提供的制备方法的乙醇消耗量能够减少2/3，由于用切向流超滤技术，浓缩的滤液体积可达10?20倍，大大降低了生产成本；
[0024](3)盐析制备法的制备周期为9天，本发明提供的制备方法能够缩短至5天，大大缩短了生产周期；
[0025](4)本发明在制备工艺中对离心得到的沉渣，加入缓冲酒精进行洗涤，可以将其中的一些有效活性再溶解洗出，增加了收率，降低了成本；现有技术中往往是将沉渣作为废弃物处理的；
[0026](5)本发明提供的制备方法应用切向流超滤技术，所得制品无菌、无热源、外观微黄透明，产品质量好。
【具体实施方式】
[0027]以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0028]实施例:
[0029]一种应用切向流超滤技术制备孕马血清促性腺激素的方法，包括以下步骤:
[0030](I)将待提取的孕马原血浆放入容器内，在搅动的同时加入0.5当量的偏磷酸至PH值为3.5，滤过，取上清液；
[0031](2)调节上清液的pH值为5.8，然后将上清液通入截留2万分子量的中空纤维柱进行切向流超滤，得到收集液，至收集液的蛋白浓度为5.0mg/ml时终止；
[0032](3)将步骤(2)得到的收集液加入浓度为35%的冷乙醇至pH值为5.3，以4000rpm进行离心，得到沉渣和上清液i，收集上清液i并暂放O?5°C的环境下；在沉渣中加入35 %的缓冲酒精进行搅拌溶解，再以4000rpm进行离心，得到上清液ii，合并上清液；所述缓冲酒精能够对离心得到的沉渣进行再溶解洗出，再收集一次其中的有效活性成分，增加了收率，降低了成本；
[0033](4)步骤(3)合并得到的上清液中加入浓度为95%的乙醇至二者混合后的终浓度75%，调节pH值为4.0，在O?5°C放置2小时以上，再以4000rpm进行离心，收集沉淀；
[0034](5)步骤(4)收集的沉淀用灭菌生理盐水进行稀释，调节pH值为6.0?7.0，通入小型超滤器内的截留分子量I万的TFF膜包，浓缩至所需体积，即得PMSG高纯度提纯品。
[0035]上述制得的PMSG高纯度提纯品，经过除菌滤过、大白鼠卵巢增重法测定效价、动物毒性试验(实验动物购自军事医学科学院)、无菌检验之后，再进行分装、冻干即得PMSG成品(药典中称为血促性素)。
[0036]优选的，所述步骤(3)中使用的缓冲酒精中的各组分配比为:8.1克醋酸钠、I当量的冰醋酸40晕升160晕升的水和75晕升I浓度为95%的乙醇。
[0037]所述步骤(3)中使用的缓冲酒精的配置方法为:将8.1克的醋酸钠溶于60毫升水，再加入IN(当量)的冰醋酸40毫升，搅拌的同时加100毫升水和浓度为95%乙醇75毫升，充分搅拌后制得。
[0038]实验室阶段:孕马血浆原料80000毫升，经过上述制备方法提取后得到的PMSG的效价由30单位/毫升提高至1830.9单位/毫升。
[0039]生产阶段:生产用孕马血浆763000毫升，计3815万单位，收率为85%，PMSG成品的效价在2000?9000单位/毫升之间，纯度在800?4000单位/毫克，大大超出了农业部制定的国家标准效价1000单位/毫升和纯度100单位/毫克。
[0040]本发明提供的PMSG成品已经在试验阶段应用于生物技术研宄方面的超数排卵，在猪、羊、牛、梅花鹿、水貂等动物均取得了提高繁殖率的良好效果。
[0041]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种应用切向流超滤技术制备孕马血清促性腺激素的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将待提取的孕马原血浆放入容器内，在搅动的同时加入0.5当量的偏磷酸至pH值为3.5，滤过，取上清液； (2)调节上清液的pH值为5.8，然后将上清液通入截留2万分子量的中空纤维柱进行切向流超滤，得到收集液，至收集液的蛋白浓度为5.0mg/ml时终止； (3)将步骤(2)得到的收集液加入浓度为95%的冷乙醇至终浓度35%，pH值为5.3，以4000rpm进行离心，得到沉渣和上清液i，收集上清液i并暂放O?5°C的环境下；在离心后得到的沉渣中加入35%的缓冲酒精进行搅拌溶解，再以4000rpm进行离心，得到上清液ii，合并上清液i和上清液? ； (4)步骤(3)合并后得到的上清液中加入浓度为95%的乙醇，二者混合后终浓度为75%，调节pH值为4.0，然后在O?5°C放置2小时以上，再以4000rpm进行离心，收集沉淀； (5)步骤(4)收集的沉淀用灭菌生理盐水进行稀释，调节pH值为6.0?7.0，通入小型超滤器内的截留分子量I万的TFF膜包，浓缩至所需体积，即得孕马血清促性腺激素。
2.根据权利要求1所述的一种应用切向流超滤技术制备孕马血清促性腺激素的方法，其特征在于所述步骤(3)中使用的缓冲酒精中的各组分配比为:8.1g醋酸钠、IN(当量)的冰醋酸40ml、160ml的水和75ml浓度为95%的乙醇。
3.根据权利要求1所述的一种应用切向流超滤技术制备孕马血清促性腺激素的方法，其特征在于所述步骤(3)中使用的缓冲酒精的配置方法为:将8.1g的醋酸钠溶于60ml水，再加入1N(当量)的冰醋酸40ml，搅拌的同时加入10ml水和浓度为95%乙醇75ml，充分搅拌后制得。
【专利摘要】本发明公开了一种应用切向流超滤技术制备孕马血清促性腺激素的方法，(1)将孕马原血浆加入偏磷酸，取上清液；(2)将上清液通入截留2万分子量的中空纤维柱进行切向流超滤，得到收集液；(3)收集液加入冷乙醇，得到上清液；(4)上清液中加入乙醇，离心后收集沉淀；(5)沉淀用灭菌生理盐水进行稀释，通入小型超滤器内的截留分子量1万的TFF膜包，浓缩即得。本发明提供的制备方法应用切向流超滤技术，浓缩的滤液体积可达10～20倍，大大降低了生产成本，缩短了生产周期，产品质量好。
【IPC分类】C07K14-59, C07K1-34
【公开号】CN104672321
【申请号】CN201510125422
【发明人】陈萸芳, 张京
【申请人】陈萸芳
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月20日