专利名称：一种安全快速提取茶树老叶片基因组dna的方法
技术领域：
本发明涉及的是ー种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法。
背景技术：
DNA分子标记技术是研究茶树起源、分子演化、遗传多祥性、品种鉴定的ー个重要工具。而进行这些研究的先决条件是高质量基因组DNA的提取。由于茶树叶片富含酚类物质，鲜叶中酚类物质含量可达干物质总量的18% 36%，且含有大量的生物碱及其它多种次生物质，这就给为DNA的提取带来了极大困难，如酚类物质可引起DNA降解、变色并影响后续分析，残存的多糖能抑制PCR反应。目前常见的茶树基因组DNA提取方法有SDS法及CTAB法，虽然这些方法可以成功 地从茶树幼叶、成熟叶片提取基因组DNA，但是这些提取方法通常使用有毒试剂氯仿/苯酚去除DNA上残留蛋白质及其他污染物，而且这些方法的操作步骤繁琐，耗时过长，通常在3小时以上。另外，由于茶树不同叶龄间次生代谢产物的异质程度都较高，导致了上述这些提取方法往往不能很好地应用于茶树老叶片基因组DNA提取，而且目前现有技术还没有专门针对茶树老叶片基因组DNA提取的方法的报道。因此，我们迫切地需要构建ー个安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在不适合老叶片、使用有毒试剂及耗时长的缺点和不足，针对茶树老叶富含多酚、多糖的特点，提供ー种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法。本发明的技术方案如下ー种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法，包括以下步骤(I)将O. 3g茶树叶片于液氮研磨至粉末状，再加入800 μ L预热DNA提取缓冲液，摇匀后于65°C水浴30min ;所述DNA提取缓冲液由I. 5% (w/v) SDS (pH 5. 5), IOOmmol/LTris-HCl (ρΗ8· O)，40mmol/L EDTA (ρΗ8· 0)，lmol/L NaCl，2· 5% PVP, IOmmoI/L β -巯基こ醇组成；所述茶树叶片为新鮮的茶树老叶片；(2)加入 125 μ L 5mol/LKAC,摇匀后冰浴 20min ；(3)待反应充分后，I. 2 X 10Vmin离心3min，将上清液加入吸附柱中并装入收集管，I. 2X 104r/min 离心 Imin ；(4)将上述收集管中滤液再次加入吸附柱中并装入收集管，1.2X104r/min离心lmin，弃废液；(5)向吸附柱加入800 μ L的70%こ醇，I. 2X 104r/min离心lmin,弃废液;(6)再次加入800 μ L的70%こ醇，I. 2 X 104r/min离心lmin,弃废液；(7)重新将吸附柱装入收集管中，I. 2X 104r/min离心3min，除去剩余こ醇；(8)取出吸附柱，于50°C放置5min ；
(9)将吸附柱放入新离心管中，加入60 μ L TE，于40°C放置5min，l. 2X104r/min离心3min ;离心管中液体为提取的茶树基因组DNA。所述的方法，步骤(I)中，液氮研磨后迅速加入DNA提取缓冲液。茶树老叶富含次生代谢物质，如酚类物质可引起DNA降解、变色并影响后续分析，残存的多糖能抑制PCR反应。为了消除这些影响，采取以下做法①改变DNA提取缓冲液组成，加入2. 5% PVPUOmmoI/L β -巯基こ醇来防止茶树叶片中的多酚化合物氧化褐变，カロΛ lmol/L NaCl来增加提取液中DNA的含量；②在裂解后，加入5mol/L KAC去除大量多糖；③采用吸附柱特异结合DNA来纯化所提DNA，进ー步控制了所提DNA溶液中的多糖含量及防止酚类物质进入所提DNA溶液。因此，本发明的方法可以从茶树老叶片提取高质量的基因组DNA，满足后续的PCR分析。(I)本发明可以从新鮮茶树老叶片提取高质量的基因组DNA。(2)与已有的SDS、CTAB法相比，本发明可以通过特异性结合DNA的吸附柱纯化
DNA,消除有毒有害试剂酚/氯仿的使用，保护操作人员的身体安全。(3)与已有的SDS、CTAB法相比，本发明可以快速提取茶树叶片基因组DNA，用时短，在2小时内可以完成，而已有方法用时3 4小吋。
图I为采用本发明方法提取茶树老叶片DNA的电泳图。图2为采用本发明方法提取茶树老叶片DNA的RAPD电泳图。图3为采用本发明方法提取的茶树老叶片DNA的ISSR电泳图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。I材料与方法I)材料新鮮的茶树老叶片采自种植在四川农业大学、省级名山良种场内12个茶树栽培品种(系)，分别为安吉白茶、青心乌龙、古蔺牛皮茶、乌牛早、蜀永307、南江4号、福鼎大白茶、黔湄502、龙井43、蒙山11号、铁观音及英红2号。2) DNA提取方法取将O. 3g茶树老叶片，加液氮没过叶片表面，研磨至粉末状，置于I. 5mL离心管中，再立即加入800 μ L预热DNA提取缓冲液(DNA提取缓冲液由1.5% (W/V) SDS (ρΗ5. 5)，IOOmmoI/L Tris-HCl(ρΗ8. O),40mmol/L EDTA(ρΗ8· 0)，lmol/L NaCl,2. 5 % PVP，IOmmol/L β-巯基こ醇组成)，摇匀后于65°C水浴30min ;加入125yL 5mol/LKAC，摇匀后冰浴20min ;待反应充分后，I. 2X 104r/min离心3min，将上清液加入吸附柱中并装入收集管，I. 2X104r/min离心Imin ;将上述收集管中滤液再次加入吸附柱中并装入收集管，
I.2 X 104r/min 离心 lmin,弃废液;向吸附柱加入 800 μ L 的 70% (V/V)こ醇，I. 2 X 104r/min离心lmin,弃废液。;再次加入800 μ L的70% (V/V)こ醇,I. 2X 104r/min离心lmin,弃废液；重新将吸附柱装入收集管中，12000r/min离心3min，除去剰余こ醇；取出吸附柱，于50°C放置5min ;将吸附柱放入I. 5mL新离心管中，加入60 μ L TE，于40°C放置5min，I. 2X104r/min离心3min。离心管中液体为提取的茶树老叶片基因组DNA。 3) DNA纯度、得率及电泳分析测定茶树老叶片DNA在260nm、280nm的光密度值，并分别通过A26tl、A26(I/A28(I来计算所提DNA的纯度及得率。所提取DNA在O. 8%琼脂糖凝胶上电泳。4) PCR扩增及电泳分析(I) RAPD-PCR 扩增PCR反应体系为25yL，其中包括2ng/yL DNA，O. 2 μ mol/L引物(引物序列为ACCGCGAAGG)，2 X Taq PCR MasterMix(TIANGEN) PCR 扩增程序为94°C预变性 5min，然后41个循环(94°C变性50s，36°C退火40s，72°C延伸90s)，最后72°C延伸7min。(2) ISSR-PCR 扩增 PCR反应体系为25 μ L，其中包括IOng DNA, O. 6 μ mol/L引物(引物序列为CTCTCTCTCTCTCTCTCTGG)，2 X Taq PCR MasterMix (TIANGEN)。PCR 扩增程序为94°C预变性5min，然后41个循环(94°C变性45s，45°C退火lmin，72°C延伸lmin)，最后72°C延伸7min。RAPD扩增产物、ISSR扩增产物在2. 5%琼脂糖凝胶上电泳。2、结果与分析I)茶树老叶片DNA纯度及得率采用本发明方法提取的茶树老叶片DNA的A260ZA280比值在I. 61 I. 86之间，得率在34. 18 μ g/g 59. 98 μ g/g之间，表明所提取DNA纯度及产量较高，见表I。采用本发明方法提取的茶树老叶片DNA的的分子量大小约为23kb，条带清晰、完整，而且无可见DNA降解或RNA污染，见图I。表I 12个茶树品种(系)老叶片DNA的得率及纯度
权利要求
1.ー种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)将茶树叶片于液氮研磨至粉末状，再加入800μ L预热DNA提取缓冲液，摇匀后于 65 °C 水浴 30min ;所述 DNA 提取缓冲液由 I. 5 % (w/v) SDS (pH 5. 5)，IOOmmoI/LTris-HCl (pH8. O), 40mmol/L EDTA(ρΗ8· 0)，lmol/L NaCl,2. 5% PVP, lOmmol/L β-巯基こ醇组成；所述茶树叶片为新鮮的茶树老叶片；(2)加入125 μ L 5mol/LKAC，摇匀后冰浴 20min ； (3)待反应充分后，I.2X 10Vmin离心3min，将上清液加入吸附柱中并装入收集管，I. 2 X 104r/min 离心 Imin ； (4)将上述收集管中滤液再次加入吸附柱中并装入收集管，I.2XlOVmin离心lmin，弃废液； (5)向吸附柱加入800μ L的70%こ醇，I. 2Χ 104r/min离心lmin,弃废液； (6)再次加入800μ L的70%こ醇，I. 2 X 104r/min离心lmin,弃废液； (7)重新将吸附柱装入收集管中，I.2XlOVmin离心3min，除去剰余こ醇； (8)取出吸附柱，于50°C放置5min； (9)将吸附柱放入新离心管中，加入60μ L TE，于4(rC放置5min，1.2X104r/min离心3min ;离心管中液体为提取的茶树基因组DNA。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，液氮研磨后迅速加入DNA提取缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种安全快速提取茶树老叶片基因组DNA的方法，包括以下步骤将茶树叶片于液氮研磨至粉末状，再加入800μL预热DNA提取缓冲液，摇匀后于65℃水浴30min；加入125μL 5mol/LKAC，摇匀后冰浴20min；待反应充分后，离心3min，将上清液加入吸附柱中并装入收集管，离心1min；将上述收集管中滤液再次加入吸附柱中并装入收集管，离心1min，弃废液；向吸附柱加入800μL的70％乙醇，离心1min，弃废液；再次加入800μL的70％乙醇，离心1min，弃废液；重新将吸附柱装入收集管中，离心3min，除去剩余乙醇；取出吸附柱，于50℃放置5min；将吸附柱放入新离心管中，加入60μL TE，于40℃放置5min，离心3min；离心管中液体为提取的茶树基因组DNA。安全、快速提取茶树叶片基因组DNA。
文档编号C12N15/10GK102796733SQ20121030375
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月24日 优先权日2012年8月24日
发明者齐桂年, 陈盛相, 李成磊 申请人:四川农业大学, 齐桂年