专利名称：微生物发酵合成γ-氨基丁酸的方法及发酵培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物发酵方法，尤其涉及一种微生物发酵合成Y-氨基丁酸的方法及发酵培养基。
背景技术：
Y -氨基丁酸(Y-aminobutyric acid,简称GABA)是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中广泛分布的最重要的抑制性神经递质，约50%的中枢突触部位以GABA为递质，在大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑起重要作用，并对机体的多种功能具有调节作用，所以GABA是一种很好的医疗药物及保健品的原料。随着研究深入，GABA的生理功能不断得到阐明，已发展成为一种新型功能性因子，正逐渐被广泛用于医药、食品保健、化工及农业等行业。
乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌，能够将碳水化合物发酵生成乳酸，有帮助消化、有助于人体肠道的健康等功能，因此常被视为健康食品。科学家长期研究的结果证明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，它们数量的多和少，直接影响到人的健康与寿命。因此，利用乳酸菌生产的GABA能达到食品安全级， 并可进一步丰富乳酸菌作为益生菌的保健功效，具有广阔应用范围和市场前景 。
小米是我国北方主要小杂粮之一，具有“百谷之首”的美誉。小米糠是小米加工过程的副产品，占小米质量的6% 8%。按照我国小米年产量500万t计算，每年加工小米将广生小米糖40万t左右。研究表明，小米糖中含有丰富的蛋白质、脂肪、多糖、维生素、矿物质等营养素和生育酚、亚油酸、Y-谷维醇、植物留醇、神经酰胺等生理活性物质。因此， 小米糠在国外被誉为“天赐营养源”。在我国，小米糠绝大多数被用作低附加值的禽兽饲料或作为食物资源加以利用仅局限于提取米糠油和米糠蛋白，利用率颇低，未将其所具有的营养价值和资源效益充分发挥，浪费了这一大自然资源。联合国工业发展组织称其为“一种未充分利用的工业原料”。目前，随着研究的深入，有以小米糠为原料添加生化成分进行食药用真菌培养的报道，但用小米糠为培养基通过微生物发酵合成GABA的研究未见有报道。 该培养基具有配方简单、原料价格低廉，纯天然、无污染等优点。
目前在稻米糠研究上较为深入，国内外在稻米糠的综合开发利用上已取得一些成果和专利。如中国发明专利(申请号201010145627. 8申请日2010-04_02)公开了一种发酵生产Y-氨基丁酸的方法，其包括步骤将米糠、谷氨酸及奶粉按比例混合，其余以水补足，以制作培养基；然后，将乳酸菌液接种至冷却后的培养基，并于均匀混合后，在 30-42°C下发酵4小时以上。由此方法及其培养基所得到的发酵物的Y-氨基丁酸含量远高于米糠原料，可以直接作为食品添加物。该专利所用的菌种是商业型制作酸奶的代号为 YC-380乳酸菌粉，由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌按比例混合调配而成。
小米糠和稻米糠均为农产品加工过程的副产品，但据研究，在主要营养成分上存在较大的差异，如表I所有示，粗蛋白质含量小米糠为12. 3%、稻米糠为6. 8%,粗脂肪含量小米糠为12. 4%、稻米糠为7. 9%，中性洗涤纤维含量小米糠为54. 0%、稻米糠为22. 9%等等。
表I小米糠与稻米糠主要营养成分的比较(％)营养成分有机物粗蛋白质粗纤维粗脂肪无氮浸出物粗灰分中性洗涤纤维酸性洗涤纤维小米糠92. 612. 327. 812.440. 47. I54. O36.4稻米糠86. 36. 832. 47. 939. 23. 722. 913.4目前，随着研究的深入，有以小米糠为原料添加生化成分进行食药用真菌培养的报道， 但用小米糠为培养基通过微生物发酵合成GABA的研究未见有报道。该培养基具有配方简单、原料价格低廉，纯天然、无污染等优点。
常规利用乳酸菌发酵生产GABA使用的是MRS发酵培养基，其配方为酪蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、磷酸氢二钾、柠檬酸二胺、吐温-80、硫酸镁、硫酸锰及谷氨酸 (或其钠盐)。相对于本发明用的小米糠培养基，一方面，MRS成分复杂，导致下游GABA分·离纯化操作复杂；另一方面，MRS的原料价格较高，从而降低了工业生产的经济可行性和竞争性。如申请人申请的中国发明专利(申请号200910102279. 3申请日:2009-09_10)公开了高产Y-氨基丁酸的短乳杆菌L2菌株用于Y-氨基丁酸制备的方法，短乳杆菌L2菌株藏编号为CCTCC NO :M209132，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2009年6月25日包括以下的步骤①挑取适量菌种接入液体MRS 中，30°C活化培养12 18 h ;②在TYG培养液中，取培养后的种子培养液，按O. 3 O. 8 % 的接种量接种后，30°C静置培养18 30h作发酵种子！③在质量分数为O. 5 2. 0%谷氨酸钠的TYG液体培养基中，取培养18 30h的种子培养液，按2 4%接种量接种，30°C静置培养45 50 h，可得高GABA含量的乳酸菌培养液。如果将小米糠这一农副产品进一步开发利用，作为培养微生物培养基，大大降低了它的成本，具有很重要的现实意义。发明内容
针对现有技术中天然食品GABA含量较低、不安全；而培养基成分存在高盐分、高成本等问题。本发明的一个目的在于提供一种微生物发酵合成Y-氨基丁酸的方法，该方法生物合成GABA操作简便、产量高、易于分离纯化，无污染、产品达到食品安全级。本发明的另外一个目的是提供一种微生物发酵合成Y -氨基丁酸的培养基，该培养基的配制简单、原料价格低廉，纯天然。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案一种微生物发酵合成Y -氨基丁酸的方法，该方法采用的微生物为短乳杆菌 {LactobacillusL2菌株,该菌株同中国发明专利(申请号200910102279. 3申请日2009-09-10)所述的短乳杆菌L2菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为 中国武汉武汉大学，保藏编号为=CCTCC NO M 209132，该短乳杆菌L2菌株经MRS培养平板活化后，取菌种转接到GYP种子培养基中，培养用作发酵种子，再以f 5%体积百分比的接种量接种于培养基中，所述的培养基包括小米糠10 g/L 100 g/L，L-谷氨酸钠3(T80g/L， 调节培养基初始PH为3. 0(Γ5. 00，2(T45°C静止培养50h 80 h，即得高含Y -氨基丁酸的乳酸菌发酵液。
作为优选，所述的L-谷氨酸钠为4(T70g/L。最优选为L-谷氨酸钠为50g/L。
作为优选，所述的调节pH为3. 50 4· 50。
作为优选，所述的静止培养的温度为25 40°C。
作为优选，所述的静止培养的时间为66 h 72 h。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案微生物发酵合成Y-氨基丁酸的培养基，该培养基由小米糠10 g/L 100 g/L, L-谷氨酸钠3(T80g/L，加入蒸馏水混合后，调节pH 3. 0(Γ5. 00，灭菌制得。
作为优选，所述的L-谷氨酸钠为4(T70g/L。最优选为L-谷氨酸钠为50g/L。
作为优选，所述的调节pH为3. 50 4· 50。
本发明由于采用了上述的技术方案，所述的培养基的配制简单、原料价格低廉，纯天然；生物合成GABA操作简便、产量高、易于分离纯化，无污染、产品达到食品安全级。本发明使用小米糠培养乳酸菌，旨在高产高效生产食药用级的GABA或直接作为功能食品添加物，为工业化大规模生产提供可行性，也为微生物发酵生产GABA提供了新的方法，与常规的培养基相比具有更广泛的应用前景。
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图检测图。
图.-MSG底物浓度对短乳杆菌L2菌株GABA合成的影响。图8短乳杆菌L2菌株小米糠发酵液中纯化的GABA透明针状结晶。
具体实施方式
下面结合附图对本发明具体实施方式
做一个详细的说明。
I 菌株短乳杆菌)L2菌株。该菌株由本实验室前期从酸菜中筛选,具有高产Y-氨基丁酸的特点，在TYG液体培养基中发酵48 h GABA产量可达5 g/L 12 g/ L，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO M 209132。
2培养基琼脂试管斜面培养基酵母膏10 g,葡萄糖15 g,碳酸韩15 g,琼脂15 g,蒸懼水1000 mL。用于L2菌株的保藏。
TYG液体培养基胰蛋白胨O. 5 %，酵母膏O. 5 %，葡萄糖I. O %，丁二酸钠O. 5 %， PH6. 5。用于L2菌株前期菌种筛选。
MRS平板培养基葡萄糖10 g,酵母膏10 g,蛋白胨5 g,乙酸钠2 g,硫酸镁20 mg, 硫酸猛I mg,氯化钠I mg,硫酸亚铁I mg,琼脂20 g,蒸懼水1000 mL,pH6. 50。用于L2菌株菌种活化。
GYP种子培养基胰蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,酵母膏5 g, 丁二酸钠5 g,蒸懼水 1000 mL, pH 6. 50。用于L2菌株种子的制备。5
不同浓度的小米糠培养基小米糠10 g/L 80 g/L，L-谷氨酸钠(L-MSG) 50g/L, 蒸馏水1000 mL, pH4. 00。用于L2菌株发酵合成GABA。
3操作条件的确定3. I小米糠发酵参数的确定 3. I. I发酵培养基成分的确定探讨了以小米糠和稻米糠为主要成分的培养基配方对短乳杆菌L2菌株GABA合成的影响。分别向小米糠培养基(小米糠50 g/L, L-MSG 20 g/L，蒸馏水1000 mL)和稻米糠培养基(稻米糠50 g/L, L-MSG 20 g/L，蒸馏水1000 mL)中加入10 g/L的脱脂奶粉进行对比试验。然后将初始PH调成4. 00，按3% (v/v)接入的培养24 h种子液，30°C静止培养24 h， 用高效液相色谱测定发酵液中GABA的含量。结果显示试验所采用的8种培养基配方，其中的有4种较适用于L2菌株GABA的合成，而又以培养基6 (小米糠+ L-MSG)为最适宜GABA 合成配方(附图I)。表明小米糠和稻米糠对短乳杆菌L2菌株GABA合成的影响不同，并且在小米糠中加入脱脂奶粉对L2菌株合成GABA几乎没有影响。
3. I. 2适宜初始pH的确定选取最适宜GABA合成小米糠培养基配方(小米糠50 g/L，L-MSG 20g/L，蒸馏水1000 mL)用IN的碳酸氢钠和IN的柠檬酸溶液调成不同的培养基初始pH，分别为3. 00,3. 60、 4. 00,4. 40,4. 60,4. 80,5. 00,5. 20,5. 40,5. 60,5. 80,6. 00 和 6. 20，然后按 3% (v/v)接入的培养24 h种子液，30°C静止培养24 h，用高效液相色谱测定发酵液中GABA的含量。结果表明L2菌株用小米糠培养基生产GABA适宜初始pH为pH4. 00 (附图2)。
3. I. 3适宜培养温度的确定将小米糠培养基(小米糠50 g/L, L-MSG 20 g/L，蒸馏水1000 mL)初始pH调成4. 00， 然后按 3% (v/v)接入的培养 24 h 种子液，分别在 4。。、10。。、20。。、30。。、40。。、50。。、60 V、 70°C八个温度下静置培养24 h，用高效液相色谱测定发酵液中GABA的含量。结果表明L2 菌株发酵生产GABA的温度以30°C为宜(附图3)。
3. I. 4适宜发酵时间的确定将上述小米糠培养基(小米糠50 g/L，L-MSG 50 g/L，蒸馏水1000 mL)初始pH调成4.00，然后按3% (v/v)接入的培养24 h种子液，30°C静止培养108 h，每6 h取样测定发酵液PH变化和GABA的含量。结果显示随着发酵时间的延长，发酵液pH在(Γ12 h略有下降，但随着GABA的逐步合成，pH逐步上升。在发酵72 h时，发酵液的对应pH和GABA的含量分别是6. 41和28. 247 g/L，当高于pH 6. 20时，已不适合GABA的合成(附图4)。本着经济效益最大化的原则，最佳发酵时间确定为66 h^72 ho
3. I. 5适宜底物浓度的确定将不同L-MSG浓度的小米糠培养基(小米糠50 g/L, L-MSG分别为20 g/L,30 g/L,40 g/L、50 g/L、60 g/L，蒸馏水1000 mL)初始pH调成4. 00，然后按3% (v/v)接入的培养24 h种子液，30°C静止培养72 h，用高效液相色谱测定不同L-MSG浓度发酵液中GABA的含量。 结果表明L2菌株发酵生产GABA适宜底物L-MSG浓度为50 g/L (附图5)。
4具体操作和实施方法短乳杆菌L2菌株经MRS培养平板活化24 h后，取一环菌种转接到GYP种子培养基中， 培养24 h作发酵种子；以3% (v/v)的接种量接种到小米糠发酵培养基(小米糠添加量10g/L 80 g/L, L-MSG 50g/L，初始 pH 4. 00，蒸馏水 1000 mL)中，30°C静止培养约 66 h 72 h，即可得高GABA含量的乳酸菌发酵液，发酵液经高效液相色谱分析GABA的产量可达12 g/ L 32 g/L (附图6，附图7)，经分离纯化洗脱、浓缩与结晶等步骤可得GABA透明针状结晶 (附图8)。
实施例I短乳杆菌L2菌株经MRS培养平板活化24 h后，取一环菌种转接到GYP种子培养基中， 培养24 h作发酵种子，以3% (v/v)的接种量接种于含10 g/L小米糠发酵培养基中，30°C 静止培养约66 h 72 h，经高效液相色谱分析可得GABA含量为12. 247 g/L的乳酸菌发酵液。
实施例2短乳杆菌L2菌株经MRS培养平板活化24 h后，取一环菌种转接到GYP种子培养基中， 培养24 h作发酵种子，以3% (v/v)的接种量接种到含20 g/L小米糠发酵培养基中，30°C 静止培养约66 h 72 h，经高效液相色谱分析可得GABA含量为19. 134 g/L的乳酸菌发酵液。
实施例3短乳杆菌L2菌株经MRS培养平板活化24 h后，取一环菌种转接到GYP种子培养基中， 培养24 h作发酵种子，以3 % (v/v)的接种量接种于含30 g/L小米糠发酵培养基中，30°C 静止培养约66 h 72 h，经高效液相色谱分析可得GABA含量为23. 78 g/L的乳酸菌发酵液。
实施例4短乳杆菌L2菌株经MRS培养平板活化24h后，取一环菌种转接到GYP种子培养基中， 培养24 h作发酵种子，以3% (v/v)的接种量接种于含40 g/L小米糠发酵培养基中，30 V 静止培养约66 h 72 h，经高效液相色谱分析可得GABA含量为27. 398 g/L的乳酸菌发酵液。
实施例5短乳杆菌L2菌株经MRS培养平板活化24 h后，取一环菌种转接到GYP种子培养基中， 培养24 h作发酵种子，以3 %(v/v)的接种量接种于含50 g/L小米糠发酵培养基中，30 V 静止培养约66 h 72 h，经高效液相色谱分析可得GABA含量为28. 247 g/L的乳酸菌发酵液。
实施例6短乳杆菌L2菌株经MRS培养平板活化24 h后，取一环菌种转接到GYP种子培养基中， 培养24 h作发酵种子，以3% (v/v)的接种量接种于含60 g/L小米糠发酵培养基中，30°C 静止培养约66 h 72 h，经高效液相色谱分析可得GABA含量为29. 904 g/L的乳酸菌发酵液。
实施例7短乳杆菌L2菌株经MRS培养平板活化24 h后，取一环菌种转接到GYP种子培养基中， 培养24 h作发酵种子，以3 % (v/v)的接种量接种于含70 g/L小米糠发酵培养基中，30°C 静止培养约66 h 72 h，经高效液相色谱分析可得GABA含量为32. 037 g/L的乳酸菌发酵液(附图7)。
实施例8短乳杆菌L2菌株经MRS培养平板活化24 h后，取一环菌种转接到GYP种子培养基中， 培养24 h作发酵种子，以3 % (v/v)的接种量接种于含80 g/L小米糠发酵培养基中，30°C 静止培养约66 h 72 h，经高效液相色谱分析可得GABA含量为29. 647 g/L的乳酸菌发酵液。
权利要求
1.一种微生物发酵合成Y-氨基丁酸的方法，该方法采用的微生物为短乳杆菌iLactobacillusbrevis') L2菌株,该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO :M209132，其特征在于短乳杆菌L2菌株经MRS培养平板活化后，取菌种转接到GYP种子培养基中培养用作发酵种子，再以f 5%体积百分比的接种量接种于培养基中，所述的培养基包括小米糠10g/L 100g/L，L-谷氨酸钠3(T80g/L,调节培养基初始pH为3. 00 5. 00，2(T45°C静止培养50h 80h，即得高含Y -氨基丁酸的乳酸菌发酵液。
2.根据权利要求I所述的一种微生物发酵合成Y-氨基丁酸的方法，其特征在于L-谷氨酸钠为4(T70g/L。
3.根据权利要求2所述的一种微生物发酵合成Y-氨基丁酸的方法，其特征在于L-谷氨酸钠为50g/L。
4.根据权利要求I所述的一种微生物发酵合成Y-氨基丁酸的方法，其特征在于调节 pH 为 3. 50 4· 50。
5.根据权利要求I所述的一种微生物发酵合成Y-氨基丁酸的方法，其特征在于静止培养的温度为25 40°C。
6.根据权利要求I所述的一种微生物发酵合成Y-氨基丁酸的方法，其特征在于静止培养的时间为66h 72h。
7.微生物发酵合成Y-氨基丁酸的培养基，其特征在于该培养基由小米糠10g/L 100g/L，L-谷氨酸钠3(T80g/L，加入蒸馏水混合后，调节pH3. 00^5. 00，灭菌制得。
8.根据权利要求7所述的微生物发酵合成Y-氨基丁酸的培养基，其特征在于L-谷氨酸钠为40 70g/L。
9.根据权利要求8所述的微生物发酵合成Y-氨基丁酸的培养基，其特征在于L-谷氨酸钠为50g/L。
10.根据权利要求7所述的微生物发酵合成Y-氨基丁酸的培养基，其特征在于调节ρΗ3· 50 4· 50。
全文摘要
本发明涉及一种微生物发酵方法，尤其涉及一种微生物发酵合成γ-氨基丁酸的方法及发酵培养基。一种微生物发酵合成γ-氨基丁酸的方法，该方法采用的微生物为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)L2菌株，该短乳杆菌L2菌株经MRS培养平板活化后，取菌种转接到GYP种子培养基中，培养用作发酵种子，再以1~5%体积百分比的接种量接种于培养基中，所述的培养基包括小米糠10g/L～100g/L，L-谷氨酸钠30~80g/L，调节培养基初始pH为3.00~5.00，20~45℃静止培养50h～80h，即得高含γ-氨基丁酸的乳酸菌发酵液。本发明所述的培养基的配制简单、原料价格低廉，纯天然；生物合成GABA操作简便、产量高、易于分离纯化，无污染、产品达到食品安全级。
文档编号C12P13/00GK102925504SQ20121030237
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者蒋冬花, 高爱同 申请人:浙江师范大学