专利名称：酶法合成5-羟基色氨酸的方法
技术领域：
本发明属于生物技术生产氨基酸的技术领域，涉及通过色氨酸酶催化5-羟基吲哚和L-半胱氨酸合成L-5-羟基色氨酸的方法。
背景技术：
5-羟基色氨酸(又名L-5-羟基色氨酸，简称5-HTP)是ー种天然芳香族氨基酸，是人体内重要的神经递质5-羟色胺的前体，5-羟色胺是脑部分泌的一种荷尔蒙，会影响我们的情緒、睡眠和食欲，造成脑中的血清素不平衡时需5-HTP来維持身体处于正常状态。现代医学已经证明5-HTP具有多种明显的药理作用，包括控制情緒、減少焦虑、治疗抑郁症；改善睡眠；减弱食欲，治疗肥胖；治疗纤维性肌痛综合征；缓解慢行头痛等症状。5-HTP已在医 药和保健食品行业得到了广泛的应用。在欧美5-HTP已成为最重要的抗抑郁补剂和非处方药物。目前，5-HTP生产方法主要包括(I)提取法，是从豆科植物如加纳籽(专利CN101648900)中提取。该エ艺是目前5-HTP生产的主流エ艺，条件稳定，产品纯度高。但是，原料加纳籽的产量和采收期决定了该エ艺的生产成本，而且近年来随着非洲地区原料采收成本的逐年走高，导致5-HTP的价格居高不下。(2)化学合成法，是以色氨酸和羟基こ酸为原料，在高压反应釜中进行化学羟化反应得到多羟基色氨酸，然后在催化剂色氨酸酶的作用下，在碱性条件下水解最終得到5-HTP。该エ艺反应复杂、反应条件严格、能耗巨大，且产物5-HTP的产量不稳定，因此一直未能扩大生产。(3)生物转化法，是以微生物细胞或从生物体中提取的酶作为生物催化剂，利用酶的专ー性制备5-HTP，具有反应条件温和、反应速度快和专ー性强等优点。传统的酶法是以色氨酸羟化酶作为催化剂，以色氨酸为底物，特异性地生成5-HTP。国内外已有报道对动物体内色氨酸羟化酶基因克隆并測定DNA序列和蛋白序列。继而，在CDNA文库中筛选相应的基因序列并利用成熟的质粒转化方法将该基因导入工程菌株进行大規模发酵生产，将体外获得的色氨酸羟化酶用于5-HTP生产。国内专利CN101864466利用已有报道的家兔Oryctolagus cuniculus色氨酸轻化酶基因构建重组表达载体,通过质粒转化BL21获得エ程菌株，利用该菌株进ー步发酵，在发酵成熟期添加底物色氨酸获得终产物5-HTP。色氨酸酶,也称色氨酸卩引哚裂和酶(tryptophanase, EC4. I. 99. I),是由含有ー个磷酸吡哆醛结合位点的相同亚基组成的四聚体，该四聚体在NH4+、K+或Rb+存在下具有催化活性，但活性受Na+和Li+抑制。该酶在微生物中特别是大肠杆菌中有大量存在，主要催化色氨酸厌氧分解产生吲哚、丙酮酸和氨，对半胱氨酸和丝氨酸已有一定作用。中国专利(申请号CN201010031351. 0)采用重组枯草芽孢杆菌高效表达色氨酸酶，用于酶法拆分DL-半胱氨酸制备D-胱氨酸和L-色氨酸。目前，还未见该酶用于制备5-HTP的报道。
发明内容
本发明的目的是提供ー种新的酶法合成5-羟基色氨酸(5-HTP)的方法，该方法以色氨酸酶为催化剂，以5-羟基吲哚和L-半胱氨酸为底物，エ艺简単、环保无污染。本发明提供的酶法合成5-羟基色氨酸(5-HTP)的方法包括以表达色氨酸酶的大肠杆菌基因工程重组菌BL21 (DE3)-pET21a(+)-tnaA的发酵菌体细胞或裂解液或枯草芽孢杆菌基因工程重组菌WB600-pWB980-tnaA的发酵液为酶源，以5-羟基吲哚和L-半胱氨酸为底物，酶促反应液中，底物5-羟基吲哚的加入量为5至20g/L，L-半胱氨酸的加入量为6至24g/L，酶源的添加量为2000至8000U/L，在40至60°C下，pH7至9，经酶法转化反应3至12h，生产5-HTP。酶促反应液中还包括辅酶磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的加入量为0. 005至 0.02g/L。底物5-羟基吲哚的用量优选为15g/L，底物L-半胱氨酸的用量优选为18g/L，酶源的添加量优选为6000U/L，磷酸吡哆醛的用量优选为0. 015g/L，优选转化温度为45°C，优选转化PH8，优选转化时间12h。所述的表达色氨酸酶的枯草芽孢杆菌基因工程重组菌WB600-pWB980-tnaA来自专利 CN201010011351. O。在本发明实施例中，采用高效液相色谱法来測定5-HTP的含量，具体方法如下高效液相色谱采用Agilent Z0RBASB-C18柱(250X4. 6mm, 5 u m)对5-HTP的含量进行测定，该液相条件为流动相A相为ImM/L磷酸ニ氢钾水溶液，B相为100%甲醇，O-IOmin时20%B-40%B, 10-20min 时 40%B_20%B，23min 时停止；进样量 IOy I ;总流速为 I. OmL/min ;检测波长225nm;柱温为25で。本发明的优点和有益效果本发明创新性地以5-羟基吲哚和L-半胱氨酸为底物，利用高效表达色氨酸酶的大肠杆菌基因工程菌的发酵菌体细胞/裂解液或枯草芽孢杆菌基因工程菌的发酵液为酶源，生产5-HTP，具有条件温和、周期短、酶促体系中杂质少、产物分离提取方便、エ艺步骤简单、操作安全等优点，为5-HTP的緑色生产提供了ー种新方法。
图I是反应机理；图2是5-HTP标准曲线；A :标准品5-HTP色谱图；B 5-HTP定量分析标准曲线；图3是催化条件的优化；A :反应温度与转化率的关系；B pH与转化率的关系；C :反应时间与转化率的关系；D :底物5-羟基吲哚与转化率的关系；E :L-半胱氨酸与转化率的关系；F:固定化酶与转化率的关系；G :磷酸吡哆醛与转化率的关系；图4是反应液中5-HTP和5-羟基吲哚的HPLC检测。
具体实施例方式实施例I枯草芽孢杆菌基因工程菌表达色氨酸酶的制备色氨酸酶基因工程菌株的发酵參见中国专利(申请号CN201010011351.0)。
下罐发酵液4°C下3，OOOrpm离心15min去除，得到表达色氨酸酶的上清液，测定酶活力为550U/mL。实施例2大肠杆菌基因工程菌表达色氨酸酶的制备根据NCBI数据库收录的E. coli K12的色氨酸酶基因序列(序列号NP418164)，设计上游引物tnaAl :5，-CCG GM TTC ATG GMAAC TTT AAA CAT CTC C_3，(SEQ ID No. 1)，下游引物 tnaA2 :5，_CCC AAG CTT TTA AAC TTC TTT CAG TTT TGC GG_3，(SEQ ID No. 2)。提取E. coli JM109菌株的基因组DNA，PCR扩增色氨酸酶基因。采用基因工程方法，构建重组表达质粒pET_21a(+)_tnaA。将重组表达载体pET_21a(+)_tnaA转化至E. coli BL21 (DE3),获得基因工程菌株 BL21 (DE3) -pET21a (+) -tnaA。将阳性重组菌株接种于4mL含有氨苄青霉素100 U g/mL的LB培养基中过夜培养，随后以1%转接量接入IOOmL含有氨苄青霉素100 u g/mL的新鲜LB培养基中，37°C振荡培养3h，然后，加入终浓度为ImM的IPTG诱导液，特异性诱导色氨酸酶的表达。 所得培养液于4°C下6，OOOrpm离心lOmin，收集菌体，获得表达色氨酸酶的基因エ程重组菌，用50mmol/L的磷酸缓冲液(pH8. 0)悬浮洗涤后再离心，收集发酵菌体作为酶源，测定酶活力为1000U/g。将发酵菌体进行超声波破碎，获得色氨酸酶的粗酶液，测定酶活力为200U/mL。实施例3HPLC法测定5-HTP高效液相色谱采用Agilent ZORBA SB-C18 柱(250 X 4. 6mm, 5 y m)对 5-HTP 的含量进行測定，该液相条件为流动相A相为ImM/L磷酸ニ氢钾水溶液，B相为100%甲醇，O-IOmin 时 20%B-40%B, 10_20min 时 40%B-20%B, 23min 时停止；进样量 10 y I ;总流速为
I.OmL/min ;检测波长225nm ;柱温为25°C。精确配制系列浓度的5-HTP标准液，连续进样5次，计算峰面积并取平均值，以5-HTP浓度(X，mmol/L)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。酶促反应所产生的5-HTP经适当稀释后以HPLC測定，依据标准曲线进行精确定量，如图2。实施例4考察色氨酸酶法合成5-HTP中，反应温度与5_羟基吲哚的转化率的关系以上述实施例I或实施例2中制备的色氨酸酶为催化剂，分别在每升的转化体系中，加入酶量5000U/L，底物5-羟基吲哚5g/L，L-半胱氨酸用量6g/L，辅酶磷酸吡哆醛0. 005g/L，转化pH值为8，转化时间6h。考察转化温度40-60°C时对5-羟基吲哚转化率的影响，采用实施例2中的方法检测5-HTP的含量。结果如图3A所示。实施例5考察色氨酸酶法合成5-HTP中，反应pH值与5_羟基吲哚的转化率的关系以上述实施例I或实施例2中制备的色氨酸酶为催化剂，分别在每升的转化体系中，加入酶量5000U/L，底物5-羟基吲哚5g/L，L-半胱氨酸用量6g/L，辅酶磷酸吡哆醛0. 005g/L,转化温度为45°C，转化时间6h。考察转化pH值7-9时对5-羟基吲哚转化率的影响，采用实施例2中的方法检测5-HTP的含量。结果如图3B所示。实施例6考察色氨酸酶法合成5-HTP中，反应时间与5_羟基吲哚的转化率的关系以上述实施例I或实施例2中制备的色氨酸酶为催化剂，分别在每升的转化体系中，加入酶量5000U/L，底物5-羟基吲哚5g/L，L-半胱氨酸用量6g/L，辅酶磷酸吡哆醛0. 005g/L,转化温度为45°C，转化pH值为8。考察转化时间3_12h时对5-羟基吲哚转化率的影响，采用实施例2中的方法检测5-HTP的含量。结果如图3C所示。实施例7考察色氨酸酶法合成5-HTP中，底物5_羟基吲哚的投入量与5_羟基吲哚的转化率的关系以上述实施例I或实施例2中制备的色氨酸酶为催化剂，分别在每升的转化体系中，加入酶量5000U/L，L-半胱氨酸用量24g/L，辅酶磷酸吡哆醛0. 005g/L，转化温度为450C，转化pH值为8，转化时间12h。考察底物5-羟基吲哚的投入量为5-20g/L时对5-羟基吲哚转化率的影响，采用实施例2中的方法检测5-HTP的含量。结果如图3D所示。实施例8考察色氨酸酶法合成5-HTP中，L-半胱氨酸的投入量与5_羟基吲哚的转化率的关系以上述实施例I或实施例2中制备的色氨酸酶为催化剂，分别在每升的转化体系中，加入酶量5000U/L，5-羟基吲哚用量15g/L，辅酶磷酸吡哆醛0. 005g/L，转化温度为 45°C，转化pH值为8，转化时间12h。考察L-半胱氨酸的投入量为6-24g/L时对5-羟基吲哚转化率的影响，采用实施例2中的方法检测5-HTP的含量。结果如图3E所示。实施例9考察色氨酸酶法合成5-HTP中，酶量与5_羟基吲哚的转化率的关系以上述实施例I或实施例2中制备的色氨酸酶为催化剂，分别在每升的转化体系中，5-羟基吲哚用量20g/L，L-半胱氨酸用量为24g/L，辅酶磷酸吡哆醛0. 02g/L，转化温度为45°C，转化pH值为8，转化时间12h。考察酶量为2000-8000U/L时对5-羟基吲哚转化率的影响，采用实施例2中的方法检测5-HTP的含量。结果如图3F所示。实施例10考察色氨酸酶法合成5-HTP中，磷酸吡哆醛的浓度与5-羟基吲哚的转化率的关系以上述实施例I或实施例2中制备的色氨酸酶为催化剂，分别在每升的转化体系中，加入酶量8000U/L，底物5-羟基吲哚20g/L，L-半胱氨酸用量24g/L，转化温度为45°C，转化PH值为8，转化时间12h。考察磷酸吡哆醛的浓度为0. 005-0. 02g/L时对5-羟基吲哚转化率的影响，采用实施例2中的方法检测5-HTP的含量。结果如图3G所示。从以上结果可见，以磷酸吡哆醛0.005-0.02g/L，* 40-60°C，pH值为7_9，酶量2000-8000U/L，反应3-12h，色氨酸酶可以催化底物5-羟基吲哚和L-半胱氨酸生产5-HTP。同时，优选的转化条件为5_羟基吲哚15g/L，L-半胱氨酸18g/L，磷酸吡哆醛0. 015g/L，酶量6000U/L，反应温度45°C，pH值8，反应时间12h。在该优选条件下进行验证实验，5-羟基吲哚的转化率为73. 4% (见图4)。
权利要求
1.一种色氨酸酶催化5-羟基吲哚和L-半胱氨酸合成5-羟基色氨酸的方法，其特征在于该方法以色氨酸酶为酶源，以5-羟基吲哚和L-半胱氨酸为底物，酶促反应液中，底物5-羟基吲哚的加入量为5至20g/L，L-半胱氨酸的加入量为6至24g/L，酶源的添加量为2000至8000U/L，在40至60°C下，pH7至9，经酶法转化反应3h至12h，生产L-5-羟基色氨酸。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的色氨酸酶来自大肠杆菌基因工程重组菌BL21 (DE3)-pET21a(+)-tnaA的发酵菌体细胞或裂解液，或枯草芽孢杆菌基因工程菌 WB600-pWB980-tnaA 的发酵液。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于酶促反应液中还包括辅酶磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的加入量为O. 005至O. 02g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于辅酶磷酸吡哆醛的用量优选为O.015g/L。
5.根据权利要求I至4中任一项所述的方法，其特征在于酶促反应液中，底物5-羟基吲哚的用量优选为15g/L，底物L-半胱氨酸的用量优选为18g/L，酶源的添加量优选为6000U/L,，优选转化温度为45°C，优选转化pH8，优选转化时间12h。
全文摘要
一种新的利用色氨酸酶催化5-羟基吲哚和L-半胱氨酸合成L-5-羟基色氨酸的方法。本发明创新性地利用色氨酸酶作为酶源，以5-羟基吲哚和L-半胱氨酸为底物，经酶促反应生成L-5-羟基色氨酸。所述的色氨酸酶来自大肠杆菌基因工程重组菌BL21(DE3)-pET21a(+)-tnaA的发酵菌体细胞或裂解液，或枯草芽孢杆菌基因工程菌WB600-pWB980-tnaA的发酵液。本发明提供了一种新的L-5-羟基色氨酸的绿色生产工艺路线。
文档编号C12P13/04GK102808008SQ20121030342
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者高智慧, 丁国钰 申请人:天津启仁医药科技有限公司