旧金山乳杆菌LS41=DSM18427Zacto6ac〃/wsmw/aeLR15=DSM18428丄acto6ac/〃M51mw/"eCi35=DSM18429植物乳杆菌(Zfl"oZ)ac/〃^;/a"torMm」CF1=DSM18430弯曲乳杆菌(Za"o6ac/〃^c"n^M力1Hd=DSM18431香肠乳杆菌0^"o6ac"/Ms/an:!Vm'm;s)2XA3-DSM18432然而，运送到DSMZ之后，它曾与代理机构联系，指出弯曲乳杆菌lHd和香肠乳杆菌2XA3的正确命名应为短乳杆菌(Zflcto6a"7/^^ev的1Hd和戊糖片球菌(尸Wococc"51/ew加acew51)2XA3。因此，在后续的讨论中，本发明的细菌旧金山乳杆菌LS40、旧金山乳杆菌LS41、丄flc,o6ac〃/w^rays/aeLR15、ZocZoZwfc/〃"jrow/oeCi35、植物乳杆菌CF1、短乳杆菌1Hd、戊糖片球菌2XA3，从现在开始将分别叫做旧金山乳杆菌(DSM18426)、旧金山乳杆菌(DSM18427)、丄octo6ac///^row^e(DSM18428)、Zfl"o&c/〃wjmM&e(DSM18429)、植物乳杆菌(DSM18430)、短乳杆菌(DSM18431)、戊糖片球菌(DSM18432)。尤其，选择以下混合物，以"天然酵母"的形式使用旧金山乳杆菌(DSM18426)、旧金山乳杆菌(DSM18427)和植物乳杆菌(DSM18430)。图1显示了采用LpigF/LiPR引物、通过PCR扩增获得的旧金山乳杆菌(DSM18426)，旧金山乳杆菌(DSM18427)和植物乳杆菌(DSM18430)的16SrRNA基因的部分序列。(TACGGGAGGCAGCAGTAG/CATGGTGTGACGGGCGGT，分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)。"天然酵母"的繁殖方法包括使其在由无谷蛋白成分构成的面团中繁殖8-24小时，其连续使用已经标准化和最佳化，并根据所需特性采取不同比例，如同短期发酵(约l-3小时)时采用的天然发酵剂或成分一样，然后烘焙面包。采用本发明所述"天然酵母"的发酵过程能实现(i)有可能将作为无谷蛋白成分中的污染物质的谷蛋白解毒(约300ppm);(ii)与使用酿酒酵母作为发酵剂相比，使游离氨基酸浓度提高3-10倍，提高倍数取决于用量和使用类型，从而提高面包的营养价值；(iii)植酸酶活性比采用酿酒酵母作为发酵剂时高约10倍，从而提高面包矿物盐的生物利用度，采用原子吸收分光光度法参考8Ca"和Zn"可加以证实；(iv)与使用酿酒酵母作为发酵剂相比能够改善感官特性，赋予传统面包特有的味道和香气；和(v)无需使用化学保存剂便可使面包有较好的保存期。此外，本发明的菌株混合物显示出比现有技术中采用的发酵乳杆菌高得多的肽酶类型活性和酸化能力。本发明混合物的酶活性的营养优势在于有助于释放较多的氨基酸，因此能提高其营养价值；能除去大量烘焙过程中产生的挥发性化合物的前体，并能产生典型的面包香气；并能使可能存在的作为无谷蛋白产品污染物的痕量谷蛋白解毒。乳酸菌丄"cto^c/〃wrow/ae(DSM18429)和(DSM18428)，短乳杆菌(DSM18431)和戊糖片球菌(DSM18432)可用于各种的与上述混合物相比不同主要在于观感的配方中。因此，本发明的一个具体目的是用来发酵无谷蛋白粉末的乳酸菌菌株混合物，其包含下述物质或由下述物质构成至少2种，优选至少3种，选自旧金山乳杆菌(DSM18426)、Za"o6ad〃ws(DSM18429)、植物乳杆菌(DSM18430)、旧金山乳杆菌(DSM18427)、戊糖片球菌(DSM18432)、丄.ra训'ae(DSM18428)或短乳杆菌(DSM18431)的乳酸菌。根据优选实施方式，各品种或菌株等比例混合得到的以下混合物包含下述物质或由下述物质构成旧金山乳杆菌(DSM18426)，丄"cto6fld〃wsrow/ae(DSM18429)和植物乳杆菌(DSM18430);旧金山乳杆菌(DSM18426)，旧金山乳杆菌(DSM18427)和植物乳杆菌(DSM18430);戊糖片球菌(DSM18432)，I.raw/ae(DSM18428)和植物乳杆菌(DSAf7S"0"短乳杆菌(DSM18431)，丄.mw/"e(DSM18429)和植物乳杆菌(DSM18430);或者可采用旧金山乳杆菌(DSM18426)，旧金山乳杆菌(DSM18427)和丄.mw/ae(DSM18429)。本发明的微生物混合物可用于发酵无谷蛋白粉末，所述粉末例如玉米粉，大米粉，撒拉逊小麦粉，木薯淀粉粉，向日葵粉，亚麻粉，埃塞俄比亚画眉草粉，甜高梁粉，奎奴亚藜粉，马铃薯粉，麻风树粉，苋粉和黍粉。采用上文定义的菌株混合物、用于两种发酵过程以制备无谷蛋白烘焙产品的发酵剂或所述无谷蛋白烘焙产品的无谷蛋白粉末混合物，构成了本发明的另一个目的，所述粉末组合物包含下述物质或由下述物质构成玉米淀粉10-30%，优选12%,木薯淀粉2-10%，优选4%，米粉20-60%，优选32%，撒拉逊小麦粉1-10%，优选6%，其中所述百分比是占粉末组合物总重的重量百分比。在用来制备无谷蛋白烘焙产品的混合物中可加入其他成分，如瓜耳胶、苍耳垸(xanthane)、甘油、安茴酰牛扁碱、山梨醇、大豆蛋白水解产物、大豆卵磷脂、橄榄油、向日葵油、糖、盐、乳清和脱脂奶粉，根据产品类型，它们可以各种比例(0.5-3.0%)使用。本发明的再一个目的涉及无谷蛋白烘焙产品使用的酵母发酵剂(在实验章节中，也称为本发明的"天然酵母")的制备方法，该方法包括以下步骤a)培养繁殖如上文所定义的乳酸菌菌株混合物；b)将50-65%浓度的如上文所定义的粉末组合物与35-50%的水混合，含有如步骤a)所定义的细菌菌株混合物，该混合物的细胞密度约108ufc/g;c)在20-30T:发酵8-24小时。此外，该方法可包括d)干燥或冷冻步骤c)中获得的发酵剂。此外，本发明涉及制备无谷蛋白烘焙产品的方法，该方法包括以下步骤a)将如上文所定义的粉末组合物、水以及可通过上述方法获得的新鲜发酵剂接种物揉成面团，所述粉末组合物的含量为40-60%、优选44%，水的含量为10-30%、优选26%,其中含有1-3%的酿酒酵母和0.1-1.2%的盐，接种物的含量为5-30%、优选30%(当比例低于30%时，面粉和水的量可按比例增加)，或者接种物可以是没有发酵活性的干燥产品、或有发酵活性的冷冻产品，所述百分比是占面团总重的重量百分比；b)在30'C发酵约1-3小时；c)在22(TC烹饪50分钟。本发明的再一个目的是可采用上述方法获得的发酵剂混合物。此外，本发明涉及可采用上述方法获得的烘焙产品，如面包。现在将参照优选实施方式，尤其是参照附图通过举例而非限制的方式描述本发明，图中图1显示了旧金山乳杆菌(DSM18426)，旧金山乳杆菌(DSM18427)和植物乳杆菌(DSM18430)的16SrRNA基因的部分序列(分别为SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5);10图2显示了旧金山乳杆菌(DSM18426)、短乳杆菌(DSM18431)和丄acto6flc/〃Mmw/ae(DSM18428)和(DSM18429)种类的菌株释放的白蛋白和球蛋白多肽的SDS-PAGE分析。各菌株都有典型的水解曲线。St，标准；A/G，无水解的蛋白质。图3显示了旧金山乳杆菌种类菌株分别对Leu-p-NA、For-p-NA、Leu-Leu、Leu-Leu-Leu、Val-Pro和For-Gly合成底物的N型氨基肽酶活性(a)、脯氨酸亚氨酸肽酶(b)、二肽酶(c)、三肽酶(d)、脯肽酶(e)和脯氨酰肽酶(f)的活性。酶活性用活性单位(u)表示，即释放lnmol/minp-硝基酰替苯胺或1pmol/min氨基酸(就二肽酶和三肽酶活性而言)所必需的酶的量。图4显示了用旧金山乳杆菌种类菌株在3CTC发酵7小时的面团的ApH(最初和最终pH值的差异)(a)和(最高酸化速度)(b)。图5显示了用所选乳酸菌在3(TC发酵12小时的面团的ApH(最初和最终pH值的差异)(a)和^ax(最高酸化速度)(b)。图6显示了用所选乳酸菌在3(TC发酵12小时面团的总游离氨基酸浓度。图7显示了通过氨基酸分析仪(AminoAcidAnalyserBiochrom30)测得的用所选乳酸菌的2号配方在30'C发酵12小时的面团的游离氨基酸概况。图8显示了通过采用基于所选乳酸菌的"天然酵母"制造无谷蛋白面包的方法。图中，有关面粉混合物的数量和性质的术语只是指示性的，如前所述，在二次发酵时可考虑加入其他成分。图9显示了与酿酒酵母发酵的对照(C)相比，采用新鲜"天然酵母"(n.1、2、4和5号配方)获得的无谷蛋白面包感官分析数据的主要组分(PCA)分析。实施例1:本发礙微樣游选斜〃藩之前从"天然酵母"中分离的55种乳酸菌菌株属于CollezionediColturedelDipartimentodiProtezionedellePianteeMicrobiologiaApplicatadell，Universi枝degliStudidiBari，已在改进的MRS(mMRS)中30'C繁殖24小时，除正常成分，该培养基还含有5%麦芽糖和10%酵母水，最终pH为5.6。在表l中，列出的乳酸菌种类分离自"天然酵母"并被用于本发明。表1_￥111ii(DSM18426)，LS13,LS44，LS35，旧金山乳杆菌LS14，LSll，LS18，LS4，LS15,(DSM18427)(DSM18429)，(DSM18428)，LR19，LactobacillusrossiaeLR13，LR22，LR24，LR25，LR8，LR18,LR20植物乳杆菌DC400，(DSM18430)，DB200，20196，2MF8，3DM，G10C3短乳杆菌(DSM18431)，5Z，CR13,AM7，1D，2HbLactobacilluspentosus8CF，12H5,12H6，14H9消化乳杆菌(丄a加&flc/〃wj2B发酵乳杆菌(Za"o6oc/〃wsy^nne"加附)2S1，D13干酪乳杆菌干酪亚种2752，2756，2766fZa加Zw"7/wjcase/subsp.CVwe^)类干酪乳杆菌(Zfl加ftfl"'肠/"ra薦"')12H8'12Hl，1Hb，4H3弯曲乳杆菌14謂，13H5戊糖片球菌(DSM18432)瑞士乳杆菌Ct""o6fl"'〃w51/e/ve"cm)B26W德氏乳杆菌(丄a"o6tfc/〃1^cfe/6rwecto〕B15Z力口氏乳杆菌(丄acto6tfd〃wsB24W，B30W食淀粉乳杆菌(丄fl加6"c飾s"附卢wrw力食淀粉乳杆菌通过测序确定本发明优选乳酸菌旧金山乳杆菌(DSM18426)，旧金山乳杆菌(DSM18427)和植物乳杆菌(DSM18430)的性质，结果示于图1。(1)蛋白水解活性基于蛋白水解活性进行选择，采用的细胞经24小时培养，离心收集(10,000gxl0min，4°C)，用50mM、pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤两次，并以2.5的光密度(A620nnO再悬浮于相同缓冲液，该光密度对应的细胞密度为108ufc/ml。利用从小麦粉提取的白蛋白和球蛋白检测蛋白酶活性(Wdss等，1993，Electrophoreticcharacterisationofwheatgrainallergensfromdifferentcultivarsinvolvedinbaker'sasthma(与烤箱哮喘有关的不同栽培品种麦粒变应原的电泳表征)，Efe"ra;^we^14:805-816)。将含有0.9ml白蛋白-球蛋白片段(约4mg/ml蛋白质)和0.1ml细胞悬浮液的反应混合物在30'C搅拌(150rpm)培育48小日寸。按照Laemmli系统(Laemmli，1970.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4(T4噬菌体头部装配期间切除结构蛋白)，Atowre227:680-685)进行SDS-PAGE—维电泳。分别采用合成底物丄ew-p-A^和For-p-7VJ检测N型氨基肽酶(P印N)和脯氨酸亚氨酸肽酶(PepI)的活性。反应混合物包含0.9ml磷酸钾缓冲液50mM，pH7.0，其中溶解有合成底物(终浓度为2mM)和100^细胞悬浮液。酶活性用活性单位(U)表示，对应于释放1|Limol/minp-硝基酰替苯胺所必需的酶的量(Gobbetti等，1996.TheproteolyticsystemofLactobacillussanfranciscensisCB1:purificationandcharacterisationofaproteinase,dipeptidase，andaminopeptidase(旧金山学L杆菌CB1的蛋白水解系统纯化以及蛋白酶、二肽酶和氨基肽酶的表征).五"v/w".M/cro6/o/.62:3220-3226)。按照DiCagno及其同事的描述(DiCagno等,2004.Sourdoughbreadmadefromwheatandnontoxicfloursandstarterwithselectedlactobacilliistoleratedinceliacspruepatients(用小麦粉禾卩无毒粉末并用所选乳酸菌发酵的发酵面包能被乳麋泻患者耐受)，J;^/.M'craWo/.70:1088-1096)分别测定脯肽酶(PepQ)和脯氨酰肽酶(PepR)对Val-Pro和For-Gly的活性。按照Cd-水合茚三酮法(Gobbetti等，1999.Studyoftheeffectsoftemperature,pH，NaCl，andawontheproteolyticandlipolyticactivitiesofcheese-relatedlacticacidbacteriabyquadraticresponsesurfacemethodology(通过二次反应表面法研究温度、pH、NaCl和aw对奶酪相关乳酸菌蛋白水解活性和脂解活性的影响)，五"^meAf/croWa/rec/wo/25:795-809)分别采用Leu-Leu和Leu-Leu-Leu来检测二肽酶(PepV)和三肽酶(PepT)。活性单位(U)定义为每分钟释放1pmol氨基酸所必需的酶的量。(2)酸化能力基于酸化能力选择100g揉制(面团产率160)，采用62.51g混合粉和37.5ml水制成，混合粉中含有天然玉米、白玉米、米粉和撒拉逊小麦粉，其重量百分比分别为15、15、65和5%，所述水中含有单一乳酸菌的细胞悬浮液，其最终的细胞密度为108ufc/g面团。通过在线pH检测(pH计507，克里松(Crison)，意大利)来测定面团的酸化动力学。数据采用已由Zwietering及其同事修正的Gompertz方程建立模型(Zwietering等，1990.Modellingofbacterialgrowthcurve(细菌生长曲线的建模).J/p/五"Wra"56:1875-1881)。(3)谷蛋白解毒对100g揉制(面团产率160)进行谷蛋白解毒试验，采用62.51g混合粉和37.5ml水制成，混合粉中含有天然玉米、白玉米、米粉和撒拉逊小麦粉，其重量百分比分别为15、15、65和5%，所述水中含有选出的具有较高蛋白水解活性的乳酸菌(旧金山乳杆菌(DSM18426)，(DSM18427)，丄a加6a函sra^/ae(DSM18429),(DSM18428)，戊糖片球菌(DSM18432)和短乳杆菌(DSM18431))的细胞悬浮液，其最终的细胞密度为1()Sufc/g面团。在面团中加入500或1000ppm谷蛋白。制备两种对照面团，分别含有500和1000ppm谷蛋白以及0.15gNaN3(p/p)，制造时不使用细菌接种物并在pH3.6下化学酸化。面团在30。C温育5、24和48小时。发酵结束时采用ELISA试验检测谷蛋白的量(TransiaPlate,Diffchamb)。(4)发酵面团的表征所选乳酸菌已被用于5种不同的配方，以制造基于由天然玉米、白玉米、米粉和撒拉逊小麦粉构成的面粉混合物的面团(表2)。表2_<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>按上述制好的面团先在3(TC孵育24小时。不含细菌接种物而是用酿酒酵母(1.5。/cO发酵并在30。C孵育2小时的面团用作对照。用不同配方发酵的面团以及相应对照物的特征包括(i)酸化动力学(Zwietering等，1990.Modellingofbacterialgrowthcurves(细菌生长曲线的建模).J;//A/z'cro6/o/56:1875-1881);(ii)通过酶试剂盒(意大利DC公司(DHFFCHAMBItalySri)，意大利))测定发酵过程中产生的有机酸(D-和L-乳酸以及乙酸；(iii)通过平板计数在mMRS琼脂上测定细胞密度(Oxoid，Basingstoke,汉普郡，英格兰)，(iv)采用Fiske禾口Subbarow(Fiske禾卩Subbarow，1925.Thecolorimetricdeterminationofphosphorus(磷的比色测定).5/o/.Oem.66:375)以及Shimizu(Shimizu，1992.Purificationandcharacterisationofphytasefrom5fl"'〃ws犯6"fo(Natto)n-77(禾古草芽孢杆菌植酸酶的纯化和表征).J5/o"/.5/ocAe肌56:1266-1269)描述的方法，通过检测释放的无机正磷酸来测定植酸酶活性；以及(v)采用阳离子交换柱(NaOxidisedFeedstuff,20cmx4.6mm)，通过"氨基酸分析仪生物色素30"(AminoAcidAnalyserBiochrom30)(生物色素有限公司，剑桥，英国)测定总氨基酸含量。(5)无谷蛋白面包的制造鉴于不同技术方案方法有所不同，使用所选"天然酵母"的不同配方制造无谷蛋白面包。发酵24小时后，将其用作(i)接种5-30%由上述成分等构成的基面团的新鲜天然发酵剂；(ii)提供预先干燥的成分(15%)。在面团中加入酿酒酵母(1%)和NaCl(0.3%)并3(TC孵育2小时，然后在实验室烘箱中烘焙(220'C50分钟)。制造对照面包的面团，采用由酿酒酵母(2%)在30°(:发酵2小时得到的面团。对制得的面包进行以下测定(i)通过水提取然后通过原子吸收分光光度法测定以分析生物可利用的矿物质的含量；(ii)由6名未经训练的试味者通过小组试验进行感官分析(Haglund等，1998.Sensoryevaluationofwholemealbreadfromecologicallyandconventionallygrownwheat(由有丰几小麦禾卩普通小麦制造的全麦面包的感官评价).JCwe"/5W.27:199-207)，每种属性用0-100范围内的递增等级评分；(iii)按照AACC10-10和AACC74-09官方方法(ApprovedAssociationCerealChemistry(谷物化学家协会)，第X版，AACC，圣保罗(St.Paul),明尼苏达州，美国)分析比容和硬度；和(iv)通过工业方式制备面包、在改良空气(40%&和60%C02)下包装并在没有化学防腐剂时连续保存6个月来检测保存期。结果(1)蛋白酶活性采用白蛋白和球蛋白作为底物测定蛋白酶活性，证实有不同的水解特征。在图2中，旧金山乳杆菌(DSM18426)、短乳杆菌(DSM18431)和丄.mw/ae(DSM18428)和(DSM18429)的水解特征显示有更加显著的蛋白酶活性。这种酶活性可补偿蛋白质降解处理的最初步骤中被用掉的一种用于制造无谷蛋白食品的内源面粉酶。肽酶活性采用相对特异的合成底物测定。图3的结果涉及旧金山乳杆菌种类的菌株。可以观察到除了三肽酶类型活性之外的所有考虑的酶活性，菌株(DSM18426)和(DSM18427)的活性明显高于其他菌株。根据同样的标准选择其他种类的菌株。通过收集培养物进行筛选，并大量检测酶活性，能够获得通常无法获得的特选菌株。旧金山乳杆菌(DSM18426)和(DSM18427)、Z.roM/ae(DSM18429)和(DSM18428)、短乳杆菌(DSM18431)和戊糖片球菌(DSM18432)是基于蛋白酶和肽酶活性选择的。具体地说，将所选种类和菌株的肽酶类型活性与筛选开始时使用的两种发酵乳杆菌菌株进行比较，通常能得到所有测试物质中较高的肽酶活性(高出平均值40-80%)。基于酶活性进行选择有多种价值(i)有助于释放更多的氨基酸从而提高营养价值；(ii)释放更多量的烘焙过程中产生的并负责产生典型面包香气的挥发性化合物前体；和(iii)使可能产生的作为无谷蛋白产品污染物的痕量谷蛋白解毒。(2)酸化能力在用单一微生物3(TC发酵7小时的酸面团上直接测定乳酸菌分离物的酸化能力。图4的结果涉及旧金山乳杆菌种类的菌株。可以观察到(DSM18426)菌株，且尤其是(DSM18427)，也有良好的酸化能力，以ApH和nmax的方式表示。也按照相同的标准选择其他种类的菌株。尤其，基于酸化能力选择了植物乳杆菌(DSM18430)，表现为ApH值高于2.3。所有选择的种类或菌株展示出的酸化能力和速度高于筛选中考虑的两种发酵乳杆菌菌株。(3)谷蛋白解毒最初基于蛋白水解活性选择的乳酸菌组合(旧金山乳杆菌(18426)和(DSM18427)，丄.(DSM18429)和(DSM18428)，短乳杆菌(DSM18431)和戊糖片球菌(DSM18432))被用于解毒小心加入无谷蛋白面团以模拟污染的500或161000ppm谷蛋白。面团孵育48小时后观察到两种谷蛋白浓度都减低了约40%。孵育较短时间(即24小时)显示类似的解毒比例，而孵育5小时无法大量降低谷蛋白浓度。旧金山乳杆菌(DSM18426)和(DSM18427)与植物乳杆菌(DSM18430)的组合，显示出与多种分离物构成的组合类似的水解谷蛋白的活性。同样的乳酸菌组合能将约300ppm的初始谷蛋白浓度降至20ppm的范围，该初始浓度是无谷蛋白原料的典型污染浓度。利用类似的抗谷蛋白活性能够在发酵期间更加安全地使用涉及谷蛋白生物净化的无谷蛋白成分。(4)发酵面团的表征表2中提供了基于所选乳酸菌的"天然酵母"配方。采用各个配方将面团在3(TC发酵12小时。仅用酿酒酵母在3(TC发酵2小时的面团被用作对照。所有制得的面团发酵12小时后的ApH总是高于2.4(面团的最终pH约3.4)(图4)，表明所有配方都能造成显著的酸化。尤其，用5号组合(旧金山乳杆菌(DSM18426)和(DSM18427)以及丄，(DSM18429))获得的面团具有约2.6的最高ApH，而3号组合(戊糖片球菌(DSM18432)，植物乳杆菌(DSM18430)和L.roM/oe(DSM18428))具有约2.45的最低ApH。就最大酸化速率(^J而言，用3、4(短乳杆菌(DSM18431)，植物乳杆菌(DSM18430)和丄.ro^/ae(DSM18429))和5号组合获得的面包显示出等于约1.3h"的最高ApH。酸化能力是改善发酵产品感官特征需要考虑的参数之一，即便酸化能力最高不一定总是有良好的面包结构和/或香气，尤其是当使用无谷蛋白粉末时。在除了对照面团的所有面团中，检测了存在的有机酸，尤其是其变化值，结果如下:L-乳酸从21到82mM，D-乳酸从51到75mM，乙酸从10到30mM(表3显示了用所选乳酸菌配方在30。C发酵12小时的面团中L-和D-乳酸、乙酸的浓度以及发酵系数)。表3面团L-乳酸D-乳酸乙酸发酵系数(mM)(mM)(mM)158.072.025.05.2282.075.030.05.2355.057.010.011.2427.051.020.03.9521.059.025.03.2对照tonndb2.000.1020用酿酒酵母30'C发酵2小时的面团17nd，未测定发酵系数，乳酸和乙酸的摩尔比。所测得的三种酸的浓度以及乳酸与乙酸之比反映了组合中存在的乳酸菌的代谢特征。有机酸比例对应于酸面团的正常值(等于4:1)，但用3号组合获得的面团除外。有机酸浓度能够为可从乳酸菌得到的最终产品的香气提供有价值的信息。一般，乳酸和乙酸的摩尔比值定义了发酵系数，该比值必需趋于非常低的值以提供较佳品质。除了3号组合，所有制得的面团显示出最佳发酵系数。发酵12小时后制得的面团的细胞密度为9.1-9.47Logu)iifc/g面团。从面包中矿物质生物利用度的营养角度而言，为评价使用天然酵母的价值，评价了用所述五种组合获得的面团的植酸酶活性。表4中列出了用所选酵母菌组合3(TC发酵12小时的面团的植酸酶活^<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>对照1:用1%酿酒酵母3(TC发酵2小时的不含细菌接种物的面团。对照2:用0.5%酿酒酵母3(TC发酵2小时的不含细菌接种物的面团。对照3:用0.25%酿酒酵母3(TC发酵2小时的不含细菌接种物的面团。除了1号组合，所有其他组合(尤其是2和4号组合)的植酸酶活性值比对照面团高出约30倍。图5显示了游离氨基酸的总浓度，5种"天然酵母"配方的值从726.54到2415.97mg/kg面团。用酿酒酵母发酵的对照面团的浓度为420.07(mg/kg)。用2号配方发酵较长时间(24小时)使得孵育12小时后获得的游离氨基酸浓度加倍，表明有可能提高"天然酵母"发酵面团的营养价值和消化率。用2号组合获得的面团的氨基酸特征中，显著形成氨基酸Arg(178.38mg/kg)、Leu(134.09mg/kg)、Glu(82.45mg/kg)和Pro(87.30mg/kg)(图6)。(5)制造无谷蛋白面包基于所选乳酸菌的各种"天然酵母"配方被用于按照图8所述的生物技术方法制造无谷蛋白面包。提出的两种备选方案对应于不同的技术方案。在进一步的发酵步骤(3(TC发酵2小时)中使用新鲜"天然酵母"作为发酵剂代表一种传统技术，费用低但需要每天更新"天然酵母"。"天然酵母"这种用法的一种变化形式可以是，将其冷冻以使其保存时间更长并可在复活后成功使用。将"天然酵母"干燥并将其直接用作容易保存的成分，尽管到发酵期(3(TC发酵2小时)终点仍未活化。当使用酿酒酵母作为发酵剂时，使用30%的新鲜"天然酵母"能使发酵过程中的植酸酶活性提高约10-30倍，分别导致生物可利用的C^+和Zn"含量提高约21%和48%，并使游离氨基酸含量提高约10倍。"天然酵母"的使用比例可根据所需特性进行改变，尤其，可超过上述值。同时也可使用冷冻的"天然酵母"，其在复活后显示出与新鲜酵母相同的性能。与仅用酿酒酵母制造的对照面包相比，用基于所选乳酸菌的不同"天然酵母"配方获得的所有面包具有类似的或者略好的比容值和硬度值。对制得的面包进行感官分析。评价的感官参数包括弹性、颜色、芳香酸、酸味、甜度、干度和香气。每种参数从0-100递增评分。为定性评价每种面包的感官特征，所得数据已通过主要组分(PCA)统计分析处理。两个主要组分记录于图9，占样品总方差的73。水平轴(因子l)代表面包种类分布，是整体感官评价的函数，纵轴(因子2)代表面包分布，是所考虑的各感官参数的函数。从两种主要组分区域平面上的面包分布显见(图9a)，用新鲜"天然酵母"制得的面包类型具有非常类似的感官结果。从图9b显见，感官上典型且有价值的香味、味道和颜色特征分布在存在用"天然酵母"制得的面包的区域，证实了"天然酵母"对于香气和味道的作用和贡献。最终，用2号配方制得的面包得以在工业规模制造、在改良空气(40y。N2和60%C02)中包装并保存6个月。在未加入防腐化合物(例如，丙酸钙)的情况下在整个保存期中未观察到微生物污染现象(面包发霉和"发粘")。权利要求1.用来发酵无谷蛋白粉末的乳酸菌菌株混合物，其包含下述物质或由下述物质构成至少2种，优选至少3种，选自旧金山乳杆菌(DSM18426)、Lactobacillusrossiae(DSM18429)、植物乳杆菌(DSM18430)、旧金山乳杆菌(DSM18427)、戊糖片球菌(DSM18432)、L.rossiae(DSM18428)或短乳杆菌(DSM18431)的乳酸菌。2.如权利要求1所述的混合物，其包含下述物质或由下述物质构成旧金山乳杆菌(DSM18426)，Z^cto^c/〃wraw/ae(DSM18429)和植物乳杆菌(DSM18430)。3.如权利要求1所述的混合物，其包含旧金山乳杆菌(DSM18426)、旧金山乳杆菌(DSM18427)和植物乳杆菌(DSM18430)。4.如权利要求l所述的混合物，其包含下述物质或由下述物质构成戊糖片球菌(DSM18432)、丄.mwz'ae(DSM18428)和丄^//a"tor"m(ZWM7S4M」。5.如权利要求l所述的混合物，其包含下述物质或由下述物质构成短乳杆菌(DSM18431)、丄.row/ae(DSM18429)和植物乳杆菌(DSM18430)。6.如权利要求l所述的混合物，其包含下述物质或由下述物质构成旧金山乳杆菌(DSM18426)，旧金山乳杆菌(DSM18427)和丄.row^e(DSM18429)7.如权利要求1-6中任一项所述的混合物，其特征在于，在发酵开始时所述菌株等比例存在，其细胞密度约10ScfU/g。8.如权利要求1-7中任一项所述的混合物，其特征在于，所述无谷蛋白粉末选自下组玉米，大米，撒拉逊小麦，木薯淀粉，向日葵，亚麻，埃塞俄比亚画眉草，甜高梁，奎奴亚藜，马铃薯，麻风树，苋，黍的粉。9.一种无谷蛋白粉末混合物，它使用权利要求1-8任一项中所定义的菌株混合物，用来制备无谷蛋白烘焙产品的发酵剂或所述无谷蛋白烘焙产品，所述粉末组合物包含下述物质或由下述物质构成玉米淀粉10-30%，优选12%，木薯淀粉2-10%，优选4%，米粉20-60%，优选32%，撒拉逊小麦粉1-10%，优选6%，其中所述百分比是占粉末组合物总重的重量百分比。10.制造无谷蛋白烘焙产品的发酵剂的方法，该方法包括以下步骤a)培养繁殖如权利要求1-8中每一项所定义的乳酸菌菌株混合物；b)将50-64%浓度的如权利要求9所定义的粉末组合物与35-50%的水混合，含有步骤a)的细菌菌株培养物，该培养物中的各种菌株等比例存在，且细胞密度约108ufc/g，其中所述百分比是占面团总重的重量百分比；c)在20-30'C发酵8-24小时。11.如权利要求10所述的方法，还包括d)干燥或冷冻步骤c)中获得的发酵剂。12.用于制备无谷蛋白烘焙产品的方法，该方法包括以下步骤a)将权利要求9所述的粉末组合物、水以及可通过权利要求10-11中每一项所定义方法获得的新鲜发酵剂接种物，揉成面团，所述粉末组合物的含量为40-60%、优选44%，水的含量为10-30%、优选26%，其中含有1-3%、优选2%的酿酒酵母和0.1-1.2%的盐，接种物的含量为5-30%、优选30%，或者接种物可以是没有发酵活性的干燥产品、或有发酵活性的冷冻产品，所述百分比是占面团总重的重量百分比；b)在3(TC发酵约1-3小时；c)在22(TC烹饪50分钟。13.可采用权利要求10或11所定义的方法获得的发酵剂组合物。14.可采用权利要求12所定义的方法获得的烘焙产品。全文摘要本发明涉及一种发酵无谷蛋白烘焙产品的乳酸菌混合物。具体地说，本发明涉及使用基于所选乳酸菌的“天然酵母”作为发酵剂来制造无谷蛋白面包，这种面包具有改善的感官和营养特性，设计供乳糜泻患者食用。文档编号C12N1/20GK101495617SQ200780027169公开日2009年7月29日申请日期2007年7月3日优先权日2006年7月17日发明者A·本纳杜斯,A·路伊斯,G·朱利亚尼,M·德安格利斯,M·戈贝蒂,R·迪家格诺申请人:吉利亚尼股份公司