一种应用切向流超滤技术制备孕马血清促性腺激素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及兽药技术领域，特别是涉及一种应用切向流超滤技术制备高纯度孕马血清促性腺激素的方法。
【背景技术】
[0002]孕马血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG)是来自于妊娠40?120天怀孕母马血清(浆)加工纯化制品，具备用于繁殖中促卵泡素及黄体生成素的双重性质；对于雌性动物，可促进其卵巢中卵泡发育及黄体生成；对于雄性动物，可促进睾丸精细管中精子生成及睾丸间质细胞分泌。试验证明，PMSG在同期发情、超数排卵、胚胎移植、治疗不发情、弱发情、情期不孕等方面应用效果极佳。
[0003]近年，在工厂化高效饲养配套技术中，用于超数排卵(可使单胎动物产双胎或多胎)、同期发情(规模化生产中的关键技术)、同期受孕，大大提高了生产效率，便于管理和操作。工厂化饲养近年来正在国内形成新的巨大产业。因此，本品受到学术界和用户的高度重视和欢迎，展现了极好的市场前景。
[0004]我国在80年代前使用孕马原血清，给马属之外的各种动物注射导致常发生过敏反应，甚至死亡。至70年代末期改革开放，企图出口此品国内才开始研制。1982年，孕马血清促性腺激素(简称血促性素PMSG)的纯化方法在我国研制成功，由于其在动物繁殖及生物技术方面的良好作用，多次在地方及展览会上获奖，1992年又获国家科技进步二等奖，证书号:(92)9120267。我国拥有大量的马匹资源及产品需求，三十多年来国内PMSG产品取得了较快的发展。1992年，我国农业部首次将兽用血促性素纳入“《中国兽药规范》1992年版”中，至2011年又收至我国农业部药典中。
[0005]CN1199687C公开了一种孕马全血提取促性腺激素的方法，其存在诸多不合理之处，例如:(1)CN1199687C将马血通过离心分离得到血清；由于血清在存放时很快就会出现絮状细小的沉淀，这就要求生产工艺中要在分离血清后要马上进行超滤；这在工业化生产过程中很难实现的，因为采集的孕马血要积累到大量，才能投入工业化生产，这个过程中血清就会出现沉淀。;(2)说明书中提到“总固体为40mg/ml”，加酸后“经0.22 μπι膜除菌”，这个步骤在工艺上很难实现，这是因为40mg/ml的总固体粘度很大，无法进行过滤除菌。
[0006]CN103275206A公开了一种孕马血清促性腺激素的提纯方法，其公开了现有技术中常用的“盐析制备法”，它的不足之处在于:
[0007](I)在“乙醇清洗”步骤使用了“与沉淀物等重量的无水乙醇”，药用的无水乙醇价格高，导致生产成本居高不下；
[0008](2)在“辛酸沉淀”步骤使用了辛酸，会造成产率低、操作繁琐，且会使产品活性造成一定的机械损耗；
[0009](3)在“盐析沉淀”步骤加入了硫酸铵，硫酸铵属于腐蚀性化学试剂，会造成环境污染；
[0010](4)在“透析清洗”步骤使用大量的流动水进行透析，不但工艺复杂，生产效率低，而且会浪费大量的水资源。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种绿色环保、产率高的制备孕马血清促性腺激素的方法，该方法的目的是从含有多种蛋白质及血液因子的健康马血浆或血清中将含量极少的PMSG活性物质0.43?0.8单位/毫克(按血浆中含蛋白质干物计算，称为纯度)进行提取、纯化至200?10000倍后得到PMSG成品。
[0012]为实现本发明的目的所采用的技术方案是:一种应用切向流超滤技术制备孕马血清促性腺激素的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0013](I)将待提取的孕马原血浆放入容器内，在搅动的同时加入0.5当量的偏磷酸至PH值为3.5，滤过，取上清液；
[0014](2)调节上清液的pH值为5.8，然后将上清液通入截留2万分子量的中空纤维柱进行切向流超滤，得到收集液，至收集液的蛋白浓度为5.0mg/ml时终止；
[0015](3)将步骤(2)得到的收集液加入浓度为95%的冷乙醇至终浓度35%，pH值为5.3，以4000rpm进行离心，得到沉渣和上清液i，收集上清液i并暂放O?5°C的环境下；在离心后得到的沉渣中加入35%的缓冲酒精进行搅拌溶解，再以4000rpm进行离心，得到上清液?，合并上清液i和上清液? ；
[0016](4)步骤(3)合并后得到的上清液中加入浓度为95%的乙醇，二者混合后终浓度为75%，调节pH值为4.0，然后在O?5°C放置2小时以上，再以4000rpm进行离心，收集沉淀；
[0017](5)步骤(4)收集的沉淀用灭菌生理盐水进行稀释，调节pH值为6.0?7.0，通入小型超滤器内的截留分子量I万的TFF膜包，浓缩至所需体积，即得高纯度孕马血清促性腺激素。
[0018]优选的，所述步骤(3)中使用的缓冲酒精中的各组分配比为:8.1g醋酸钠、1N(当量)的冰醋酸40ml、160ml的水和75ml浓度为95%的乙醇。
[0019]所述步骤⑶中使用的缓冲酒精的配置方法为:将8.1g的醋酸钠溶于60ml水，再加入1N(当量)的冰醋酸40ml，搅拌的同时加入10ml水和浓度为95%乙醇75ml，充分搅拌后制得。
[0020]本发明的制备原理为:血液中PMSG的分子量在6KDa左右，血液中与PMSG分子量近似的成分较多，例如白蛋白的分子量在6.6KDa(68500道尔顿)，需要先将其生成沉淀除去；将滤液通过2万道尔顿的中空纤维柱，滤液中大于2万道尔顿的蛋白成分被保留，低于2万道尔顿的成分则被废弃；滤液然后经过低温乙醇提取、离心后的沉淀再用缓冲酒精进行稀释，随后在经过截留分子量I万的TFF膜包进行超滤浓缩，即完成制备过程。
[0021]与现有技术中采用的盐析制备法相比，本发明的有益效果是:
[0022](I)本发明提供的制备方法无需硫酸铵；盐析制备法中每100公斤的马血原料需要耗用硫酸铵65公斤每提取I吨血浆所用的硫酸铵市场价格约为9100元，每年以使用10吨血楽计，可节约9万多元；此外，硫酸钱的腐蚀性很强，对人体呼吸道、皮肤会造成一定的损伤，所穿衣服、甚至对地面、排放管道均能造成腐蚀，工作环境恶劣，危险性高；用硫酸铵进行反应得到的沉淀需要进行刮沉淀、叠滤布、机械加压等工序，步骤繁琐，完成该过程需72小时；本发明提供的应用切向流超滤技术进行制备仅需3?4小时即可完成；
[0023](2)相比于现有技术，本发明