专利名称：利用编码花色苷3′位芳香族酰基转移酶的基因的花色苷色素稳定化和蓝化方法
技术领域：
本发明涉及下述使花色苷变得更蓝且更稳定的方法，其利用使芳香族酰基转移到花色苷3'位上的酶或编码该酶的基因，其可在花色苷色素的改变和稳定化、进而在花色的改变和稳定化上得到利用。更具体而言，涉及利用来自以龙胆(Gentiana triflora var.japonica)为代表的植物的花色苷3'位芳香族酰基转移酶或编码该酶的cDNA使花色呈现蓝色并稳定化的方法。此外，本发明还涉及下述使花色苷变得更蓝且更稳定的方法，其利用具有使芳香 族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的单一酶或编码该酶的基因，其可在花色苷色素的改变和稳定化、进而在花色的改变和稳定化上得到利用。
背景技术：
花卉产业致力于各种新品种的开发。改变花色作为培育新品种的有效方法之一，利用传统的育种方法，几乎在所有的商业品种中均培育出呈现各种花色的品种。但是，在以往的育种方法中，因各个种的基因库受到限制，所以单一种具有广泛花色品种的情况很罕见。花色主要来源于两类色素，即类黄酮和类胡萝卜素。类黄酮主要呈现从黄色到红色或蓝色的较广范围花色，而类胡萝卜素主要呈现橙色或黄色的色调。类黄酮中主要控制花色的是总称为花色苷的一类化合物。花色苷的发色团是花色素，主要的花色素有花葵素、花青素、花翠素。已知植物中存在多种花色苷，其多样性是花色多样性的原因之一。已鉴定出数百种花色苷的结构，几乎所有花色苷的3位轻基均被糖修饰(Harbone, in TheFlavonoids:565, 1986)0关于花色苷的生物合成途径，到3位糖苷化合物的生物合成为止，在几乎所有的种子植物中均相同(Holton et al.，Plant Cell7:1071，1995)，之后，进行种和品种特异性糖苷化、酰化、甲基化等各种修饰。品种的修饰类型的不同是花色苷多样性即花色五颜六色的原因之一。通常，修饰花色苷的芳香族酰基越多，花色苷越稳定、越蓝(Harbone，inThe Flavonoids:565, 1986 ;齐藤规夫，蛋白质核酸酶(日文原文蛋白質核酸酵素)47 202，2002)。此外，上述花色苷与金属的复合物的形成、黄酮醇和黄酮等类黄酮化合物的共色效应(co-pigmentation)、局部存在花色苷的液泡的pH等均对花色产生影响(Forkmann, Plant Breeding 106:1,1991)。关于包含花色素的类黄酮的生物合成，正处于详细研究阶段。参与花色苷合成的酶的基因已全部被克隆，它们的转录因子的基因也已获得。因此，通过人为改变这些基因的表达，可以改变花中积累的类黄酮的结构和量，改变花色。
通过分子生物学方法和向植物导入基因来改变花色苷结构、改变花色的例子已见诸报道(Forkmann G&Martens S (2001). Curr Opin. Biotechnolgy, 12:155-160TanakaY&Mason J(2003)In:Singh RP&Jaiwal PK(ed.)Plant genetic engineering, pp 361-385.SCI tech publishing, Houston)。作为使花色呈现蓝色的方法之一，可以考虑增加花色苷B环的羟基数。催化花色苷3'位羟化反应的酶(类黄酮3'-羟化酶F3' H)和催化花色苷3'位和5’位羟化反应的酶(类黄酮3'，5’_羟化酶F3' 5’H)在改变花色上很重要。大体而言，花葵素(B环有一个羟基)多存在于橙色到红色的花中，花青素(B环有两个羟基)多存在于红色到深红色的花中，花翠素(B环有三个羟基)多存在于紫色到蓝色的花中。多数情况下，没有紫色到蓝色品种的植物种欠缺产生花翠素的能力，其代表例子有月季、菊花、康乃馨。对从上述植物中通过生物工程培育紫色到蓝色的品种，一直以来备受关注。实际上，通过使产生花翠素所必须的F3' 5’H基因表达，已培育出花色呈蓝紫色的康乃馨(Tanaka Y&Mason J(2003)In:Singh RP&Jaiwal PK(ed.)Plant genetic engineering, pp 361-385. SCI tech publishing, Houston)，虽然可在花瓣中产生花翠素，但花色并非纯蓝色。即，为了使花色呈现纯正的蓝色，仅导入F 3' 5’H基因并不充分，还需进一步研究。实际上，蓝色花中含有的花色苷，大多通过糖被芳香族酰基修饰(Honda&SaitoHeterocycles 56:633(2002))。因此，作为使花色更蓝的方法之一，可以考虑通过咖啡酰基、香豆酰基、芥子酰基等芳香族酰基修饰花色苷(Tanaka&Mason (2003)In: Singh RP&Jaiwal PK(ed. ) Plant genetic engineering.pp 361-385.SCI techpublishing, Houston)。通常，花色苷因糖苷化而稍稍变红，通过糖与芳香族酰基结合的花色苷，其颜色变蓝(Forkmann, Plant Breeding 106:1,1991)。此外，花色苷在中性溶液中是不稳定的化合物，但通过糖、酰基的修饰，稳定性提高(Forkmann, Plant Breeding 106:1,1991)。由利用牵牛花(Pharbitis nil)花色苷的实验可知,酰化后的花色苷中，通过葡萄糖与芳香族酰基例如与香豆酸、咖啡酸连接的花色苷，其最大吸收向长波长方向移动(Dangle etal.Phytochemistry 34 :1119,1993)。关于与芳香族酰基结合的花色苷，以来自鸭妬草(Commelina communis)的Awobanin (Go to and Kondo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:17, 1991)为代表，来源于自然界的诸多分离例(Honda&Saito Heterocycles 56:633 (2002))已见诸报道。例如，关于蓝色花的花色苷，以Cinerarin (来自瓜叶菊)、Gentiodelphin (来自龙胆)、Heavenly blueanthocyanin (来自牵牛花)、Ternatin (来自蝶豆)、Lobelinin (来自山梗菜)等为代表,具有多个芳香族酰基。据报道，来自瓜叶菊(Seneciocruentus)的 Cinerarin (Goto etal.，Tetrahedron 25:6021, 1984)具有I个脂肪族酰基和3个芳香族酰基，这些芳香族酰基有助于中性水溶液中色素的稳定化(Goto et al. , Tetrahedron 25:6021,1984)。此外，作为龙胆花瓣主要色素的Gentiodelphin (DEL 3G_5CafG_3’ CafG),以花翠素3位糖苷化合物为基本骨架，在5位和3'位的羟基上具有由I分子葡萄糖和I分子咖啡酸形成的侧链。据报道，上述5位和3，位的糖-酰基侧链形成三明治式分子内堆积，在水溶液中，色素稳定化(Yoshida et al. Tetrahedron 48 :4313, 1992)。还证实2 条糖-芳香族酰基侧链中，3'位的糖_芳香族酰基比5位更有助于色素的稳定化、蓝化(Yoshida et al. Phytochemistry54:85，2000)。芳香族酰基转移反应于1980年在石竹科植物Silene (Kamsteeg et al. , Biochem.Physiol. Pflanzen 175:403, 1980)中首先发现，在Matthiola的可溶性酶组分中也发现同样的芳香族酰基转移酶活性(Teusch et al. , Phytochemistry 26:991,1986)。之后，从龙胆分离出使咖啡酸、香豆酸等芳香族酰基转移到花色苷5位糖上的花色苷5位芳香族酸基转移酶(以下称 5AT) (Fujiwara et al.，Eur. J. Biochem. 249，45，1997),基于精制后的酶的内部氨基酸序列信息，分离出编码龙胆5AT的cDNA (Fujiwara et al.，PlantJ.，16，421，1998)。基于该基因，从蝴蝶草(W02005/017147)分离出同源物，进而，基于这些酶中保留的氨基酸序列，分离出编码使芳香族酰基转移到花色苷3位糖上的酶(3AT)的紫苏的cDNA(Yonekura-Sakakibara et al. , Plant Cell Physiol 41:495,2000)。利用紫苏 3AT 基因，从同为紫苏科的薰衣草中克隆得到3AT基因(W096/25500)。 从矮牵牛花中得到使酰基转移到花色素-3-芸香糖苷上的酶基因(日本特表2003-528603)。将紫苏3AT基因或蝴蝶草5AT基因导入月季后，在花瓣中产生3位或5位与芳香族酰基结合的花色苷，但并未使花色显著变蓝，仅最大吸收值向长波长移动了 l_2nm左右。究其原因，可认为如吉田等的报告(Yoshidaet al. Tetrahedron48 :4313, 1992)中所述，仅3位、5位等A环或C环酰化，效果并不理想，对于花色苷的蓝化、稳定化而言，3'位的酰化成为必须，更优选包括3'位在内的多个位置酰化。实际上，因存在3'位糖与芳香族酰基连接的花色苷，可推测存在对3,位糖上的芳香族酰基转移反应进行催化的酶(3; AT)。但迄今为止，3' AT的反应还未被测定，3' AT酶或编码:V AT的基因也未被克隆。迄今为止所报道的酰基转移酶均为作用于花色苷3位或5位的酶，反应的部位特异性高(Fujiwara et al. Plant J. , 16, 421, 1998, Yonekura-Sakakibara et al. , PlantCell Physiol. 41，495，2000)。因此认为不能用已知的芳香族酰基转移酶进行3'位的酰化。而且，至今还没有关于具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置上的活性的芳香族酰基转移酶的报道。因此，以现有的技术水平，例如，制备基因重组植物、在花色苷的3'位、乃至包含3,位在内的多个位置的糖上转移芳香族酰基是不可能的。即，很难通过在花色苷的3'位、乃至包含3,位在内的多个位置糖上结合芳香族酰基的方法使花色苷更蓝、更稳定、进而使花色更蓝、更稳定。专利文献1W096/25500专利文献2W02005/017147专利文献3日本特表2003-528603非专利文献I Harbone, in The Flavonoids: 565, 1986非专利文献2 Holton et al. , Plant Cell 7:1071, 1995非专利文献3 Harbone, in The Flavonoids: 565, 1986非专利文献4齐藤规夫、蛋白质核酸酶(日文原文蛋白質核酸酵素)47:202, 2002非专利文献5 Forkmann, Plant Breeding 106:1,1991
非专利文献6 Forkmann G&Martens S (2001) . Curr Op in.Biotechnolgy, 12:155-160非专利文献7 Tanaka Y&Mason J (2003) In: Singh RP&Jaiwal PK (ed. ) Plantgenetic engineering, pp 361-385. SCI tech publishing, Houston非专利文献8 Honda&Saito Heterocycles 56:633 (2002)非专利文献9 Forkmann, Plant Breeding 106:1,1991非专利文献10 Dangle et al. Phytochemistry 34 :1119, 1993非专利文献11 Goto et al. , Tetrahedron 25:6021, 1984非专利文献12 Yoshida et al. Tetrahedron 48 :4313, 1992
非专利文献13 Yoshida et al. Phytochemistry 54:85, 2000非专利文献14 Goto and Kondo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:17, 1991非专利文献15 Kamsteeg et al. , Biochem. Physiol. Pf lanzenl75:403, 1980非专利文献16 Teusch et al. , Phytochemistry 26:991, 1986非专利文献17 Fujiwara et al. , Eur. J. Biochem. 249, 45, 1997非专利文献18 Fujiwara et al. , Plant J. , 16, 421, 1998非专利文献19 Yonekura-Sakakibara et al. , Plant CellPhysiol 41:495, 2000
发明内容
如上述Yoshida等的报告所述，花色苷的芳香族酰基有助于花色苷的稳定化和蓝化，特别是3'位的糖-酰基侧链比5位的糖-酰基侧链的作用更大。而且，包含3'位在内的多个位置的糖-酰基侧链使花色苷更蓝更稳定。因此，若利用使芳香族酰基转移到花色苷3'位或包含3'位在内的多个糖的位置上的酶或编码该酶的基因，即可人为修饰花色苷，使花色苷变成更稳定的化合物，而且还可以使该花色苷更蓝。如上所述，为了使花色苷稳定化、蓝化，向3,位转移芳香族酰基是非常有效的方法。为此，至今为止未报道的花色苷3'位芳香族酰基转移酶或编码该酶的基因不可缺少。发明者等对从龙胆分离的花色苷5位芳香族酰基转移酶的酶学性质进行了详细研究，结果发现龙胆的5位芳香族酰基转移酶具有3'酰基转移活性。即，该酶虽然是单一酶，但催化在花色苷5位和3,位这两个位置的糖上分别转移芳香族酰基的反应。因此，本发明提供通过向花色苷的3'位附加芳香族酰基从而使花色苷更蓝更稳定的方法。本发明还提供通过将编码该芳香族酰基转移酶的基因导入植物并表达，从而使花色更稳定更蓝的方法。因此，本发明提供(I)花色苷的3'位的酰化方法，其利用使芳香族酰基转移到花色苷3'位糖上的酶或编码该酶的基因。(2)本发明还提供花色苷的稳定化方法，其利用使芳香族酰基转移到花色苷3,位糖上的酶或编码该酶的基因。(3)本发明还提供花色苷的蓝化方法，其利用使芳香族酰基转移到花色苷3,位糖上的酶或编码该酶的基因。(4)本发明进一步提供目标色素的酰化方法，其使编码花色苷3'位芳香族酰基转移酶的基因在植物中表达，在该植物体内将目标色素酰化。
(5)本发明进一步提供目标色素的稳定化方法，其将编码花色苷3'位芳香族酰基转移酶的基因导入植物，在该植物体内目标色素酰化，从而使该色素稳定化。(6)本发明还提供目标色素的蓝化方法，其将编码花色苷3'位芳香族酰基转移酶的基因导入植物，在该植物体内目标色素酰化，从而使该色素蓝化。(7)本发明进一步提供通过上述(4) (6)任一项所述的方法得到的植物体、该植物体的营养繁殖体或种子、或与该植物体具有同一性质的该植物体后代的植物体、该植物体的营养繁殖体或种子。(8)本发明还提供在花色苷多个位置的糖上结合芳香族酰基的方法，其特征在于，利用具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的单一酶或编码该酶的基因。(9)本发明进一步提供花色苷的稳定化方法，其特征在于，利用具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的单一酶或编码该酶的基因。
0054](10)本发明还提供花色苷的蓝化方法，其特征在于，利用具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的单一酶或编码该酶的基因。(11)本发明进一步提供上述(8) (10)任一项所述的方法，其中，所述多个位置之一是花色苷的3,位的糖。( 12)本发明还提供目标色素的酰化方法，其使具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的单一酶或编码该酶的基因在植物中表达，在该植物体内将目标色素酰化。( 13)本发明还提供目标色素的稳定化方法，其将具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的单一酶或编码该酶的基因导入植物，在该植物体内目标色素酰化，从而使该色素稳定化。(14)本发明进一步提供目标色素的蓝化方法，其将具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的单一酶或编码该酶的基因导入植物，在该植物体内目标色素酰化，从而使该色素蓝化。(15)本发明还提供上述(12) (14)任一项所述的方法，其中，所述多个位置之一是花色苷的3,位的糖。(16)本发明进一步提供通过上述(12) (15)任一项所述的方法得到的植物体、该植物体的营养繁殖体或种子、或与该植物体具有同一性质的该植物体后代的植物体、该植物体的营养繁殖体或种子。(17)本发明还提供下述基因，所述基因是编码具有序列号4或6所述氨基酸序列且具有使芳香族酰基转移到花色苷3,位糖上的活性的蛋白质的基因、或是编码与该氨基酸序列具有70%以上的序列同一性且具有使芳香族酰基转移到花色苷3'位糖上的活性的蛋白质的基因、或是与序列号3或5所述核苷酸序列具有70%以上同一性且编码具有使芳香族酰基转移到花色苷3,位糖上的活性的蛋白质的基因。(18)本发明还提供下述基因，所述基因是编码具有序列号4或6所述氨基酸序列且具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的蛋白质的基因、或是编码与该氨基酸序列具有70%以上的序列同一性且具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的蛋白质的基因、或是与序列号3或5所述核苷酸序列具有70%以上同一性且编码具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的蛋白质的基因。
(19)本发明还提供上述(18)所述的基因，其中，所述多个位置之一是花色苷的 位的糖。(20)本发明还提供包含上述(17) (19)任一项所述基因的载体。(21)本发明还提供由上述(20 )所述的载体转化的宿主。(22)本发明还提供由上述(17) (19)任一项所述的基因所编码的蛋白质。(23)本发明进一步提供蛋白质的制造方法，其特征在于，培养上述(21)所述的宿主，或使其生长发育，然后从该宿主获取具有将糖转移到类黄酮3,位上的活性的蛋白质。(24)本发明还提供导入了上述(17) (19)任一项所述基因的植物或与其具有相同性质的该植物的后代或它们的组织。 (25)本发明进一步提供上述(24)所述植物的切花或与其具有相同性质的该植物后代的切花。(26)本发明还提供花色苷的3'位的酰化方法，其特征在于，利用上述(17)
(19)任一项所述的基因。(27)本发明还提供花色苷的稳定化方法，其特征在于，利用上述(17) (19)任一项所述的基因。(28)本发明还提供花色苷的蓝化方法，其特征在于，利用上述(17) (19)任一项所述的基因。(29)本发明进一步提供目标色素的酰化方法，其将上述(17) (19)任一项所述的基因在植物中表达，在该植物体内将目标色素酰化。(30)本发明还提供目标色素的稳定化方法，其将上述(17) (19)任一项所述的基因导入植物，在该植物体内目标色素酰化，从而使该色素稳定化。(31)本发明还提供目标色素的蓝化方法，其将上述(17) (19)任一项所述的基因导入植物，在该植物体内目标色素酰化，从而使该色素蓝化。(32)本发明进一步提供在花色苷多个位置的糖上结合芳香族酰基的方法，其特征在于，利用上述(17) (19)任一项所述的基因。(33)本发明进一步提供上述(32)所述的方法，其中，所述多个位置之一是花色苷的3'位的糖。
图I所示为本发明相关的花色苷类化合物的结构式、名称及简称。图2所示为本发明相关的花色苷类化合物的结构式、名称及简称。图3表示以50μΜ的DEL 3G-5G-3, G作为底物使用时反应产物经时变化的图表。图中，triG 表示 DEL 3G-5G-3 ' G、5Caf 表示 DEL3G_5CafG_3 ' G、3 ' Caf 表示 DEL3G-5G-3' CafG、5，3' Caf 表示 Gentiodelphin (DEL 3G_5CafG_3' CafG)0图4表示以ΙΟΟμΜ的DEL 3G-5G-3, G作为底物使用时反应产物经时变化的图表。图中，triG 表示 DEL 3G-5G-3 ' G、5Caf 表示 DEL3G_5CafG_3 ' G、3' Caf 表示 DEL3G-5G-3' CafG、5，3' Caf 表示 Gentiodelphin (DEL 3G_5CafG_3' CafG)0图5表示以200 μ M的DEL 3G-5G-3; G作为底物使用时反应产物经时变化的图表。图中，triG 表示 DEL 3G-5G-3 ' G、5Caf 表示 DEL3G_5CafG_3 ' G、3' Caf 表示 DEL3G-5G-3' CafG、5，3' Caf 表示 Gentiodelphin (DEL 3G_5CafG_3' CafG)D图6表示从龙胆花瓣部分精制的蛋白质的SDS-PAGE以及Western印迹的结果。左边为SDS-PAGE的结果，右边为使用了 GAT4抗体的Western印迹的结果。图中，M为分子量标记,Lanel为40 70%硫酸铵沉淀组分的结果,Lane2为经Dyematrix柱后的活性组分的结果。图7所示为采用了 Medio榨汁液的花色模拟结果。
具体实施例方式本说明书中对利用来自龙胆的花色苷3'位芳香族酰基转移酶或编码该酶的基因的方法进行说明，但所用的基因或该基因所编码的蛋白质不限于此。众所周知，具有经多个氨基酸添加、缺失或与其他氨基酸取代而修饰后的氨基酸序列的蛋白质，维持与原来的蛋 白质同等的酶活性。因此，只要保持对3'位糖的芳香族酰基转移活性，具有龙胆的该酶的 氨基酸序列经I个或多个氨基酸添加、缺失和/或与其他氨基酸取代而修饰后的氨基酸序列的蛋白质以及编码该蛋白质的基因的利用也属于本发明。本发明还包括编码下述蛋白质的基因，所述蛋白质具有与龙胆的花色苷3'位芳香族酰基转移酶的氨基酸序列、序列号4或6所述氨基酸序列有70%以上、优选90%以上同一性的氨基酸序列，且具有使芳香族酰基转移到花色苷3'位糖上的活性。此外，下述基因的利用也属于本发明，所述基因在5xSSC、50°C这样较温和的条件下与编码龙胆的3'位糖的芳香族酰基转移酶的DNA杂交，且编码具有3'位芳香族酰基转移活性的蛋白质。而且，下述基因的利用也属于本发明，所述基因在严谨条件下与编码龙胆的3'位芳香族酰基转移酶的DNA杂交，且编码具有3'位芳香族酰基转移活性的蛋白质。这里所述的严谨条件，例如指2xSSC、65°C，但杂交的条件根据探针所用的DNA的长度以及碱基组成而不同，因此，并不限于上述条件。通过上述杂交筛选的基因，可列举来自天然的基因，例如，来源于含有3'位与芳香族酰基结合的花色苷的植物，如蝶豆、山梗菜、瓜叶菊的基因，但不限于来源于植物。即，只要是编码具有花色苷3'位芳香族酰基转移活性的酶的基因，均可利用。此外，通过杂交筛选的基因，可以是cDNA，也可以是基因组DNA。而且，从山梗菜、蝶豆等含有3,位与芳香族酰基结合的花色苷的植物，采用该龙胆的酶的精制方法或局部改变后的方法，可精制3'位芳香族酰基转移酶。通过确定精制后的酶的氨基酸序列，可克隆编码该酶的基因。编码具有改变后的氨基酸序列的蛋白质的DNA，可采用公知的定点诱变法、PCR法来合成。例如，通过cDNA或基因组DNA的限制酶处理，得到欲改变氨基酸序列的DNA片段，以此为模板，采用与所需的氨基酸序列的改变对应的引物，实施定点诱变或PCR法，可以得到与所需的氨基酸序列的改变对应的DNA片段。之后，将导入了该改变的DNA片段与编码目标酶的其他部分的DNA片段连接即可。或者，为了得到编码由缩短后的氨基酸序列构成的酶的DNA，例如，将编码比目标氨基酸序列长的氨基酸序列、例如全长氨基酸序列的DNA通过所需的限制酶进行切割，当得到的DNA片段并非对目标氨基酸序列整体进行编码时，只要合成与缺失部分的氨基酸序列对应的DNA片段，连接即可。将按照上述方法得到的基因用大肠杆菌或酵母中的基因表达体系进行表达，通过测定该大肠杆菌或酵母的提取液中3'位芳香族酰基转移酶活性，可以确认所得基因对芳香族酰基转移酶进行编码。另外，还可以合成编码目标氨基酸序列的DNA。本发明还包括下述情况，即利用含有芳香族酰基转移酶基因的重组载体、特别是表达载体、以及从由该载体转化的宿主细胞中提取的芳香族酰基转移酶。作为宿主，可以使用原核生物或真核生物。作为原核生物，可以使用以往公知的宿主细胞，如细菌，例如埃希氏菌(Escherichia)属的细菌，如大肠杆菌(Escherichia coli),芽抱杆菌(Bacillus)属微生物，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。作为真核细胞，例如真核微生物，可优选使用酵母或丝状菌。作为酵母，可列举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母(Saccharomyces)属酵母，作为丝状菌，可列举米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)属微生物，以及青霉(Penicillium)属微生物等。此外，动物细胞或植物细胞也可以作为宿主细胞使用，作为动物细胞，可使用小鼠、仓鼠、猴、人等的细胞系。另外，昆虫细胞，例如蚕细胞，或蚕的成虫自身也可作为宿主使用。 作为表达载体，含有取决于其应导入的宿主的生物种类的启动子和终止子等表达调控区、以及复制起点等。作为细菌用、特别是大肠杆菌中的表达载体的启动子，可以使用以往公知的启动子，例如trc启动子、tac启动子、Iac启动子等。作为酵母用启动子，可以使用3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子、PH05启动子等，作为丝状菌用启动子，可以使用淀粉酶、trpC等的启动子，但并不限于上述启动子。另外，作为动物细胞用启动子，可以使用病毒性启动子，例如SV40早期启动子、SV40晚期启动子等。关于表达载体的制备，可以使用限制酶、连接酶等按照常法进行。表达载体对宿主细胞的转化也可以按照以往公知的方法进行。作为植物的表达载体，例如，当使用农杆菌时，可以采用PBI121等双元载体，当使用基因枪时，可以采用PUC19等大肠杆菌载体。此外，将经该表达载体转化后的植物细胞例如用抗生素抗性基因等标记基因进行筛选，在合适的植物激素等的条件下使其再分化，可得到转化后的植物体。将按照上述方法转化的宿主细胞或转化植物体进行培养或栽培，从培养物等按照常法、例如通过过滤、离心分离、细胞破碎、凝胶过滤色谱、离子交换色谱等，回收、精制花色苷3'位芳香族酰基转移酶，该酶的利用也属于本发明。以现有的技术水平，可以向植物导入基因，使该基因组成性或组织特异性表达，还可以通过反义法、共抑制法等抑制目标基因的表达。作为可转化的植物的例子，可列举月季、菊花、康乃馨、金鱼草、仙客来、兰花、土耳其桔梗、小苍兰、大丁草花、唐菖蒲、丝石竹、伽蓝菜、百合、天竺葵(Pelargonium)、Geranium、矮牵牛花、蝴蝶草、郁金香、稻、大麦、小麦、油菜子、马铃薯、西红柿、杨树、香蕉、蓝桉、番薯、大豆、紫花苜蓿、羽扇豆、玉米、花椰菜等，但并不限于这些。因此，本发明所提供的花色苷3'位芳香族酰化方法，不限于使用来自龙胆的酰基转移酶以及编码该酶的龙胆的cDNA或基因、将该cDNA或基因在大肠杆菌等宿主中表达而得到的重组酶，也可以广泛使用来自其他生物的花色苷3'位芳香族酰基转移酶、编码该酶的cDNA或基因、上述cDNA或基因在大肠杆菌等宿主中表达而得到的重组酶来代替。另外，在本说明书中包含花色苷的类黄酮的酰基转移反应中，作为酰基的供体，列举了 P-香豆酰CoA、咖啡酰CoA等CoA酯，但也可以利用P-香豆酰基、阿魏酰基或芥子酰基-1-0-葡萄糖之类轻基肉桂酰基-1-0-葡萄糖作为芳香族酰基的供体(Glassgen andSeitz, Planta 186:582, 1992)，因此，使用本发明所涉及的酶的应用成为可能。实施例下面，基于实施例，详细说明本发明。关于实验的操作顺序，只要无特殊说明，遵照 Sambrook 等的 Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、PCT-JP96-00348、Fujiwara 等的报告(1997、1998)。实施例I.来自龙胆的酰基转移酶cDNA在大肠杆菌中的表达和重组蛋白质的精制从来自龙胆的酰基转移酶cDNA的大肠杆菌表达用结构pGeAT102 (Fujiwara etal.，Plant J.，16，421，1998中记载)通过NcoI/HindHI切割，将包含酰基转移酶的编码区域和3'非翻译区域的片断亚克隆到大肠杆菌表达载体pQE60(QIAGEN公司)的NcoI/HindIII，得到大肠杆菌表达用结构pQE8。 将导入了 pQE8的大肠杆菌JM109株用SB培养基在37°C下培养至0D600nm=0. 8后，将培养温度下降至15°C再培养I小时，添加IPTG使IPTG最终浓度为O. 1M，诱导龙胆酰基转移酶基因的表达。将15°C、I小时培养、集菌后的菌体进行超声波破坏，用于下述精制。将破坏后的菌体加入DE52 (Whatman)，通过含有150mM NaCl的25mMTris_HCl (pH7. 5)，回收径直通过的组分。进而，通过硫酸铵盐析，回收40 60%硫酸铵饱和组分，溶解于少量的20mMTris-HCl (pH7. 5)中，采用经 20mM Tris-HCl (pH7. 5)平衡后的 S印hadexG-25 (Pharmacia 公司)，进行脱盐。将其负载于DEAE-T0Y0PEAL (T0S0H 公司)后，利用从 20mMTris-HCl (ρΗ7· 5)到含有O. 5Μ NaCl的20mM Tris-HCl (pH7. 5)的直线浓度梯度进行洗脱，在约120 240mM NaCl的洗脱组分中发现对花翠素-3，5-二葡萄糖苷(DEL 3G-5G)具有5位芳香族酰基转移酶活性。将活性组分对20mM Tris-HCl (pH7. 5)缓冲液透析后，负载于BlueSepharose (Pharmacia公司)。径直通过Blue Sepharose的组分没有活性,用含IM NaCl的20mM Tris-HCl (pH7. 5)对吸附的活性组分进行洗脱。然后，使该组分吸附于Phenyl Sepharose(Pharmacia公司),利用从含有40%饱和硫酸铵的20mM Tris-HCl (pH7. 5)到20mMTris_HCl (pH7. 5)的直线浓度梯度进行洗脱。活性组分被0%硫酸铵洗脱。将其对20mM Tris-HCl (pH7. 5)透析后，使其吸附于Dyematrix柱 Orange A(Amicon 公司)，用含 O. 3M NaCl 和 O. 5mM DTT 的 IOmMTris-HCl (ρΗ7· 5)洗脱。径直通过的组分没有活性，仅在吸附组分中发现活性，将其通过Centricon-10 (Amicon公司)浓缩。实施例2.重组酿基转移酶的活件测定以图I和图2中所示的3种花翠素衍生物、即花翠素-3，5，3'-三葡萄糖苷(DEL 3G-5G-3' G)、花翠素-3-葡萄糖基-5-咖啡酰葡萄糖基-3 '-葡萄糖苷(DEL3G-5CafG-3' G)和花翠素-3-葡萄糖基-5-葡萄糖基-3 '-咖啡酰葡萄糖苷(DEL3G-5G-3' CafG)为底物，用实施例I中得到的重组酶，测定该酶活性。总量50 μ I的反应液中，含有IOOmM磷酸钾缓冲液(pH8. 5),0. 2mM咖啡酰CoA、250mM上述各底物、酶液5 μ 1，在30°C下，反应15分钟。添加与反应液等量且含有O. 1%三氟乙酸(TFA)的90%乙腈水溶液，终止反应。
为了分析反应产物的经时变化，用稀释至25倍的酶液5 μ 1，以50 μ M、100 μ M或200μΜ的DEL 3G-5G-3' G为底物，在2. 5、5、10、20分钟后停止反应，对产物进行分析。关于反应产物的分析，通过使用了 DE-41柱(4. 6X250mm、Shodex公司)的反相高效液相色谱(HPLC)进行。关于样品的洗脱，用含有O. 5%TFA的20-50%直线浓度梯度的乙腈水溶液以O. 6ml/min洗脱15分钟，然后用50%的乙腈水溶液以O. 6ml/min洗脱10分钟，用Sro-MlOA (岛津制作所制造)在250-600nm的波长下检测。将已知样品的HPLC洗脱时间和吸收光谱与产物的洗脱时间和吸收光谱进行比较，进行产物结构的鉴定。上述3种化合物作为底物时的反应结果显示，重组酰基转移酶与任一底物均反应。以 250mM 的 DEL3G-5CafG-3 ' G 为底物时，94. 1% 转变为 DEL3G_5CafG_3 ' CafG。以 250mM 的 DEL3G-5G-3 ' CafG 为底物时，95. 2% 转变为 DEL3G_5CafG_3 ' CafG。以250mM的DEL3G-5G-3 ' G为底物时，7. 2%转变为仅5位与芳香族酰基结合的DEL3G-5CafG-3' G, 58. 7% 转变为 DEL3G_5CafG_3' CafG,只有痕量(1% 以下)转变为仅 3'位与芳香族酰基结合的DEL3G-5G-3' CafG。用稀释后的酶液，测定以DEL3G-5G-3' G为底物时反应经时变化，结果显示 伴随反应时间的延长，DEL3G-5CafG-3 ' G和DEL3G_5CafG_3 ' CafG的生成量增加。而DEL3G-5G-3' CafG的生成量与其他两种相比非常少，即使增加底物量、延长反应时间，也仅检测出极少量(图3、图4和图5)。该结果与用未稀释的酶液与DEL3G-5G-3' G反应时的
结果一致。以上结果表明使来自龙胆的酰基转移酶基因在大肠杆菌中表达而得到的重组蛋白质，具有使芳香族酰基转移到花色苷的5位和3'位两个位置糖上的活性。即，根据以往的报道(Fujiwara et al.，Plant J.，16，421，1998)，该酶仅使芳香族酰基特异性转移到花色苷的5位，但本发明表明，该酶可使芳香族酰基转移到3'位和5位两个位置的糖上。此夕卜，从以DEL 3G-5G-3' G为底物时的反应产物分析，可认为芳香族酰基先与5位葡萄糖结合再与3'位葡萄糖结合的可能性高。实施例3.来自龙胆的芳香族酰基转移酶的精制已证明使来自龙胆的芳香族酰基转移酶cDNA在大肠杆菌中表达而得到的酶，具有花色苷5位和3'位葡萄糖的芳香族酰基转移活性(实施例2)，但对于龙胆花瓣中存在的天然酶，为了确认单一酶具有5位芳香族酰基转移酶活性和3'位芳香族酰基转移酶活性，从龙胆花瓣进行该酶的精制。在一系列的精制中，与实施例2同样，对各柱色谱的洗脱组分分别测定以DEL 3G-5G为底物时5位酰基转移酶活性和以DEL 3G-5G-3' G为底物时5位、3'位酰基转移酶活性。根据对龙胆5位芳香族酰基转移酶进行了精制的Fujiwara等的报告(Fujiwaraet al.，Eur. J. Biochem. 249，45，1997)，从约IOOg龙胆花瓣的破碎提取物中得到40-70%饱和硫酸铵的盐析组分。将其通过经含有10 μ M对氨基苯甲基磺酰氟(APMSF)、lmM DTT的20mMTris-HCl (pH 7. O)(以下记为 Tris 缓冲液)平衡后的 SephadexG-25 (Pharmacia 公司)脱盐，然后负载于经Tr i s缓冲液平衡后的MONO Q (Pharmacia公司)。用Tris缓冲液将未吸附组分洗净后，以流速5ml/min使含有O O. 5M NaCl的Tris缓冲液流过，对吸附组分进行20min洗脱。芳香族酰基转移活性存在于被O. 2 O. 42M NaCl洗脱的组分中。将其负载于HiTrap Blue (Pharmacia公司)，用Tris缓冲液充分洗净后，用含O.9M NaCl的Tris缓冲液洗脱吸附组分。吸附组分具有活性。然后，将活性组分负载于DEAE-Sepharose(Pharmacia公司)。用Tris缓冲液充分洗净后，以O. 5ml/min使含有O
O.5M NaCl的Tris缓冲液流过，对吸附组分进行60min洗脱。在被含有O. 22 O. 3mM NaCl的Tris缓冲液洗脱的组分中发现了活性。然后,将活性组分用Centricon 30 (Amicon公司)浓缩后，负载于Dyematrix柱Red (Amicon公司)。用Tris缓冲液将未吸附组分洗净后，用含I. 5M KCl的Tris缓冲液将吸附的组分洗脱。利用SDS-PAGE对其进行解析，结果显示在酰基转移酶的推定分子量52kDa附近，仅检测出单一条带。在一系列的精制中，对各柱色谱的洗脱组分，测定以DEL 3G-5G为底物时5位酰基转移酶活性和以DEL 3G-5G-3' G为底物时5位、3'位酰基转移酶活性，结果显示，两活性的活性最强的组分完全一致。用Dyematrix柱Red上吸附的活性组分，与实施例2同样，测定对 3 种底物、即 DEL 3G-5G-3' G, DEL 3G-5CafG-3/ G 和 DEL 3G-5G-3' CafG 的活性，结果显示与任一底物均反应，呈现与实施例2同样的反应特性。将Dyematrix柱Red上吸附的活性组分通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，基 于公知的方法(Towbin et al. Proc. Natl. Acad. Sci, 76, 4350, 1979),将分离后的蛋白质转印到硝酸纤维素膜Hybond-ECL (Amersham公司)后，用龙胆的花色苷5位酰基转移酶的特异性抗体(Fujiwara et al. , Eur. J. Biochem. 249, 45, 1997),通过 Western 法检测，结果观察到一条明显的条带(图6)。以上结果表明，龙胆花瓣中存在的花色苷3'位芳香族酰基转移活性和花色苷5位芳香族酰基转移活性均来自单一的蛋白质。实施例4.通过龙胆的酿基转移酶的花色苷的稳定化、蓝化已有关于 DEL 3G-5G-3 ' G、DEL 3G-5CafG-3 ; G、DEL 3G-5G-3 ' CafG、DEL3G-5CafG-3' CafG的相对稳定性的报道。即，在pH6. 5的水溶液中，DEL 3G-5CafG-3' CafG最稳定且难退色，其次，稳定顺序依次为DEL 3G-5G-3 ' CafG、DEL 3G-5CafG-3 ' G、DEL3G-5G-3 ' G (Yoshida et al. , Phytochemistry 54,85,2000)。另外，关于最大吸收，DEL3G-5CafG-3 ' CafG 波长最长，其次为 DEL 3G-5G-3 ' CafG、DEL3G_5CafG_3 ' G、DEL3G-5G-3' G0 即，看上去最蓝的是 DEL3G-5CafG-3' CafG，其次是 DEL 3G-5G-3 ' CafG(Yoshida et al. , Phytochemistry 54,85,2000)。为了推测将来自龙胆的花色苷5，3'位芳香族酰基转移酶基因导入月季、月季花瓣中产生DEL 3G-5CafG-3^ CafG时的花色，对月季(品种Medeo)花瓣的榨汁液中的精制色素的发色进行分析。作为精制色素，使用DEL 3G-5CafG-3' CafG以及作为比较对照的DEL36-56、花青素-3，5-二葡萄糖苷(0￥4 3G-5G)、花葵素-3，5-二葡萄糖苷(PEL3G-5G)、二甲花翠素-3，5-二葡萄糖苷(MAL 3G-5G)。将_80°C下冷冻I小时以上的Medeo花瓣约20g用家庭用大蒜榨汁机榨汁，以IOOOrpm离心lmin，除去花瓣残渣，得到上清液，作为榨汁液。向榨汁液Iml中添加上述精制色素的50mM DMSO溶液20 μ 1，静置10分钟后，用分光测色计UV-2500PC (岛津制作所制造)测定380-780nm的吸收光谱和透过光谱。将透过光谱换算成CIE ΙΛΛ/表色系(JISZ8729)。关于英国皇家园艺学会色谱标准(RHSCC)编号，基于上述仪器测定所得色彩值(CIE IZaVi表色系)，用色彩分类系统Version〗. I. I (株式会社日本综合研究所、日本；日本特开2002-016935)，进行近似色的核对。使用该系统，能客观地选择近似的RHSCC编号。榨汁液中添加的色素的最终浓度，与月季花瓣液泡中的平均花色苷浓度近似。但是，由于3G-5CafG-3' CafG的吸光度过高，所以4倍稀释后测定。另外，Medeo是具有月季园艺品种的平均花瓣pH值(pH4. 38)的品种。如图7所示，上述5种精制色素中，DEL3G-5CafG-3' CafG在月季花瓣榨汁液中显示出最大的最大吸收光谱。基于由透过光谱换算的LiW值，用RHSCC(英国皇家园艺学会色谱标准)求近似色，为89A，如图7所示，在5种精制色素中，颜色最蓝。从该结果可知，例如在月季花瓣中使花色苷_5，3'位芳香族酰基转移酶基因与F3, 5’H基因(W02004/020637)以及:V位糖转移酶基因(W001/92509)—起表达，可在月季花瓣中产生DEL3G-5CafG-3' CafG，从而可以培育出呈现蓝色的月季花。同样，也可以在康乃馨、菊花、矮牵牛花、美人樱、银杯草、百合等中培育出蓝色花的品种。实施例5.从龙胆近缘种分离花色苷5，3'位芳香族酰基转移酶同源物 龙胆属(Gentiana)中，除了龙胆，还存在蛾眉山龙胆、屋久岛龙胆等各种近缘种。尝试通过PCR从这些龙胆近缘种中获得5，3'位芳香族酰基转移酶同源物。已知来自龙胆的5，3'位芳香族酰基转移酶基因不含内含子，因此，以从近缘种的叶子提取的基因组DNA为模板，用5，3'位芳香族酰基转移酶基因的特异性引物进行PCR。关于基因组DNA的提取，用QIAGEN公司的DNeasy，按照制造厂家推荐的方法进行。5，3,位芳香族酰基转移酶基因的特异性引物GAT4-Met-F和GAT4-B具有如下序列，将其作为引物，进行PCR，使包含整个编码区域的全长cDNA得到扩增。PCR的反应条件如下所示。引物的序列GAT4-Met-F TCA TTA TGG AGC AAA TCC AAA (序列号1)GAT4-B CAT GTC AGG TGT GAG GTT CAA C (序列号2)PCR 条件变性反应 94°C 5分、I循环扩增反应 94°C I分、55°C I分30秒、72°C 3分、30循环延伸反应 72°C 7分、I循环通过上述PCR,在屋久岛龙胆、Ochroleuca、Wutariensis这3种中，所期待的I. 5kb左右的条带得到扩增。将其回收，克隆到pCRII-TOPO (Invitrogen)，确定碱基序列。从各种中得到的扩增片段的核苷酸序列以及对应的氨基酸序列见序列表。屋久岛龙胆序列号3和4Ochroleuca 和 Wutariensis 序列号5 和 6从Ochroleuca和Wutariensis得到的片段编码同一氨基酸序列。关于与最先从龙胆得到的5,3'位芳香族酰基转移酶的同一'丨生，来自屋久岛龙胆的为95%,来自Ochroleuca的和来自Wutariensis的分别为90%。从上述较高的同一性可认为它们是花色苷5，3 ^位芳香族酰基转移酶的同源物。实施例6.龙胆的花色苷5,3'位芳香族酿基转移酶在银杯草中的表汰将龙胆的5，3'位芳香族酰基转移酶基因与同样来自龙胆的3'位糖转移酶基因、来自三色堇的F 3' 5’H基因一起导入银杯草。由此得到的转化体中，首先，通过龙胆:V位糖转移酶的作用，DEL 3G-5G的:T位发生糖苷化，生成DEL 3G-5G-3 ; G，通过龙胆花色苷5，3'位芳香族酰基转移酶对DEL 3G-5G-3' G的作用，可期待生成最终产物Gentiodelphin (DEL 3G-5CafG-3; CafG)。
表达用结构pSPB1536通过在植物表达用双元载体(van EngelenFA et al. (1995)Transgenic Res4:288-290)的HindIII和EcoRI位点导入3'位糖转移酶表达盒、在PacI位点导入来自三色堇的F3' 5’H的表达盒、在AscI位点导入5，3'位芳香族酰基转移酶的表达盒来制备。任一表达盒均受来自花椰菜花叶病毒的35S启动子控制，各自的结构基因的下游具有来自农杆菌的胭脂碱合成酶基因的终止子序列。关于向银杯草中的基因导入，按田中等的报告(Tanaka et al. (2005)Plant Cell Tiss. Org. Cult. 80:1-24)所述的方法进行。通过RT-PCR确认在得到的银杯草转化体中3种导入基因(龙胆的5，3'位芳香族酰基转移酶基因、龙胆的3'位糖转移酶基因、三色堇的F3' 5’H基因)的表达。对已确认这3种基因的转录产物的系统,根据水谷等的报告(Fukuchi-Mizutani et al. (2003) PlantPhysioll32:1652-1663)中所述的方法，进行花瓣的色素分析，但任一系统中均未检测出所期待的最终产物Gentiodelphin。另一方面，按照藤原等的报告(Fujiwaraet al. (1997) Eur JBiochem249:45-51)中所述的方法，从3种导入基因的转录产物已确认的转化体的花瓣中提取粗酶液。将其作 为酶液使用，与实施例2同样，以DEL3G-5G-3' G为底物，测定体外的5，3'位芳香族酰基转移酶活性，确认了 Gentiodelphin的生成。另一方面，当使用作为对照的来自非重组银杯草的粗酶时，未检测出Gentiodelphin。该结果表明，重组银杯草具有5, 3'位芳香族酰基转移酶的活性，即具有使芳香族酰基转移到底物DEL3G-5G-3' G的5位和3'位上的活性。但是，使用同一银杯草转化体的粗酶液，按照水谷等的报告(Fukuchi-Mizutaniet al. (2003)Plant Physiol 132:1652-1663)中所述的方法，测定体外的Y位糖转移酶的活性，并未检测出3'位糖转移酶活性。以上的结果证实在银杯草转化体的细胞内，存在具有5，3,位芳香族酰基转移酶活性的蛋白质。然而未在转化体的花瓣中检测出所期待的Gentiodelphin,其原因可认为是在银杯草的细胞内，本应在5,3'位芳香族酰基转移酶发挥作用的前一阶段发挥作用的3'位糖转移酶的蛋白质未被合成，或即使合成也没有发挥作用。综上所述，本发明表明，使来自龙胆的芳香族酰基转移酶基因在大肠杆菌中表达而得到的重组芳香族酰基转移酶，不仅具有使芳香族酰基转移到花翠苷5位糖上的活性，同时还具有使芳香族酰基转移到3,位糖上的活性。此外，从龙胆花瓣精制的天然花色苷5位芳香族酰基转移酶也同时具有使芳香族酰基转移到3'位糖上的活性，即，与迄今已知的花色苷芳香族酰基转移酶不同，单一酶使芳香族酰基转移到花色苷5位和3'位两个位置的糖上。另外，使该基因在异种植物中表达，可获得5，3,位芳香族酰基转移酶活性。—般认为，与5位的芳香族酰基相比，3'位的芳香族酰基更有助于花色苷的稳定化和蓝化，更理想的情况为，具有包括3'位在内的多个位置的糖-酰基侧链。因此，如本发明所述，利用使芳香族酰基转移到5位和3'位两个位置的5位，3'位芳香族酰基转移酶，进行花色苷糖苷5位和3,位的芳香族酰化，从而可以制备更稳定更蓝的花色苷。此外，使编码该酶的基因与其他必要的花色苷合成系统或花色苷修饰基因一起在植物体中表达，可以使以花色苷为主的花色更稳定、更蓝。本发明包括如下内容I.花色苷3,位的酰化方法，其利用使芳香族酰基转移到花色苷3,位糖上的酶或编码该酶的基因。2.花色苷的稳定化方法，其利用使芳香族酰基转移到花色苷3,位糖上的酶或编码该酶的基因。3.花色苷的蓝化方法，其利用使芳香族酰基转移到花色苷3,位糖上的酶或编码该酶的基因。4.目标色素的酰化方法，其使编码花色苷3'位芳香族酰基转移酶的基因在植物中表达，在该植物体内将目标色素酰化。5.目标色素的稳定化方法，其将编码花色苷3'位芳香族酰基转移酶的基因导入植物，在该植物体内目标色素酰化，从而使该色素稳定化。6.目标色素的蓝化方法，其将编码花色苷3'位芳香族酰基转移酶的基因导入植物，在该植物体内目标色素酰化，从而使该色素蓝化。7.通过项目4 6任一项所述的方法得到的植物体、该植物体的营养繁殖体或种子、或与该植物体具有同一性质的该植物体后代的植物体、该植物体的营养繁殖体或种子。8.在花色苷的多个位置的糖上结合芳香族酰基的方法，其特征在于，利用具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的单一酶或编码该酶的基因。9.花色苷的稳定化方法，其特征在于，利用具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的单一酶或编码该酶的基因。10.花色苷的蓝化方法，其特征在于，利用具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的单一酶或编码该酶的基因。11.根据项目8 10任一项所述的方法，其中，所述多个位置之一是花色苷的3'位的糖。12.目标色素的酰化方法，其使具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的单一酶或编码该酶的基因在植物中表达，在该植物体内将目标色素酰化。13.目标色素的稳定化方法，其将具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的单一酶或编码该酶的基因导入植物，在该植物体内目标色素酰化，从而使该色素
稳定化。14.目标色素的蓝化方法，其将具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的单一酶或编码该酶的基因导入植物，在该植物体内目标色素酰化，从而使该色素蓝化。15.根据项目12 14任一项所述的方法，其中，所述多个位置之一是花色苷的 位的糖。16.通过项目12 15任一项所述的方法得到的植物体、该植物体的营养繁殖体或种子、或与该植物体具有同一性质的该植物体后代的植物体、该植物体的营养繁殖体或种 子。17.基因，其是编码具有序列号4或6所述氨基酸序列且具有使芳香族酰基转移到花色苷3'位糖上的活性的蛋白质的基因、或是编码与该氨基酸序列有70%以上的序列同一性且具有使芳香族酰基转移到花色苷3,位糖上的活性的蛋白质的基因、或是与序列号3或5所述核苷酸序列有70%以上同一性且编码具有使芳香族酰基转移到花色苷3'位糖上的活性的蛋白质的基因。
18.基因，其是编码具有序列号4或6所述氨基酸序列且具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的蛋白质的基因、或是编码与该氨基酸序列有70%以上的序列同一性且具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的蛋白质的基因、或是与序列号3或5所述核苷酸序列有70%以上同一性且编码具有使芳香族酰基转移到花色苷多个位置糖上的活性的蛋白质的基因。19.根据项目18所述的基因，其中，所述多个位置之一是花色苷的3'位的糖。20.载体，其包含项目17 19任一项所述的基因。21.宿主，其是由项目20所述的载体转化的宿主。22.蛋白质，其是由项目17 19任一项所述的基因所编码的蛋白质。23.蛋白质的制造方法，其特征在于，培养项目21所述的宿主或使其生长发育，然 后从该宿主获取具有将糖转移到类黄酮3'位上的活性的蛋白质。24.导入了项目17 19任一项所述的基因的植物或与其具有相同性质的该植物的后代或它们的组织。25.项目24所述植物的切花或与其具有相同性质的该植物后代的切花。26.花色苷Y位的酰化方法，其特征在于，利用项目17 19任一项所述的基因。27.花色苷的稳定化方法，其特征在于，利用项目17 19任一项所述的基因。28.花色苷的蓝化方法，其特征在于，利用项目17 19任一项所述的基因。29.目标色素的酰化方法，其使项目17 19任一项所述的基因在植物中表达，在该植物体内将目标色素酰化。30.目标色素的稳定化方法，其将项目17 19任一项所述的基因导入植物，在该植物体内目标色素酰化，从而使该色素稳定化。31.目标色素的蓝化方法，其将项目17 19任一项所述的基因导入植物，在该植物体内目标色素酰化，从而使该色素蓝化。32.在花色苷的多个位置的糖上结合芳香族酰基的方法，其特征在于，利用项目17 19任一项所述的基因。33.根据项目32所述的方法，其中，所述多个位置之一是花色苷的3'位的糖。
权利要求
1.在花色苷的3,位和5位的糖上加入芳香族酰基的方法，该方法包括 使用编码包含示于SEQ ID NO :4或6的氨基酸序列的、且具有使芳香族酰基转移到花色苷的3'位和5位的糖上的活性的蛋白质的基因，或编码包含具有与示于SEQ ID N0:4或6的氨基酸序列90%以上的序列一致性、且具有使芳香族酰基转移到花色苷的3'位和5位的糖上的活性蛋白质的基因。
全文摘要
本发明涉及花色苷3′位的酰化方法，其利用使芳香族酰基转移到花色苷3′位糖上的酶或编码该酶的基因。
文档编号C12P19/60GK102864195SQ20121030251
公开日2013年1月9日 申请日期2005年10月28日 优先权日2004年10月29日
发明者田中良和, 胜元幸久, 水谷正子, 福井祐子, 户上纯一 申请人:三得利控股株式会社