半胱氨酸蛋白酶抑制剂s的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了半胱氨酸蛋白酶抑制剂S（CystatinS）的新用途，具体为CystatinS在制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物中的应用；本发明还公开了诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物的捕获剂，并将捕获剂用于制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的试剂盒，制得的试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点，能够用于肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的早期诊断、治疗过程中的疗效评估以及治疗后的转移复发监控。
【专利说明】半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医学检测领域，涉及半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的应用。
【背景技术】
[0002]随着对肿瘤发病机理研究的不断深入，发现Cystatin家族作为组织蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的内源性抑制剂，在肿瘤的发生、发展、浸润和转移过程中起着非常重要的作用。研究结果显示，Cystatin家族成员在不同肿瘤中的表达水平有所上升,例如CystatinC在卵巢癌和头颈部癌症中的表达有不同水平的上升，stefin A在非小细胞肺癌中的表达水平有所增加，Cystatin F在多种肿瘤中的表达水平都有显著增加，很可能是由于在肿瘤发生、发展过程中需要组织蛋白酶的参与，先诱导其表达量增加，再激活机体本身的应激机制，导致Cystatin的表达量上升以抑制过里量的组织蛋白酶活性。但Cystatin的表达量并不与肿瘤的发展呈正相关，例如在胶质瘤中，Cystatin C的低表达意味着疾病的晚期，患者的生存期较短，且易于复发，这可能是到了肿瘤的后期阶段，会有一些其他的机制对Cystatin的水平进行调控，以促进肿瘤的进一步恶化。
[0003]半胱氨酸蛋白酶抑制剂S (Cystatin S)是人类Cystatin家族成员，由CST4基因编码的含141个氨基酸的蛋白质，分子量为16.4Kda。Cystatin S分子中含有两个二硫键，为典型的分泌蛋白，分布于体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等。据文献报道，CST4在胃癌组织中的表达量高于正常胃粘膜组织，在胃癌细胞系中的表达部位与胃癌组织较一致，且表达率随细胞系的分化程度降低而降低。临床资料分析表明，CST4的表达与浸润深度、远处转移以及肿瘤分期(!TM分析)相关；生存分析表明，CST4表达阳性患者的5年生存率显著高于无表达组；Cox回归分析表明，CST4是一个独立预后因子；从而提示CST4可能在胃癌的发生、发展过程中发挥类似肿瘤抑制因子的作用。但迄今为止，CST4可用于胃癌的疗效评估、转移复发监控未见报道，同时也未见CST4与其他疾病如胰腺癌、食管癌、肝癌和胃肠间质瘤等相关的报道。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽在制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物中的应用；本发明的目的之二在于提供肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物的捕获剂；本发明的目的之三在于提供含有上述捕获剂的试剂盒。
[0005]为达到上述目的，本发明提供如下技术方案:
1.CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽在制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物中的应用，所述CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006] 优选的，所述CST4基因截短片段是以SEQ ID N 0.2、5所示核苷酸序列为上游引物，SEQ ID N 0.3、6所示核苷酸序列为下游引物扩增所得的核苷酸序列，所述SEQ ID N0.2与 SEQ ID N0.3 配对，所述 SEQ ID N0.5 与 SEQ ID N0.6 配对。
[0007]优选的，所述CST4基因编码的Cystatin S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所
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[0008]优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
[0009]2.肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物的捕获剂，所述标志物为CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的CystatinS蛋白或Cystatin S多肽，所述CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]优选的,所述捕获剂为识别Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽的特异性抗体。
[0011]优选的，所述捕获剂为检测CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因的截短片段的特异引物和探针。
[0012]优选的，所述特异引物如SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示。
[0013]3.含有所述捕获剂的试剂或试剂盒。
[0014]优选的，所述试剂盒为CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段实时定量检测试剂盒，其上游引物如SEQ ID N0.5，下游引物SEQ ID N0.6所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示；或，
所述试剂盒为Cystatin S酶联免疫检测检测试剂盒,包括包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
[0015]更优选的，所述单克隆抗体为鼠抗人Cystatin S单克隆抗体，所述多克隆抗体为兔抗人Cystatin S多克隆抗体，所述显色底物为四甲基联苯胺。
[0016]本发明的有益效果在于:本发明公开了 CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽作为检测肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的标志物，并公开了检测上述标志物的捕获剂，将捕获剂与常规试剂组成检测试剂盒，获得的试剂盒具有灵敏度高、特异性好等优点，能够用于肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的早期诊断，利用试剂盒的诊断结果可早于临床症状，同时还可以用于治疗过程的疗效评估和治疗后的转移复发监控。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
图1为重组质粒结构图。
[0018]图2为CST4基因的mRNA绝对定量检测试剂盒检测胰腺癌ROC曲线。
[0019]图3为CST4基因的mRNA绝对定量检测试剂盒检测食管癌ROC曲线。
[0020]图4为CST4基因的mRNA绝对定量检测试剂盒检测肝癌ROC曲线。
[0021]图5为CST4基因的mRNA绝对定量检测试剂盒检测胃肠间质瘤ROC曲线。
[0022]图6为CST4基因的mRNA绝对定量检测试剂盒检测胃癌ROC曲线。
[0023]图7为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测Cystatin S蛋白的标准曲线。
[0024]图8为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测胰腺癌ROC曲线。
[0025]图9为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测食管癌ROC曲线。[0026]图10为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测肝癌ROC曲线。
[0027]图11为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测胃肠间质瘤ROC曲线。
[0028]图12为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测胃癌ROC曲线。
【具体实施方式】
[0029]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0030]本发明使用的试剂如下:Taq DNA聚合酶购自罗氏公司(货号为:12032953001)；尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)购自NEB公司；dNTPs购自TAKARA公司；引物和探针由上海英潍捷基生物技术有限公司合成；Cystatin S单克隆抗体购自美国R&D公司(货号为:MAB1296);兔抗人Cystatin S多克隆抗体(货号为:11542_RP02)、Cystatin S蛋白标准品(货号11542-H08H)购自北京义翘神州生物技术有限公司。
[0031]实施例1制备重组质粒标准品
重组质粒标准品制备，按照分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中的步骤及条件制备:
根据报道的CST4基因序列设计扩增CST4基因截短片段的引物(CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)，具体如下:
上游引物:5，- ctgcctctgaggagaccatggc-3’ (SEQ ID N0.2)；
下游引物:5，- ggcgatgctactgtttaattgcag-3’ (SEQ ID N0.3)。
[0032]以SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列为引物，人cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系:上、下游引物终浓度为250nM，Taq DNA聚合酶终浓度为IU/反应；dNTPs终浓度为250 nM，其他试剂参照试剂盒说明书进行。PCR反应条件为:37°C，2分钟；95°C预变性5分钟；95°C变性10秒，60°C退火并延伸30秒，进行45个循环，获得如SEQ IDN0.4所示的核苷酸序列。将扩增获得的序列连入PMD18-T载体中，得含CST4基因截短片段的重组质粒，结构如图1所示。将含CST4基因的重组质粒转入DH5ci，筛选阳性克隆，然后提取重组质粒，作为标准品S。将重组质粒分别稀释至浓度为IO6Copy/μ L、105copy/μ L、IO4Copy/ μ L、2000copy/ μ L、500 copy/ μ L、250copy/ μ L 和 62.5copy/ μ L,并分别命名为标准品S1、标准品S2、标准品S3、标准品S4、标准品S5、标准品S6和标准品S7。
[0033]实施例2构建CST4荧光定量PCR检测试剂盒
根据CST4基因序列设计定量检测CST4基因、CST4基因的cDNA、CST4基因的mRNA或CST4基因截短片段的引物和探针，具体如下:
上游引物为:5’ -aacaaggccaccgaagatga-3’ (SEQ ID N0.5)；下游引物为:5，-ccacctctacgtcgaagaagta-3，(SEQ ID N0.6)；探针为:FAM_cccaaaggtctgctccctggctcgca-TAMRA (SEQ ID N0.7)。同时以人B2M基因为内控，并设计内控基因的检测引物和探针:上游引物为:5’ -actgaattcacccccactga-3’ (SEQ IDN0.8)；下游引物为:5’ -cctccatgatgctgcttaca-3’ (SEQ ID N0.9);探针为:FAM-tatgcctgccgtgtgaaccatgtgac- TAMRA (SEQ ID N0.10)。然后利用设计的引物和探针与其他常规试剂组成CST4荧光定量检测试剂盒，试剂盒成分如表1所示。
[0034] 表1、CST4荧光定量PCR检测试剂盒
【权利要求】
1.CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽在制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物中的应用，所述CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述CST4基因截短片段是以SEQIDN0.2、5所示核苷酸序列为上游引物，SEQ ID N0.3、6所示核苷酸序列为下游引物扩增所得的核苷酸序列，所述SEQ ID N0.2与SEQ ID N0.3配对，所述SEQ ID N0.5与SEQ ID N0.6配对。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述CST4基因编码的CystatinS蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.11所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
5.肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物的捕获剂，其特征在于:所述标志物为CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽,所述CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
6.根据权利要求5所述的捕获剂，其特征在于:所述捕获剂为识别CystatinS蛋白或Cystatin S多肽的特异性抗体。
7.根据权利要求5所述的捕获剂，其特征在于:所述捕获剂为检测CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段的特异引物和探针。
8.根据权利要求7所述的捕获剂，其特征在于:所述特异引物如SEQID N0.5和SEQID N0.6所示,所述探针的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示。
9.含有权利要求5-8任一项所述捕获剂的试剂或试剂盒。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒为CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段实时定量检测试剂盒，其上游引物如SEQ IDN0.5，下游引物SEQ ID N0.6所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示；或， 所述试剂盒为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒,包括包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于:所述单克隆抗体为鼠抗人CystatinS单克隆抗体，所述多克隆抗体为兔抗人Cystatin S多克隆抗体，所述显色底物为四甲基联苯胺。
【文档编号】C12Q1/68GK103911426SQ201310164671
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年5月7日 优先权日:2013年5月7日
【发明者】王弢, 秦勇, 渠香云 申请人:上海良润生物医药科技有限公司