半胱氨酸蛋白酶抑制剂s与癌胚抗原的联合应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了半胱氨酸蛋白酶抑制剂S（Cystatin?S）与癌胚抗原（CEA）的联合应用，具体为Cystatin?S与CEA在制备诊断和预示胃癌或胃肠间质瘤标志物中的应用；本发明还公开了胃癌或胃肠间质瘤标志物的捕获剂和含有该捕获剂的试剂盒，所得试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点，能够用于胃癌或胃肠间质瘤的早期诊断、治疗过程中的疗效监控以及治疗后转移复发监控，其诊断结果早于临床症状。
【专利说明】半胱氨酸蛋白酶抑制剂S与癌胚抗原的联合应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医学检测领域，涉及半胱氨酸蛋白酶抑制剂S与癌胚抗原的联合应用。
【背景技术】
[0002]胃癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，死亡率居各恶心肿瘤的第二位。目前全球每年新发胃癌九十三万四千例，其中有近四十万在中国，患病和死亡率均超过世界平均水平的两倍。随着胃镜及现代影像学技术的应用，早期胃癌的诊断率已提高到百分之十左右，早期治疗治愈率达到百分之九十五，但目前中国住院病例中超过九成是中晚期才就医，五年生存率不到五分之一。提高胃癌的总体疗效很大程度上取决于早发现、早诊断、早治疗及治疗后的复发检测，因此寻找高灵敏度和高特异性的肿瘤标志物对胃癌的早期诊断和复发监控有重大意义。
[0003]据文献报道胃肠间质瘤(GIST)发病率为(1-2)/10万，占胃肠道肿瘤的0.1%-0.3%。在美国每年新发病例为4000-6000例，年发病率约为(I 1-14.5)/100万。发病高峰位于50-70岁之间人群，40岁以下少见，青少年罕见。GIST大部分发生于胃(50?70%)和小肠(20?30%)，结直肠约占10?20%，食道占O?6%，肠系膜、网膜及腹腔后罕见。GIST病人20-30%是恶性的，第一次就诊时约有11?47%已有转移，转移主要在肝和腹腔。
[0004]胃肠道间质肿瘤中存在c-kit基因功能获得性突变及C-KIT蛋白产物⑶117的表达。研究发现GIST发生主要与c-kit基因突变导致酪氨酸激酶持续活化使突变细胞增殖失控有关。80-88%GIST的发生源于c-kit基因功能获得性突变，即⑶117。据2008年中国胃肠间质瘤诊断治疗共识意见，病理诊断流程对疑似GIST应做组织免疫组化检查，CD117阳性则可确诊，阴性再做c-kit突变检测，阳性为GIST，阴性再进行TOGFR基因检测，阳性可确诊，阴性可能为野生型GIST或其它肿瘤，如desmin检测为阳性则可能为平滑肌瘤；S_100为阳性则考虑神经鞘瘤，如二者阴性应进一步做DOGl免疫组化检测，阳性则可确诊GIST。因此，GIST病理确诊程序繁复，而且GIST转移复发率高，特别是沿活检路径，或手术时瘤体破溃等极易带来种植转移。因此，临床迫切需要高灵敏度的血清检测标志物来突破GIST诊治瓶颈。
[0005]近年来，随着对肿瘤发病机理研究的不断深入，发现Cystatin家族作为组织蛋白酶主要是半胱氨酸蛋白酶的内源性抑制剂，在肿瘤的发生、发展、浸润和转移过程中起着非常重要的作用。研究结果显示，Cystatin家族的几个成员在不同肿瘤中的表达水平有所上升，例如Cystatin C在卵巢癌和头颈部癌症中的表达有不同水平的上升,stef in A在非小细胞肺癌中的表达水平有所增加，Cystatin F在多种肿瘤中的表达水平都有显著增加，很可能是由于在肿瘤发生、发展过程中需要组织蛋白酶的参与，先诱导其表达量增加，再激活机体本身的应激机制，导致Cystatin的表达量上升以抑制过盛的组织蛋白酶活性。但Cystatin的表达量并不与肿瘤的发展成正相关关系,例如在胶质瘤中，Cystatin C的低表达意味着疾病的晚期，患者的生存期较短，且易于复发，这可能是到了肿瘤的后期阶段，又会有一些其他的机制对Cystatin的水平进行调控，以促进肿瘤的进一步恶化。半胱氨酸蛋白酶抑制剂S (Cystatin S)是人类Cystatin家族成员，由CST4基因编码，含141个氨基酸，分子中有两个二硫键，分子量为16.4Kda,为典型的分泌蛋白，分布于多种体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等。文献报道，CST4在胃癌组织中的表达量高于正常胃粘膜组织，在胃癌细胞系中的表达部位与胃癌组织较一致，且表达率随细胞系的分化程度降低而降低；临床资料分析表明，CST4的表达与浸润深度、远处转移以及TNM分期相关；生存分析表明，CST4表达阳性组的5年生存率显著高于无表达组；Cox回归分析表明，CST4是一个独立预后因子；从而提示CST4可能在胃癌的发生、发展过程中发挥类似肿瘤抑制因子的作用。
[0006]CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。CEA升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、小细胞肺癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性结肠炎等疾病，15%?53%的病人血清CEA也会升高，所以CEA不是恶性肿瘤的特异性标志，在诊断上只有辅助价值。CEA在胃癌患者血清中检测的临床意义是:(1)与进展期低分化腺癌相关-亦与肿瘤大小、浆膜面浸润和淋巴转移相关；(2)能介导肿瘤细胞与肝实质接触而提示肝转移；(3)可与其它指标联合应用，如与腹腔灌洗液中细胞学检查联合提示胃癌的腹膜复发、腹腔种植，但准确性较CA125差；(4)可与其它指标联合应用评价胃癌的化疗疗效，如CEA水平下降范围在50%以上或降至正常范围并持续4周以上可作为治疗有效指标；(5)其与预后的关系尚存在争议，但多数结果认为，如治疗后持续增高提示胃癌患者预后不良。但是，目前未见联合Cystatin S和CEA标志物检测胃癌和胃肠间质瘤的报道。
【发明内容】
[0007]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂S (Cystatin S)和癌胚抗原(CEA)在制备诊断和预示胃癌或胃肠间质瘤标志物中的应用；本发明的目的之二在于提供胃癌或胃肠间质瘤标志物的捕获剂；本发明的目的之三在于提供含有上述捕获剂的检测试剂盒；本发明的目的之四在于提供利用试剂盒建立计算诊断和预示胃癌或胃肠间质瘤阈值的方法。
[0008]为达到上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0009]1.半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和癌胚抗原在制备诊断和预示胃癌或胃肠间质瘤标志物中的应用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述癌胚抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
[0011]2.胃癌或胃肠间质瘤标志物的捕获剂，所述标志物为半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和癌胚抗原，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述癌胚抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]优选的，所述捕获剂为识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和癌胚抗原的特异性抗体。
[0013]3.含有所述捕获剂的试剂盒。
[0014]优选的，所述试剂盒为检测血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和癌胚抗原浓度的试剂盒。[0015]更优选的，所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。
[0016]优选的，所述试剂盒含有包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
[0017]最优选的，所述单克隆抗体为鼠抗人Cystatin S单克隆抗体，所述多克隆为兔抗人Cystatin S多克隆抗体，所述显色底物为四甲基联苯胺。
[0018]4.利用所述试剂盒建立计算诊断和预示胃癌或胃肠间质瘤阈值的方法，用所述试剂盒检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和癌胚抗原浓度，利用P=exp (-5.321-0.069*a+0.152*b) /[1+exp (-5.321-0.069*a+0.152*b)]计算胃癌阈值 P 或P=exp (-9.306-0.031*a+0.415*b) / [1+exp (-9.306-0.031*a+0.415*b)]计算胃肠间质瘤阈值P，当P大于或等于0.75时，为阳性；当卩小于0.75时，为阴性；
[0019]其中a代表半胱氨酸蛋白酶抑制剂S浓度,单位为pg/mL, b代表癌胚抗原浓度,单位为ng/mL。
[0020]本发明的有益效果:本发明公开了诊断和预示胃癌或胃肠间质瘤的新标志物，SP将Cystatin S和CEA联合用于诊断和预示胃癌或胃肠间质瘤,利用上述两个标志物共同检测胃癌或胃肠间质瘤的灵敏度高和特异性均高于检测单一标志物，其中检测胃癌的灵敏度为80.7%,检测胃肠间质瘤的灵敏度为74.8% ;检测胃癌的特异性为91.4%,检测胃肠间质瘤的灵敏度为81.9% ;本发明还公开了胃癌或胃肠间质瘤标志物的捕获剂和含有该捕获剂的试剂盒，制成试剂盒具有使用方便，重复性好，便于携带等优点，能够用于胃癌或胃肠间质瘤的早期诊断、疗效评估或移转复发监控等，并且检测结果早于临床症状，为医生提前治疗和干预提供指导。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明:
[0022]图1为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测Cystatin S蛋白的标准曲线。
[0023]图2为CEA酶联免疫检测试剂盒检测CEA蛋白的标准曲线。
[0024]图3为Cystatin S-CEA联合检测试剂盒检测胃癌ROC曲线。
[0025]图4为Cystatin S和CEA联合检测试剂盒检测胃肠间质瘤ROC曲线。
【具体实施方式】
[0026]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0027]本发明使用的试剂如下:鼠抗人Cystatin S单克隆抗体购自美国R&D公司(货号为:MAB1285);兔抗人Cystatin S多克隆抗体、Cystatin S蛋白标准品购自北京义翅神州生物技术有限公司。CEA单克隆抗体、CEA多克隆抗体，CEA蛋白标准品购自北京义翘神州生物技术有限公司(CEA单克隆抗体和CEA多克隆抗的货号分别为:11077-MM08和11077-MM07)。
[0028]实施例1建立Cystatin S血清检测反应体系及其优化
[0029]用浓度为5 μ g/mL鼠抗人Cystatin S单克隆抗体包被ELISA板,于4°C条件下包被过夜，洗板；然后在质量分数为2%的BSA中室温封闭2小时,洗板；将浓度分别为Opg/mL, 50pg/mL, lOOpg/mL, 200pg/mL, 400pg/mL, 800pg/mL, 1600pg/mL 的 Cystatin S 蛋白标准品(编码Cystatin S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示)和血清样品加入封闭板中，于37°C反应I小时，洗板；然后用浓度为0.5 μ g/mL HRP标记的兔抗人Cystatin S多克隆抗体，在37°C条件下反应I小时，洗板；再与四甲基联苯胺(TMB)反应2-3分钟，最后用浓度为2M的硫酸终止反应，并于450nm条件下检测OD值(图1)。结果显示，Cystatin S线性范围为50pg/mL-1600pg/mL，在线性范围内标准品线性相关系数r≥0.990，回收率在90%~110%范围内。
[0030]检测体系优化，比对分别由美国R&D，英国Abcam和美国NOVUS B10L0GICALS 3个不同公司生产的Cystatin S单克隆抗体、美国R&D公司和北京义翘神州生物技术有限公司生产的Cystatin S蛋白标准品和R&D公司，英国Abcam和北京义翅神州生物技术有限公司生产的Cystatin S多克隆抗体。结果表明,Cystatin S单抗优选R&D公司提供的产品,最佳工作浓度为5 μ g/mL ；Cystatin S蛋白标准品和Cystatin S多克隆抗体优选北京义翅神州生物技术有限公司产品，最佳工作浓度为0.5 μ g/mL，在最佳条件下，可实现背景OD值
<0.1，能够有效区分阴性组与阳性组，且具有统计学意义。
[0031]固相载体的确定:对美国Corning、德国Greiner、美国Thermo和丹麦Nunc4个不同厂家生产的酶标板进行了比较，结果显示，美国corning公司(货号为:9018)和thermo(货号为:468667)公司的酶标板符合背景OD值< 0.1，且信噪比较高。
[0032]包被液的选择:根据抗体包被于固相载体所需要的缓冲体系，ELISA常用包被液为缓冲盐溶液，分别用磷酸盐缓冲液(PH7.5)和碳酸盐缓冲液(pH9.6)检测包被环境对反应体系的影响，结果显示碳酸盐缓冲液(PH9.6)可满足空白组OD值< 0.1，有效区分空白组、阴性组和阳性组，信噪比较高。
[0033]稀释剂的选择:通过实验对比了 2种商品化稀释剂(分别购自天津博美科生物技术有限公司(货号BMKFO17-1);上海西唐生物科技有限公司(货号C0901))和自制稀释剂的稀释效果，主要从保护蛋白能力，自身稳定性两方面评价稀释剂的稀释效果。结果显示自制稀释剂的效果最佳，自制稀释剂各组分的终浓度如下:3mM EDTA、质量分数为0.5%的BSA、1XPBS、质量分数为0.05%的Tween-20和质量分数为0.02%的硫柳汞(pH6.0)。
[0034]稳定剂的选择:使用3种稳定剂(具体如下:稳定剂1:质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油和质量分数为1.3%的NaCl ;稳定剂I1:质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油 ，质量分数为0.1%的EDTA和质量分数为1.3%的NaCl，稳定剂II1:体积分数为68.8%的PBS，体积分数为30%的胎牛血清和质量分数为0.2%的硫柳汞)分别稀释单克隆抗体、蛋白标准品和多克隆抗体至浓度为0.5mg/mL、0.16ng/mL和50 μ g/mL,使用时按体积比为1:100稀释。并于第O天、第7天和第14天进行检测OD值。结果显示，稳定剂III效果最佳，具体组分为:体积分数为68.8%的PBS、体积分数为30%胎牛血清和质量分数为0.2%硫柳萊。
[0035]通过以上研究确定了检测体系的主要组分，并建立Cystatin S血清检测试剂盒。
[0036]实施例2建立CEA血清检测体系及其优化
[0037]用浓度为3 μ g/mL鼠抗人CEA单克隆抗体单克隆抗体包被ELISA板，包被条件是于4°C条件下包被过夜，洗板；然后在质量分数为2%的BSA中室温封闭2小时，洗板；将浓度分别为 0pg/mL, 39.0625pg/mL, 78.125pg/mL, 156.25pg/mL, 312.5pg/mL, 625pg/mL, 1250pg/mL)的CEA蛋白标准品(编码CEA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示)和血清样品加入封闭板中，于37V反应I小时，洗板；然后加入浓度为0.5 μ g/mL HRP标记的兔抗人CEA多克隆抗体，在37°C条件下反应I小时，洗板；再与四甲基联苯胺(TMB)反应2-3分钟，最后用浓度为2M的硫酸终止反应，并于450nm条件下检测OD值(图2)。结果显示，CEA线性范围为39.0625pg/mL-1250pg/mL，在线性范围内线性相关系数r≥0.990，回收率在90%~110%范围内。
[0038]检测体系优化:比对美国R&D，英国Abcam和美国NOVUS B10L0GICALS 3个不同公司生产的的CEA单克隆抗体、美国R&D，北京义翘神州生物技术有限公司生产的CEA蛋白标准品和美国R&D，英国Abcam和北京义翘神州生物技术有限公司生产的CEA多克隆抗体。结果表明，CEA单克隆抗体优选北京义翘神州生物技术有限公司提供的产品(货号为:11077-丽08)，最佳工作浓度为31^/1^ ;CEA蛋白标准品和CEA多克隆抗体优选北京义翘神州生物技术有限公司提供产品，CEA蛋白标准品的最佳工作浓度为1.6ng/mL，CEA多克隆抗体的最佳工作浓度为0.5 μ g/mL。在最佳条件下，可实现背景OD值< 0.1，能够有效区分阴性组与阳性组，且具有统计学意义。
[0039]固相载体的确定:对美国Corning、德国Greiner、美国Thermo和丹麦Nunc 4个不同厂家生产的酶标板进行比较，实验结果显示，其中美国corning公司(货号为:9018)和thermo (货号为:468667)公司的酶标板符合背景OD值< 0.1，且信噪比较高。
[0040]包被液的选择:根据抗体包被于固相载体所需要的缓冲体系，ELISA常用包被液为缓冲盐溶液，分别用磷酸盐缓冲液(PH7.5)和碳酸盐缓冲液(pH9.6)检测包被环境对反应体系的影响，结果显示碳酸盐缓冲液(PH9.6)可满足空白组OD值< 0.1，有效区分空白组、阴性组和阳性组，信噪比较高。
[0041]稀释剂的选择:通过实验对比了 2种商品化稀释剂(分别购自天津博美科生物技术有限公司(货号BMKF017-1)和上海西唐生物科技有限公司(货号C0901))和自制稀释剂的稀释效果，主要从保护蛋白能力，自身稳定性两方面评价稀释剂的稀释效果。结果显示稀释剂终浓度如下式效果最佳:3mM EDTA、质量分数为0.5%的BSA、I XPBS、质量分数为0.05%的Tween-20和质量分数为0.02%的硫柳汞(pH6.0)。
[0042]稳定剂的选择:使用3种稳定剂(3种稳定剂具体如下:稳定剂1:质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油和质量分数为1.3%的NaCl ;稳定剂I1:质量分数为3%的蔗糖，体积分数为8%的甘油，质量分数为0.1%的EDTA和质量分数为1.3%的NaCl，稳定剂III:体积分数为68.8%的PBS，体积分数为30%的胎牛血清和质量分数为0.2%的硫柳汞)分别稀释单克隆抗体、蛋白标准品和多克隆抗体至浓度为0.5mg/mL、0.16ng/mL和50 μ g/mL,使用时按体积比为1:100稀释。并于第O天、第7天和第14天进行检测。结果显示稳定剂III效果最佳最佳组分为:其组分为:体积分数为68.8%的PBS、体积分数为30%的胎牛血清、质量分数为0.2%的硫柳汞。
[0043]通过以上研究确定了检测体系的主要组分，并建立CEA血清检测试剂盒。
[0044]实施例3 Cystatin S-CEA酶联免疫检测试剂盒
[0045]根据实施例1和实施例2中建立Cystatin S和CEA血清检测体系构建CystatinS-CEA酶联免疫检测试剂盒，具体组分如表1所示:
[0046]表1、Cystatin S-CEA酶联免疫检测试剂盒组分[0047]
【权利要求】
1.半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和癌胚抗原在制备诊断和预示胃癌或胃肠间质瘤标志物中的应用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述癌胚抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
3.胃癌或胃肠间质瘤标志物的捕获剂，其特征在于:所述标志物为半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和癌胚抗原，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述癌胚抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
4.根据权利要求3所述的捕获剂:其特征在于:所述捕获剂为识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和癌胚抗原的特异性抗体。
5.含有权利要求3或4所述捕获剂的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒为检测血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和癌胚抗原浓度的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒含有包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于:所述单克隆抗体为鼠抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂S单克隆抗体，所述多克隆为兔抗人半胱氨酸蛋白酶抑制剂S多克隆抗体，所述显色底物为四甲基联苯胺。
10.利用权利要求5_9任一项所述试剂盒建立计算诊断和预不胃癌或胃肠间质瘤阈值的方法，其特征在于:用所述试剂盒检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂S和癌胚抗原浓度，利用P=exp (-5.321-0.069*a+0.152*b) /[1+exp (-5.321-0.069*a+0.152*b)]计算胃癌阈值 P 或P=exp (-9.306-0.031*a+0.415*b) / [1+exp (-9.306-0.031*a+0.415*b)]计算胃肠间质瘤阈值P，当P大于或等于0.75时，为阳性；当卩小于0.75时，为阴性； 其中a代表半胱氨酸蛋白酶抑制剂S浓度,单位为pg/mL, b代表癌胚抗原浓度,单位为ng/mL0
【文档编号】C07K16/18GK103913574SQ201310164754
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年5月7日 优先权日:2013年5月7日
【发明者】王弢, 秦勇, 渠香云 申请人:上海良润生物医药科技有限公司