制备
[0036] 化学合成得到10个氨基酸残基作半抗原和96个氨基酸残基作为化TK1作标准质 控品，经HPLC鉴定纯度大于96%，质谱鉴定质量合格。再将半抗原10肤的C端酷胺化，并 在N端连接半脱氨酸（委托中国深圳翰宇公司）
[0037] CRHHHKVPNRPYLNSN沈EFIKFFKN-酷胺化
[003引上述优化的半抗原与BSA交联组成10肤-BSA免疫抗原（化学合成委托中国深圳 翰宇公司）。
[0039] 实施例3
[0040] 用实施2的免疫抗原，按照现有的单/多克隆抗体技术制备化TK1抗体。实施3 是按照母鸡免疫程序和I巧抗体筛选技术，W I巧抗体筛选的技术为实例，制备抗TK1 I巧 粗品步骤。详细步骤见专利化02134727. 1，"抗细胞质胸巧激酶一I巧的制备及肿瘤诊断 组合物"中的实施例5,6和7。
[0041] 用上述10肤-BSA免疫抗原免疫母鸡和制备抗体。利用母鸡免疫的优点在于；
[0042] (1)鸡的I巧和人的IgG两者间存在分子遗传差异性；
[0043] (2)鸡的TK1和人的TK1有种族差异性；
[0044] (3)与传统的兔免疫制备的多克隆抗体比，蛋黄中提取的I巧具有内源分子均一 性（只产生一种类型的抗体分子，即I巧）；
[0045] (4) I巧抗体不激活人补体系统，从而部分地阻断人血清中非特异抗原结合位点的 激活；
[0046] (5)类风湿因子（R巧与I巧抗体不反应。该种RF是许多免疫测定中非特异反应 的主要来源，因为RF与哺乳动物抗体IgG的化部分反应，可导致化患者和健康人样品的 假阳性。
[0047] 用上述免疫抗原免疫母鸡，提取卵黄液体，采用水萃取制备抗体溶液，纯化所述抗 TK1I巧粗品包括下述步骤；
[0048] 第一步：选择180天龄健康来航母鸡30只，上述10肤-BSA免疫抗原用PBS缓冲 液溶解与福氏完全佐剂按1 ;1混合，注射到产蛋母鸡的胸肌。经每周，共两次免疫后，再用 福氏不完全佐剂与免疫抗原混合液加强免疫，四周后每天收集鸡蛋，在4°C下储存；
[0049] 第二步：免疫母鸡生产出的抗体是否具有高特异性和高灵敏度的初筛，分离每个 免疫母鸡的卵黄液。抗体的粗品纯化过程如下：分离蛋黄与蛋白，完整的蛋黃用无离子水 洗净后去蛋黄表皮，收集蛋黄液。用10倍体积的蒸馈水稀释蛋黄液，拌揽均匀后调抑值为 5. 0,4°C下放置过夜。次日取出后调抑值至5. 5,通过二次硫酸锭沉淀法，第一次按1000ml 溶液加硫酸锭固体35Ig的比例，第2次按每1000ml加196g硫酸锭的比例，在10°C、4000转 /分转速下冷冻离屯、24分钟。弃去上清液，将沉淀蛋白用1 ;4的无离子水稀释并用0. 5mol/ L的化OH溶液调节抑至8. 0。用G25柱脱除硫酸锭后，混合的粗品溶液上制备好的亲和层 析柱。
[0050] 实施例4亲和柱制备
[0051] 根据免疫抗原类型，选择CNBr-activated Se地aroseAF'ast Flow为材料与Uu质 控品96肤偶合，亲和柱的偶合制备程序参见产品说明佑E Healthcare, UK)。采用实施 例3第二步得到的水萃取后得到抗体粗品，经亲和层析纯化得到初筛的化TK1抗体。纯 化抗体：于2-8°C下将混合粗品液加入亲和柱，循环5次，每ml亲和柱第1次过柱速度为 0. 2-0. 25ml/min。循环后用亲和柱平衡溶液冲洗杂蛋白，经过3次W上的重复测试，UV均 小于0. 010时，停止冲洗；用1. 5倍亲和柱体积的Actis巧洗脱抗体，再用G25柱洗脱除去 Actisep，将收集好的抗体混合，测混合后的UV值；及时调抑至8. 0,加入保护试剂，保存抗 体于+4-8度冰箱。
[0化2] 实施例5硝酸纤维素膜点印染/免疫增强发光检测系统巧CL)对化TK1-I巧抗体 筛选和鉴定
[0化3] 参照专利化201110353971. 0,"一种多表位TK1抗体的制备及其在人群体检筛查 中早期肿瘤检测和风险预警中的应用"中实施例9 ;应用TK1-I巧抗体（1)硝酸纤维素膜点 印染/免疫增强发光检测系统巧CL)的缩时检测方法，建立人血清TK1快速检测方法。其 程序是：
[0化4] 1)取清晨空腹血样品，于4000巧m，8-10分钟，分离血清。将3微升的生物体液样 品（例如血清）精确点样到硝酸纤维素膜曲band TMC，GE，UK)上，同时，用不同稀释浓度 的miTKl质控品点样。风干30分钟，用抑为7. 5的TBS(20mmol/L Tris，0. 15mol/L化C1) 漂洗（2分钟/2次）；
[005引。加入用TBS缓冲液配置的6%的脫脂奶粉，室温下封闭1小时，除去封闭试剂； [0化6] 3)加入用TBS配置的最佳稀释浓度的化TK1抗体，免疫反应1. 5小时。反应完成 W后，用TBST (TBST中加入0. 1 %吐温20)迅速漂洗2次，震摇洗漆3次巧分钟/I次）； [0化7] 4)加生物素化第2抗体，按抗体浓度Img/ml，最佳浓度稀释为1500倍，室温下震 摇反应40分钟。反应毕，同上方法洗漆；
[005引 巧加入亲和素-辣根过氧化物酶（Str巧tavidin-Horse Radish化roxidase)。按 上方法洗漆后，用E化发光试剂精确反应1分钟，甩干后，该膜密封于薄膜袋，放入CCD检测 仪器，用CCD烟larged Coupled Device)成像系统分析仪捕获信号和扫描定量分析此发光 信号的强弱。用此标准曲线计算被检者化TK1的变化水平，此化TK1值的水平对应于被检 者的解脈支原体的增殖速度。按照此法建立健康人化TK1标准阔值，如化TK1的浓度大于 正常健康人标准阔值，评估为风险升高值。
[0化9] 依照上述方法检测方法样品：样品1为化TK1质控品（浓度；0. 6,1. 8和5. 4pg/3 微升）。样品2为人TK1质控品（浓度；0. 6,1. 8和5. 4pg/3微升）。样品3为化培养法 14份阳性反应样品。样品4为4份人TK1高表达的肿瘤患者血清样品（大于1.8pg)。样 品5为6份人TK1低表达的健康人血清样品（小于0.化g)。图示，化TK1抗体仅仅与化TK1 质控品呈现线性相关的表达，不同化感染的患者显示化TK1的高表达，范围2. 1-6. 12pg/3 微升。化TK1抗体与人TK1质控品反应极微弱，视为阴性反应。化TK1抗体与TK1高表达的 人肿瘤患者血清样品和TK1低表达的健康人血清样品均反应极微弱，视为阴性反应。
[0060] 实施例6生物素直接标记化TK1-I巧抗体
[0061 ] 横酸基班巧酷亚胺-LC-生物素直接标记化TK1-I巧抗体（2143试剂盒EZ- Link? Sulfo-NHS-LC-Biotinylation，Pierce, USA)。从-20度冰箱取出的横酸基班巧酷亚 胺-LC-生物素瓶，按照说明书披露的方法计算，20倍摩尔比的生物素试剂与1倍摩尔的 IgG抗体，将1毫克生物素溶解于182微升的超纯无离子水中，取24. 1微升加入到用975. 9 微升的PBS中，配置2毫克纯化化TK1-I巧抗体。冰浴解育两小时或在室温下反应30-60 分钟。用HABA Assay检测分子数，即刻用脱盐柱清除多余的生物素。
[0062] 实施例WuTKl抗体与化TK1质控品反应最佳反应条件的建立
[0063] 对制备的抗体是否仅与化TK1抗原有特异性反应的确认。用实施7所述的增强发 光免疫点印迹方法检测和实施8所述的生物素直接标记化TK1-I巧抗体方法，测试不同浓 度化TK1抗体与抗原反应最佳反应条件。即在固定一过量抗体条件下，配置比例为9 ;3 ;1 的不同稀释浓度的质控品。得到最佳抗体稀释浓度（0. 125微克/毫升）和质控品，稀释比 例浓度巧.4,1. 8和0.化g/3 y 1)，如图2所示。
[0064] 实施例抓uTKl-I巧抗体的特异性和灵敏度鉴定
[00化]对制备的抗体是否与人TK1有免疫交叉反应的确认，用纯化的人重组TK1，其浓度 为20,6. 6和化M，用实施例5和7所述的增强发光免疫点印迹方法检测，结果显示无免疫交 叉反应。该说