重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其应用。获得重组野生型cC的方法是：利用pGAPZαA载体构建野生型cC的表达系统；重组野生型cC在毕赤酵母X-33中表达；重组野生型cC的分离纯化。对重组野生型cC对鲢鱼鱼糜凝胶劣化抑制作用的检测方法是：鱼糜样品的制作；对所取鱼糜样品进行温浴处理，加重组野生型cC和未加cC成为对照组；处理样品进行SDS-PAGE，观察结果。本发明验证了重组野生型cC可以直接加入鱼糜制品中，能明显抑制鱼糜制品的凝胶劣化，在加工过程中能较好的保持其弹性，且其安全、无毒，有着良好的应用前景。
【专利说明】重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂(chicken cystatin, cC)及其应用，属于基因工程、分子生物学和微生物学领域。
【背景技术】
[0002]鱼肉被公认为是营养健康食物，不仅可以提供维持身体机能不可缺少的营养物质，而且能起到强身健体、延年益寿的作用，因此鱼肉在人们日常膳食生活中占有重要地位。
[0003]鱼糜制品也叫鱼肉炼制品，其主要原料为鱼肉，是指将鱼体经过采肉、漂洗、脱水，再精滤而制得的湿的肌肉蛋白浓缩物，使其成为了具有弹性的并且易于制作成各种形状与各种风味的水产食物，如我国沿海地区的传统鱼丸、鱼面、鱼糕、鱼卷以及鱼肠等。近年来，随着我国渔业和加工技术的发展，由于鱼糜制品风味多样、方便可口、营养价值高、易于生产且节约能源等优点，我国的鱼糜制品行业取得了长足进展，在世界食品原料市场上，前景十分广阔。
[0004]目前鱼糜生产的原料主要是海水鱼，如阿拉斯加鳕、太平洋鳕。但是近年来由于过度捕捞和环境污染的影响，海水鱼资源日益减少，鱼糜生产的原料问题日益凸现。与此同时我国淡水鱼产量很高，大量的淡水鱼资源有望成为我国鱼糜生产的另一原料来源。鲢鱼是我国重要的淡水养殖鱼种，由于技术方面等原因，大量鲢鱼蛋白资源长期得不到有效的利用。鲢鱼是著名的四大家鱼之一，分布在全国各大水系，是我国淡水鱼中分布最广泛的，主要生活在水中的表层。鲢鱼肉质鲜嫩，营养丰富，能提供丰富的胶质蛋白，是补气、暖胃、润泽肌肤的养生食品。鲢鱼具有生长快、疾病少、不需专门人工投饲的特点，较宜养殖，为我国主要的淡水养殖鱼类之一。目前仍是池塘养殖特别是城郊养鱼的主体鱼，产量居首位，特别是在江苏、浙江一带，产量占养殖总产量的40%-60%。因此鲢鱼鱼糜的开发一方面可以充分利用鲢鱼资源，另一方面又可`以为鱼糜生产提供稳定的新原料，意义重大。
[0005]但是，消费者对鱼糜制品品质有较高的要求，尤其是作为“火锅料理”的鱼糜制品在口味上要求它在沸水中煮过之后仍能保持较高的弹性，吃起来要求滑爽，有嚼头，不油腻等。这对鱼糜制品提出了较高的要求。鱼糜制品的硬度、伸缩性以及粘性的综合体现即为其弹性，其主要由鱼糜中的蛋白质凝胶情况决定，因此凝胶化是鱼糜制品的关键。
[0006]鱼糜蛋白质在凝胶形成过程中主要可分三个阶段，即凝胶化、凝胶劣化及鱼糕化。鱼糜蛋白质中60%以上是盐溶性的肌原纤维蛋白，肌原纤维蛋白中肌球蛋白占60%，肌动蛋白占20%，其他为不溶性蛋白。肌原纤维蛋白质，是鱼肉形成弹性凝胶体的主要成分。在鱼糜制品加工过程中，经过漂洗、擂溃再加入一定量的食盐，可将盐溶性的肌原纤维蛋白充分溶解出，使鱼糜呈现出一种溶胶的状态，为鱼糜蛋白低温凝胶化做准备。鱼糜蛋白凝胶化一般发生在50°C以下，所以又叫低温凝胶化。随着温度的升高，达到50-70°C之间，鱼糜形成的凝胶网络发生分裂或断裂，使鱼糜弹性大幅下降，发生凝胶劣化现象。当温度进一步升高时，达到85°C以上，鱼糜变成有序和非透明状，鱼糜蛋白形成的网络结构被固定形成凝胶，并将水分及其他加入的辅料包裹在里面，鱼糜凝胶的弹性和硬度大幅提高，最后完成鱼糕化。
[0007]凝胶劣化的原因是鱼糜中内源性组织蛋白酶降解蛋白质，使蛋白质网络断裂所致。鱼糜中内源性组织蛋白酶不仅在鱼糜生产及冷藏过程中不易失去活性，且在500C -70°C这个温度段活性最高。肌球蛋白是形成鱼糜凝胶网络结构的最重要的蛋白质，而MHC(肌球蛋白重链)又是肌球蛋白分子中参与凝胶结构的最主要的部分。因此在500C -70°C下内源性组织蛋白酶会引起鱼糜的MHC (肌球蛋白重链)分解而造成解胶，这种降解会造成凝胶劣化，降低鱼糜质量。因此，抑制鱼糜凝胶劣化，保持其弹性显得尤为重要。
[0008]鱼肉制品的腐烂会给人体带来诸多健康危害，而最近由日本地震引发的核污染及频繁发生的近海水域原油污染更使鱼肉制品的生产及冷藏工作日趋受到重视。目前我省市场上常用的肉类防腐剂虽种类较多但大多属化学添加剂，存在安全隐患。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂(chickencystatin, cC),可以抑制鱼糜制品凝I父劣化，对鱼糜制品具有保鲜作用。
[0010]本发明采用的技术方案是:重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其制备方法如下:
1)获得野生型CC的cDNA，通过PCR的方法在cC的cDNA的两端添加XhoI和Xba I的切割位点序列； 2)pGAPZaA_cC重组质粒的构建:利用限制性内切酶ZAo/和油a /同时处理野生型cC的cDNA与pGAPZ a A质粒载体，通过T4 DNA连接酶将目的基因连接到载体上，获得含有cC目的基因的重组质粒pGAPZ α Α-cC ；
3)pGAPZ a A_cC重组质粒的表达:将上述重组质粒pGAPZ a A_cC用Jkt //线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X-33中，选取已经成功转化的菌落，在5mL YPD培养基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖)中活化12h，再以1%的比例接入新的YPD培养基中30°C、200-250rpm培养72h，得菌液；
4)分离纯化:经过Yro培养三天后的菌液，首先3000Xg，4°C，离心lOmin，除去菌体留上清液，再11900Xg，4°C，离心40min，除去不溶性蛋白聚集体，所剩上清液经LabScal TFFSystem浓缩至体积为50_100mL，用20mM，pH5.0的醋酸缓冲液将其稀释到5倍体积后，样品通过CM-Toyopearl离子交换柱，用醋酸缓冲液溶解的0.1M-0.5M的NaCl进行梯度洗脱，与紫外检测仪连接，洗脱峰下的溶液即含有重组的cC，再将收集的混合液经过夜透析除盐存于_80°C冰箱，最后真空冷冻成粉末，即得到目标产物重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
[0011]上述的重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂在抑制鱼糜制品凝胶劣化中的应用。方法如下:于鱼糜制品中，加入上述的重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂，混合均匀，于50-60°C加热15-90分钟，然后升温至95-105°C，继续加热20-40分钟。优选的，重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的加入量为鱼糜制品重量的0.1%-0.4%。
[0012]本发明的有益效果是:本发明成功的在毕赤酵母X-33转化体中以溶解态的形式对cC进行了克隆和表达。所制备的重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以直接加入鱼糜制品中，能明显抑制鱼糜制品的凝胶劣化。而且，在加工过程中能较好的保持其弹性。由于其安全、无毒，添加到鱼糜制品中不会对其风味产生影响。本发明的重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂作为一种天然蛋白，可有效抑制鱼糜制品的凝胶劣化，也有抑菌作用，添加到鱼糜制品中还可以作为生物保鲜剂，本发明的重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂安全、无毒，有着良好的应用前景，具有极大的经济、社会及环境效益，市场应用潜力巨大。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是重组质粒pGAPZ a A_cC的单双酶切验证图。
[0014]图2是SDS-PAGE检测在毕赤酵母中表达的重组野生型cC的分离纯化结果。
[0015]图3是SDS-PAGE检测温浴处理中，重组野生型cC对鲢鱼鱼糜凝胶劣化的影响。
[0016]图4是SDS-PAGE检测用量中，重组野生型cC对鲢鱼鱼糜凝胶劣化的影响。
[0017]图5 是 SDS-PAGE 凝胶经 AlphaeaseFC? 分析。
【具体实施方式】
[0018]实施例1重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂(重组野生型cC)的获得 1.获得野生型cC的cDNA:
首先将含有鸡cystatin cDNA的pT7 blue T载体(日本山口大学农学部加藤昭夫教授赠予)用包含通ο /和油a /切割位点序列的PCR引物(正义引物5’ —GGGCTCGAGAAAAGAAGCGAGGA—3’，5’ 一GGGTCTAGATTACTGGCACTTGCT— 3’ 反义引物)扩增，获得野生型cC的cDNA。
[0019]2.利用pGAPZ `a A载体构建重组质粒pGAPZ a A_cC
pGAPZ a A质粒是具有Zeocin抗性基因的表达载体，是含有能用葡萄糖诱导及在酵母中高水平表达的GAP启动子的表达载体。利用限制性内切酶ZAo /和油<3 /同时处理野生型cC的cDNA与pGAPZ a A质粒载体，通过T4 DNA连接酶将目的基因连接到载体上，获得含有cC目的基因的重组质粒pGAPZ αΑ-cC。将获得的重组质粒用限制性内切酶ZAo /和Xba /做单双酶切验证，结果见图1。
[0020]图1中，M为DNA Marker, I道为pGAPZ a A质粒单酶切；2道为pGAPZ a A_cC重组质粒单酶切；3道为pGAPZaA-cC重组质粒双酶切；4道为pGAPZ a A质粒双酶切。从图中可看出，2道中pGAPZ a A_cC重组质粒比I道中pGAPZ a A质粒分子量稍大，3道中对pGAPZ a A_cC重组质粒双酶切得到一个大片段一个小片段，大片段与pGAPZ a A质粒分子量相同，小片段是cC的cDNA。证明目的片段已经连接到载体上，重组质粒pGAPZ a A-cC构建成功。
[0021]3.重组野生型cC在毕赤酵母中的表达
将上述重组质粒pGAPZ a A-cC用Jkt//线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X-33中。选取已经成功转化的菌落，在5mL YPD培养基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖)中活化12h后，再以1%的比例接入新的YPD培养基中30°C、200-250rpm培养72h。
[0022]4.重组野生型cC的分离纯化
经过YPD培养三天后的菌液，首先3000Xg，4°C，IOmin离心除去菌体留上清液，再11900Xg，4°C离心40min除去不溶性蛋白聚集体。所剩上清液经LabScal TFF System浓缩至体积为50-100mL后，再用20mM，pH5.0的醋酸缓冲液将其稀释到5倍体积。样品通过CM-Toyopearl离子交换柱，用醋酸缓冲液溶解的0.1M_0.5M的NaCl进行梯度洗脱。与紫外检测仪连接，洗脱峰下的溶液即含有重组的cCs，经计算洗脱下cCs的盐浓度在0.2M-0.3M范围内。再将获得的混合液经过夜透析除盐存于_80°C冰箱，最后真空冷冻成粉末即为重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂。将洗脱后的产品做SDS-PAGE电泳图，结果见图2。
[0023]图2中，M为蛋白Marker，第1_9道分别为在洗脱峰下收集的1_9号试管中采集的样品。从图2中可以看出，3-6号管中有重组野生型cC，分子量约为14KD，基本没有杂蛋白带。证明我们成功得构建了野生型cC表达系统，成功得在毕赤酵母X-33中表达，并且通过CM-Toyopearl离子交换柱达到了较好的分离纯化效果。
[0024]实施例2 重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂(重组野生型cC)对鲢鱼鱼糜制品凝胶劣化的影响
1.鱼糜样品的制作
将新鲜的鱼洗净、去鳞、头及内脏，除去腹腔的黑膜，采集鱼肉，将鱼肉经过两次4°C遇冷的蒸馏水漂洗，纱布浙干，而后添加相当于鱼肉质量3%的NaCl，置于研钵中，加入4V遇冷的20 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)于冰上研磨，研磨匀浆lOmin，直至溶液呈稀薄状，得鱼糜粗样品。
[0025]2.重组野生型cC岁鲢鱼鱼糜凝胶劣化的抑制作用
将得到的鱼糜粗样品，分成9份装于离心管中并标号，每份大约0.Sg。其中6-9号离心管中每管添加重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂2mg，混合充分。
[0026]I)温浴处理:按表1所示处理温度和处理时间对1-9号离心管进行实验操作。
【权利要求】
1.重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于制备方法如下: 1)获得野生型CC的cDNA，通过PCR的方法在cC的cDNA的两端添加沿οI和油a I的切割位点序列； 2)pGAPZ a A_cC重组质粒的构建:利用限制性内切酶通ο I和Xba /局奴处理野生型cC的cDNA与pGAPZ a A质粒载体，通过T4 DNA连接酶将目的基因连接到载体上，获得含有cC目的基因的重组质粒pGAPZ α Α-cC ； 3)pGAPZ a A_cC重组质粒的表达:将重组质粒pGAPZ a A_cC用Avr //线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X-33中，选取已经成功转化的菌落，在5mL YPD培养基中活化12h，再以1%的比例接入新的YPD培养基中30°C、200-250rpm培养72h，得菌液； 4)分离纯化:将菌液，首先3000Xg，4°C，离心lOmin，除去菌体，留上清液，再11900 X g，4。。，离心40min,除去不溶性蛋白聚集体，所剩上清液经LabScal TFF System浓缩至体积为50-100ml，用20mM，pH5.0的醋酸缓冲液将其稀释到5倍体积后，样品通过CM-Toyopearl离子交换柱，用醋酸缓冲液溶解的0.1M_0.5M的NaCl进行梯度洗脱，将收集的混合液经过夜透析除盐存于_80°C冰箱，最后真空冷冻成粉末，得目标产物。
2.权利要求1所述的重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂在抑制鱼糜制品凝胶劣化中的应用。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于方法如下:于鱼糜制品中加入权利要求1所述的重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂，混合均匀，于50-60°C加热15-90分钟，然后升温至95-105 °C，继续加热20-40分钟。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于:重组野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的加入量为鱼糜制品重量的0.1%-0.4%。
5.按照权利要求3或4所述的应用，其特征在于:所述的鱼糜制品是鲢鱼鱼糜。
【文档编号】C12N15/81GK103773794SQ201410018387
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】何剑为, 王娜, 王禹, 贺敏, 周倩, 时博阳 申请人:辽宁大学